Name: Quantificando os fenótipos oculares de Drosophila melanogaster : uma abordagem computacional integrando ilastik e Flynotyper (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Aprenda a quantificar fenótipos oculares de Drosophila melanogaster usando ilastik e Flynotyper. Este método computacional reduz vieses da avaliação manual e melhora a precisão na análise de mutações em modelos de doenças neurodegenerativas como ALS e FTD.

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<meta charset="utf8"></head><body>Quantificação imparcial de omatídeos em modelos oculares de Drosophila

<ol><li>Iyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+eye+phenotypes+for+functional+genetic+studies+using+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster.</a> G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).</li>
<li>Thomas, B. J., Wassarman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fly%27s+eye+view+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A fly's eye view of biology.</a> Trends Genet. 15 (5), 184-190 (1999).</li>
<li>Roignant, J. -Y., Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye disc.</a> Int J Dev Biol. 53 (5-6), 795-804 (2009).</li>
<li>Diez-Hermano, S., Ganfornina, M. D., Vegas, E., Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+learning+representation+of+loss+of+eye+regularity+in+a+Drosophila+neurodegenerative+model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Machine learning representation of loss of eye regularity in a Drosophila neurodegenerative model.</a> Front Neurosci. 14 (1), 1-14 (2020).</li>
<li>Appocher, C., Klima, R., Feiguin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+in+Drosophila+reveals+the+conserved+role+of+REEP1+in+promoting+stress+resistance+and+preventing+the+formation+of+Tau+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional screening in Drosophila reveals the conserved role of REEP1 in promoting stress resistance and preventing the formation of Tau aggregates.</a> Hum Mol Genet. 23 (25), 6762-6772 (2014).</li>
<li>Pandey, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+rescues+neurodegeneration+and+provides+an+essential+link+between+autophagy+and+the+UPS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS.</a> Nature. 447 (7146), 860-864 (2007).</li>
<li>Outa, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Drosophila+model+of+wild-type+and+T315I+mutated+BCR-ABL1+in+chronic+myeloid+leukemia%3A+an+effective+platform+for+treatment+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Validation of a Drosophila model of wild-type and T315I mutated BCR-ABL1 in chronic myeloid leukemia: an effective platform for treatment screening.</a> Haematologica. 105 (2), 387-397 (2019).</li>
<li>Shirinian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+Drosophila+melanogaster+model+to+study+human+T-lymphotropic+virus+oncoprotein+Tax-1-driven+transformation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A transgenic Drosophila melanogaster model to study human T-lymphotropic virus oncoprotein Tax-1-driven transformation in vivo.</a> J Virol. 89 (15), 8092-8095 (2015).</li>
<li>Diez-Hermano, S., Valero, J., Rueda, C., Ganfornina, M. D., Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+image+analysis+method+to+measure+regularity+in+biological+patterns%3A+a+case+study+in+a+Drosophila+neurodegenerative+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">An automated image analysis method to measure regularity in biological patterns: a case study in a Drosophila neurodegenerative model.</a> Mol Neurodegener. 10 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Yusuff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+pathogenic+copy-number+variant+genes+show+global+and+non-neuronal+defects+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of pathogenic copy-number variant genes show global and non-neuronal defects during development.</a> PLoS Genet. 16 (6), e1008792-e1008792 (2020).</li>
<li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ilastik%3A+interactive+machine+learning+for+%28bio%29image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nat Methods. 16, 1226-1232 (2019).</li>
<li>Chalmers, M. R., Kim, J., Kim, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eip74EF+is+a+dominant+modifier+for+ALS-FTD-linked+VCPR152H+phenotypes+in+the+Drosophila+eye+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Eip74EF is a dominant modifier for ALS-FTD-linked VCPR152H phenotypes in the Drosophila eye model.</a> BMC Res Notes. 16 (1), 1-5 (2023).</li>
<li>Baek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+and+PINK1+mediate+CHCHD10S59L+mutation-induced+defects+in+Drosophila+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">TDP-43 and PINK1 mediate CHCHD10S59L mutation-induced defects in Drosophila and in vitro.</a> Nat Commun. 12 (1), 1-20 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Especificações</td><td></td><td></td> do computador <td>Ryzen 5, 16 GB de RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10</td></tr><tr><td>Flynotyper</td><td>Iyer, J. et al. (2016)</td><td>Baixe o software aqui: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html</td><td>Software de código aberto. Não use o Flynotyper 2.0. No momento da publicação, o 2.0 era relativamente novo e esse protocolo é otimizado para a versão original do Flynotyper.</td></tr><tr><td>ilastik</td><td>Berg, S. et al. (2019)</td><td>Baixe o software aqui: https://www.ilastik.org/download.html</td><td>Software de código aberto. Baixe a versão 1.4.0.post1 em Compilações regulares correspondentes ao sistema operacional do seu computador.</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>Baixe o software aqui: https://imagej.net/ij/download.html</td><td>Software de código aberto. Foram utilizadas as versões 1.53 e 1.54. 1.54 é a versão atualizada e é o download padrão.</td></tr><tr><td>Leica Application Suite (LAS X)</td><td>Leica Microsystems</td><td>LASX Office 1.4.6 28433</td><td>Sistema e software usados para aquisição de pilha z.</td></tr><tr><td>Microscópio Leica Z16 APO com uma câmera DMC2900</td><td>Leica Microsystems</td><td>10 447 173, 12 730 466</td><td>Referido como microscópio Z-stack e câmera no texto. Este produto está arquivado.</td></tr></tbody></table>

