Quantificação de leucócitos aderentes induzidos por diabetes na vasculatura retiniana

O foco da pesquisa em nosso laboratório é aprender o que causa a retinopatia no diabetes e como ela pode ser prevenida. Vários laboratórios mostraram que a leucostase, o acúmulo excessivo de glóbulos brancos, nos pequenos vasos do olho está aumentando o diabetes. E isso pode contribuir para a oclusão e degeneração dos vasos da retina no diabetes. Essa técnica permite a visualização e quantificação da gravidade da leucostase na vasculatura retiniana. E pode ser usado nos estudos que desejam avaliar a eficácia de diferentes terapias, incluindo medicamentos.

[Instrutor] Para configurar o infusor de pressão, conecte em série a bolsa salina a 0,9%. o conjunto de cateter intravenoso, uma válvula de parada de quatro vias e a agulha de gavagem. Abra o sistema de perfusão e lave as linhas e portas com solução salina por dois minutos a uma taxa de fluxo de 18 a 20 mililitros por minuto para remover quaisquer bolhas de ar. Coloque o camundongo anestesiado em decúbito dorsal no estágio de perfusão. Identifique o processo xifóide visualmente. Com o hemostático na mão dominante, prenda e trave a pele. Em seguida, transfira o hemostático para a mão não dominante e levante a pele. Em seguida, usando uma tesoura, corte um pedaço de pele em um ângulo de 90 graus em relação à coluna para expor a parede abdominal externa. Com o processo xifóide e a caixa torácica visíveis, disseque bilateralmente através da parede abdominal, evitando cuidadosamente quaisquer órgãos ou vasos principais. Agora, visualize os ventrículos cardíacos e pulmões através do diafragma. Usando a ponta da tesoura, faça uma incisão no diafragma de um lado perto da coluna. Exponha o coração na cavidade torácica após a divisão do esterno. Com uma pinça na mão não dominante, segure o coração perto de seu ápice. Usando a mão dominante, segure a agulha de gavagem presa ao cateter intravenoso e perfure o ápice do coração. Certifique-se de que a ponta esférica da agulha de gavagem esteja ligeiramente saliente do local da punção para evitar perfurar totalmente o ventrículo esquerdo ou entrar na vasculatura pulmonar. Em seguida, abra a torneira para permitir o fluxo de solução salina a 0,9%. Simultaneamente, use uma tesoura para abrir o átrio direito. Continue a perfusão por dois a três minutos, movendo a agulha suavemente de um lado para o outro e para cima e para baixo para evitar dobras da vasculatura e aumentar a drenagem sanguínea do coração. Após a perfusão, gire a alça da torneira para interromper o fluxo de solução salina e permitir o fluxo da seringa para a agulha de gavagem. Em seguida, perfunda manualmente 10 mililitros de solução de concanavalina A em 30 a 35 segundos. Depois de perfundir o coração de um camundongo anestesiado com solução de concanavalina A, vire o mouse de lado. Coloque o dedo indicador da mão não dominante na pálpebra superior e o polegar na pálpebra inferior. Retraia suavemente as pálpebras e a pele ao redor para proptose o olho, permitindo que ele se projete parcialmente para fora da órbita. Em seguida, usando a tesoura curva na mão dominante, coloque sob o olho em um ângulo de 45 graus. Corte os anexos musculares e o nervo óptico. Usando a tesoura como espátula, transfira o olho para um pequeno recipiente. Coloque o olho na cera dental para se preparar para a abertura do globo. Sob o microscópio de dissecação, usando micropinças, segure a prega escleral ou os restos musculares presos à parte posterior do olho e oriente o olho de forma que a córnea fique voltada para um lado. Faça uma incisão atrás e paralela ao limbo. Use uma microtesoura para separar o segmento anterior do olho, incluindo a lente ao redor do perímetro da ocular, garantindo que a retina esteja totalmente separada da esclera. Retire a retina da esclera com a micro espátula. Se a retina ainda estiver presa pelo nervo óptico, insira uma microtesoura entre a retina e a esclera para cortar o nervo óptico. Coloque a retina não fixada em uma lâmina com uma gota de PBS. Faça de quatro a cinco cortes radiais na retina, criando um padrão de folha de trevo para que fique plana. Observe a retina plana sob o microscópio com ampliação de 100x usando uma objetiva de 10x. A microscopia fluorescente da vasculatura retiniana mostrou que as retinas diabéticas exibiam leucostase leve com tipicamente 3 a 12 leucócitos por retina, em comparação com 1 a 3 em controles não diabéticos. Clusters leucocitários significativos foram observados em modelos inflamatórios desafiados por lipopolissacarídeos, em contraste com o agrupamento leve em amostras diabéticas.