Fluxo de trabalho de biofabricação escalável para produzir e isolar bioterapêuticos de câncer baseados em vesículas extracelulares derivadas de células assassinas naturais

Nossa pesquisa se concentra em pequenas vesículas produzidas por um tipo de células imunológicas que são naturalmente eficazes em matar células cancerígenas. Essas vesículas possuem potencial terapêutico promissor para o tratamento de tumores sólidos, tanto nos locais primários quanto secundários, como o cérebro. Neste estudo, usamos uma resina bimodal para isolar vesículas por meio de cromatografia de exclusão de tamanho, maximizando a pureza do produto separando fisicamente as vesículas dos contaminantes enquanto retemos ainda mais os contaminantes dentro da resina por meio de forças eletrostáticas.

Em seguida, esterilizamos, concentramos e trocamos as vesículas antes de usar Os detalhes do fluxo de trabalho de biofabricação neste vídeo usam condições clinicamente relevantes e são escaláveis em termos de custo, produzindo efetivamente grandes quantidades de vesículas extracelulares de alta pureza. Isso torna a técnica acessível para que os laboratórios acadêmicos invistam recursos com confiança no estudo de tais terapêuticas com um processo confiável de produção e isolamento. Atualmente, estamos investigando o potencial terapêutico dessas vesículas e modelos pré-clínicos e fortalecendo ainda mais nossa compreensão de como eles funcionam.

Para começar, execute o início rápido do sistema de cromatografia líquida de proteína de acordo com as instruções do fabricante. Faça as conexões usando o método gotejamento para gotejamento para garantir que nenhum ar seja introduzido dentro da coluna. Configure o coletor de frações com tubos de coleta apropriados para coletar as amostras.

Altere as configurações de fracionamento para o volume de coleta desejado. Remova 40 a 80 mililitros de vesícula extracelular previamente preparada ou meio condicionado rico em EV do freezer de 80 graus Celsius e descongele rapidamente a 37 graus Celsius. Girar a amostra a 10 000 G durante 30 minutos a quatro graus Celsius e transferir o sobrenadante para um novo tubo.

Para reduzir os níveis de DNA de fita dupla, trate o meio condicionado rico em EV com cinco milimoles de cloreto de magnésio e 50 unidades por mililitro de endonuclease. Incube a amostra por duas a quatro horas a 37 graus Celsius com mistura moderada. Quando o sistema de cromatografia estiver pronto, carregue o meio condicionado rico em EV em uma seringa de 60 mililitros e conecte-o à linha de amostra.

Clique em Execução manual para iniciar o sistema e definir a taxa de fluxo como zero. Siga as instruções do software para salvar a execução preventivamente. Em seguida, clique em Iniciar.

Selecione PBS de filtragem dupla de batimento de linha e funcione a uma velocidade de fluxo de dois mililitros por minuto, garantindo que a solução passe pela coluna. Assim que o absorvente estabilizar, pressione Auto Zero UV. Altere o caminho do fluxo para direcionar a amostra para o frasco de resíduos antes da coluna. Após cinco a 20 segundos, direcione a amostra para a coluna.

Quando as leituras de UV atingirem aproximadamente 230 unidades de miliabsorbância, clique em Fracionamento. Após a injeção completa da amostra, mude o sistema tampão para PBS com filtro duplo para continuar a purificação. Quando o valor de UV atingir aproximadamente 1.600 unidades de miliabsorbância, clique novamente em Fracionamento.

Quando a execução for interrompida, salve o cromatograma como um documento PDF. Enxágue todos os componentes do aparelho de ultrafiltração com 20 a 30 mililitros de etanol a 90%. Centrifugar a 4 000 G durante cinco a 10 minutos e rejeitar o fluxo.

Em seguida, execute o enxágue com PBS estéril para equilibrar o dispositivo e repita as etapas de centrifugação como antes. Combine todas as frações diluídas de NK-EVs. Para maximizar a esterilidade, filtre a solução diluída de NK-EV usando um filtro de seringa de 0,22 micrômetro, pré-umedecido com PBS de filtro duplo.

Recolher o filtrado para o aparelho de concentração esterilizado. Centrifugar o filtrado a 4 000 g durante 15 a 40 minutos. Depois de centrifugar, misturar a solução no compartimento superior do filtro com uma pipeta serológica.

Novamente, gire a 4.000 G por 10 minutos. Inverta o dispositivo de filtragem e conecte-o ao dispositivo coletor para coletar o NK-EV. Gire o NK-EV a 2.000 G por dois minutos e transfira o produto purificado para um tubo estéril.

Inicie o sistema de análise de rastreamento de nanopartículas de acordo com as instruções do fabricante. Observe a célula de fluxo quanto a bolhas de ar. Se houver uma bolha de ar, remova-a enxaguando a célula de fluxo com etanol a 20% e água filtrada duplamente.

Uma vez limpo, reinsira cuidadosamente o módulo de laser no instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas. Feche a porta e clique em Iniciar câmera. Altere as configurações de captura para um ganho de tela de dois e um nível de câmera de 14.

Ligue o aquecedor para estabilizar a temperatura da célula de fluxo. Clique em Medição padrão para criar um script na guia SOP para coletar uma captura em um minuto a uma taxa de fluxo de 30 a 23 graus Celsius. Adicione a pasta e o nome do arquivo ao nome do caminho para salvar os dados.

Vortex o produto purificado NK-EV e prepare sua diluição usando PBS com filtro duplo. Depois de fazer o vórtice da amostra diluída, carregue-a na seringa de aquisição de 1 mililitro sem introduzir bolhas de ar. Conecte cuidadosamente a seringa à linha de carregamento do instrumento.

Empurre lentamente metade da amostra, deixando aproximadamente 0,5 mililitros na seringa. Quando as partículas estiverem visíveis na tela, foque a câmera para ter no máximo um halo ao redor de cada partícula, na guia Hardware, clique em Infundir e defina uma taxa de 1.000 por cinco segundos. Em seguida, reduza a taxa para 30.

Pressione Executar script. Depois de verificar se as configurações estão corretas, clique em Sim e siga as instruções do software. Depois de concluir a captura, clique em Cancelar quando o software solicitar o processamento ou exportação de arquivos.

Ao registrar cinco capturas por diluição, importe todas as cinco capturas para análise. Realce os arquivos e clique em Processar arquivos selecionados. Na guia Processo, ajuste as configurações de análise para um ganho de tela de dois e um limite de detecção de 15.

Marque e clique em OK para análise. Após o processamento, clique em Sim sem clicar em caixas adicionais ou clique em Exportar para exportar os arquivos. O tamanho de partícula purificada de NK-EV variou de 76,30 a 174,30 nanômetros com uma concentração média de 1,39 vezes 10 elevado a 12 EVs por mililitro.

Além disso, a quantificação do fluorômetro mostrou uma concentração de proteína de aproximadamente 300 miligramas por mililitro e uma concentração de DNA de fita dupla de 225 miligramas por mililitro. O tratamento com células de leucemia K562 humana com NK-EVs mostrou uma diminuição dependente da dose na viabilidade celular com um EC 50 de 9,33 vezes 10 elevado a nove EVs por mililitro.