quantificando os fenótipos oculares de drosophila melanogaster : uma abordagem computacional integrando ilastik e flynotyper

Quantifying Drosophila melanogaster Eye Phenotypes: A Computational Approach Integrating ilastik and Flynotyper

Em um estudo anterior, usamos esse protocolo para determinar modificadores genéticos da proteína VCP mutante ligada à esclerose lateral amiotrófica com demência frontotemporal (ALS-FTD)12. Além disso, esse método também foi usado em outro artigo para avaliar a toxicidade de CHCHD10 ALS-FTD mediada porS59L, mesmo usando um estereomicroscópio mais antigo13. Para validar ainda mais esses resultados, usamos ilastik e Flynotyper na mesma mutação da doença ALS-FTD que Baek et al.13; no entanto, um pessoal de laboratório não treinado realizou o experimento e obteve resultados semelhantes. Assim, a combinação de ilastik e Flynotyper é um método robusto para pontuar de forma imparcial a degeneração da omatídia de Drosophila .
Preferimos o uso de um anel de luz porque permite melhores avaliações qualitativas (Figura 3). No entanto, o uso de um anel de luz causa uma sombra que o Flynotyper não pode analisar diretamente. Para superar isso, pré-processamos as imagens no ilastik antes de quantificar os P-Scores com o Flynotyper. No geral, os P-Scores do olho de mosca não degenerado (GMR-GAL4) foram significativamente menores em comparação com um olho moderadamente degenerado (2x_S81L) e um olho gravemente degenerado (3x_S81L) (Figura 4A, B e Tabela 1). Este é o resultado esperado, pois P-Scores mais altos gerados pelo Flynotyper indicam um olho mais degenerado1. Quando o ilastik não foi usado, houve diferenças insignificantes nos escores P entre um olho não degenerado e um olho moderadamente degenerado (Figura 4C e Tabela 1). Isso sugere que o Flynotyper se esforça para identificar com precisão os padrões de omatídeos sob condições de luz do anel sem usar ilastik. Isso ocorre porque o Flynotyper foi projetado para usar imagens tiradas com uma luz de ponto duplo que é convertida em tons de cinza com ajustes adicionais para identificar o centro omatidial1. O Ilastik replica esse processo incorporando um ponto no centro de cada omatídio, permitindo a quantificação no Flynotyper.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig01.jpg"> Figura 1: Exemplo de fluxo de trabalho ilastik. (A) Criação de um novo projeto em ilastik. (B) Escolhendo a imagem padrão. (C) Seleção de valores sigma em Seleção de recursos. (D) Marcando o primeiro plano dos omatídeos para sensibilidade. (E) Marcar o fundo dos omatídeos para sensibilidade. (F) Selecionar como o software exportará os arquivos processados. (G) Escolher quais imagens experimentais do olho da mosca serão analisadas. (H) Mostrando quais imagens experimentais do olho da mosca serão analisadas. (I) Produto acabado após a execução do software. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig02.jpg"> Figura 2: Exemplo de fluxo de trabalho do Flynotyper. (A) Selecionar apenas o olho da mosca para análise posterior. (B) Abrindo a imagem do olho cortado em uma nova janela. (C) Selecionar quais imagens cortadas serão analisadas e os parâmetros a serem verificados para análise. (D) Exemplos de resultados. Os escores fenotípicos são apresentados na extrema direita. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig03.jpg"> Figura 3: Imagens qualitativas dos olhos de Drosophila . O mesmo olho de mosca tirado com um anel de luz (esquerda) e tirado com uma luz de ponto duplo (direita) em condições não degeneradas (superior) e degeneradas (inferiores). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig04.jpg"> Figura 4: Usando ilastik antes de Flynotyper para quantificação precisa do fenótipo do olho rugoso em Drosophila. (A) Imagens oculares representativas de Drosophila de um olho não degenerado (GMR-GAL4), um olho moderadamente degenerado (2x_S81L) e um olho gravemente degenerado (3x_S81L). (B) Resultados da quantificação do Flynotyper após a utilização de ilastik. Os valores de p de um teste t de permutação bilateral foram calculados para ajudar a facilitar a interpretação dos resultados (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0) (C) Resultados de quantificação de Flynotyper sem usar ilastik. Os valores de p de um teste t de permutação bilateral foram calculados para ajudar a facilitar a interpretação dos resultados (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0,597, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0,687). N = 3 para cada grupo. Os pontos de dados são tremidos ou empilhados no eixo x para maior clareza visual. A linha horizontal sólida representa a média. As barras de erro representam o desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">GMR-GAL4</td>
			<td colspan="2">2x_S81L</td>
			<td colspan="2">3x_S81L</td>
		</tr><tr><td>Com ilastik</td>
			<td>Sem ilastik</td>
			<td>Com ilastik</td>
			<td>Sem ilastik</td>
			<td>Com ilastik</td>
			<td>Sem ilastik</td>
		</tr><tr><td>26.7</td>
			<td>55.7</td>
			<td>52.5</td>
			<td>51.2</td>
			<td>59.9</td>
			<td>55.6</td>
		</tr><tr><td>17.4</td>
			<td>53.5</td>
			<td>50</td>
			<td>54.9</td>
			<td>60.7</td>
			<td>52</td>
		</tr><tr><td>22.8</td>
			<td>55.5</td>
			<td>56.8</td>
			<td>55.2</td>
			<td>60.1</td>
			<td>55.1</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: P-Scores ao usar Flynotyper com ilastik e ao usar Flynotyper sozinho. 
Figura S1 suplementar: Montagem da cabeça de mosca configurada para aquisição de imagem. Este é um exemplo de como configurar a aquisição de imagens usando várias folhas de papel. No entanto, qualquer método que garanta a orientação adequada da cabeça e do olho da mosca pode ser usado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%201.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar S2: Resultados quantitativos de ilastik e Flynotyper ao usar um valor sigma de 2,5 na seleção de recursos. Usar um valor sigma diferente de 5.0 na seleção de recursos no ilastik pode resultar em quantificação imprecisa. Especificamente, um valor sigma de 2,5 resulta em uma perda de sensibilidade. Os valores de p de um teste t de permutação bilateral foram calculados para ajudar a facilitar a interpretação dos resultados (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0,192, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0). N = 3 para cada grupo. Os pontos de dados são tremidos ou empilhados no eixo x para maior clareza visual. A linha horizontal sólida representa a média. As barras de erro representam o desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%202.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar S3: Perda de sensibilidade e P-Scores imprecisos devido a manchas necróticas. Setas brancas estão apontando para segmentos de manchas necróticas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%203.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar S1: P-Scores ao usar um valor sigma de 2,5 na seleção de recursos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219_Supp%20Table%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Quantificando os fenótipos oculares de Drosophila melanogaster : uma abordagem computacional integrando ilastik e Flynotyper

The Drosophila melanogaster compound eye is a well-structured and comprehensive array of around 800 ommatidia, exhibiting a symmetrical and hexagonal ...

quantifying-drosophila-melanogaster-eye-phenotypes-computational

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Preparação de adultos Drosophila Olhos de Seccionamento Fino e análise microscópica

Fonte: Wagner, K. et al., Estudando o tráfego de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas marcadas com eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Este vídeo demonstra a visualização do tráfego de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas TRPL marcadas com eGFP. Ele detalha a preparação de moscas transgênicas para imagens, a captura de imagens de fluorescência de células fotorreceptoras e a quantificação do tráfego de TRPL medindo a...

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