Name: Configurando uma classificação bem-sucedida para isolamento de vesículas extracelulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a classificar vesículas extracelulares de células estromais mesenquimais para regeneração tecidual usando tecnologia de citometria de fluxo. Este protocolo garante alta pureza e preservação da integridade das vesículas isoladas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Classificação baseada em fluorescência de vesículas extracelulares derivadas de tecido adiposo

<ol><li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+%28misev2023%29%3A+From+basic+to+advanced+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).</li>
<li>Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+isolation+and+characterization%3A+Toward+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle isolation and characterization: Toward clinical application.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1152-1162 (2016).</li>
<li>Dixson, A. C., Dawson, T. R., Di Vizio, D., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-specific+regulation+of+extracellular+vesicle+biogenesis+and+cargo+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Context-specific regulation of extracellular vesicle biogenesis and cargo selection.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 454-476 (2023).</li>
<li>Witwer, K. W., Wolfram, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+versus+synthetic+nanoparticles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles versus synthetic nanoparticles for drug delivery.</a> Nat Rev Mater. 6 (2), 103-106 (2021).</li>
<li>Cheng, L., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutically+harnessing+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Therapeutically harnessing extracellular vesicles.</a> Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 379-399 (2022).</li>
<li>Du, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+A+rising+star+for+therapeutics+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: A rising star for therapeutics and drug delivery.</a> J Nanobiotechnology. 21 (1), 231(2023).</li>
<li>Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%3A+Novel+frontiers+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Novel frontiers in regenerative medicine.</a> Stem Cell Res Ther. 9 (1), 63(2018).</li>
<li>Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+and+other+tissues%3A+Basic+biological+properties+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications.</a> Stem Cells Int. 2012, 461718(2012).</li>
<li>Caplan, A. I., Dennis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+trophic+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as trophic mediators.</a> J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).</li>
<li>Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%3A+Toward+cell-free+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications.</a> Mol Ther. 23 (5), 812-823 (2015).</li>
<li>Galipeau, J., Sensébé, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+Clinical+challenges+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: Clinical challenges and therapeutic opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
<li>Ohnuma, K., Yomo, T., Asashima, M., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+of+cells+of+the+same+size%2C+shape%2C+and+cell+cycle+stage+for+a+single+cell+level+assay+without+staining%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sorting of cells of the same size, shape, and cell cycle stage for a single cell level assay without staining.</a> BMC Cell Biol. 7, 25(2006).</li>
<li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+detection+and+sorting+of+nanoscale+vesicles+in+viral+disease+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">High-fidelity detection and sorting of nanoscale vesicles in viral disease and cancer.</a> J Extracell Vesicles. 8 (1), 1597603(2019).</li>
<li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 734(2020).</li>
<li>Andreu, Z., Yanez-Mo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanins+in+extracellular+vesicle+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tetraspanins in extracellular vesicle formation and function.</a> Front Immunol. 5, 442(2014).</li>
<li>Mildmay-White, A., Khan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+on+adipose-derived+stem+cells%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers on adipose-derived stem cells: A systematic review.</a> Curr Stem Cell Res Ther. 12 (6), 484-492 (2017).</li>
<li>Welsh, J. A., Tang, V. A., Van Der Pol, E., Gorgens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIFlowCyt-EV%3A+The+next+chapter+in+the+reporting+and+reliability+of+single+extracellular+vesicle+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">MIFlowCyt-EV: The next chapter in the reporting and reliability of single extracellular vesicle flow cytometry experiments.</a> Cytometry A. 99 (4), 365-368 (2021).</li>
<li>Maia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Employing+flow+cytometry+to+extracellular+vesicles+sample+microvolume+analysis+and+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Employing flow cytometry to extracellular vesicles sample microvolume analysis and quality control.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 593750(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Diacetato de 5(6)-carboxifluoresceína&nbsp; Éster N-succinimidílico</td><td>Merck</td><td>150347-59-4</td><td></td></tr><tr><td>Células estromais mesenquimais adiposas</td><td>Wepredic, Parc d'affaires, 35760 Saint-Gr&eacute; goire, França</td><td></td><td>Células usadas neste estudo</td></tr><tr><td>Alexa 488 anti-Caveolina</td><td>R& D Systems</td><td>IC5736G</td><td>Anticorpo por citometria de fluxo</td></tr><tr><td>APC anti-CD44 humano</td><td>BioLegend</td><td>338805</td><td>Anticorpo por citometria de fluxo</td></tr><tr><td>APC anti-CD63</td><td>humano BioLegend</td><td>353007</td><td>Anticorpo por citometria de fluxo</td></tr><tr><td>APC anti-CD81 humano (TAPA-1)</td><td>BioLegend</td><td>349509</td><td>Anticorpo por citometria de fluxo</td></tr><tr><td>APC anti-CD9 humano</td><td>BioLegend</td><td>312107</td><td>Citometria de fluxo anticorpo</td></tr><tr><td>BC CytoFLEX S</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>BC CytoFLEX S equipado com 3 lasers, Azul, Vermelho e Violeta</td></tr><tr><td>Flow-Check Pro Fluorospheres</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63493</td><td>Esferas de controle fluorescentes para MoFLO Astrios EQ</td></tr><tr><td>Software FlowJo (versão 10.8.1)</td><td>BD</td><td>versão 10.8.1</td><td>Software de análise</td></tr><tr><td>Kit IntraSure BD</td><td>Biosciences</td><td>641776</td><td>Fixação e permeabilização para coloração intracelular</td></tr><tr><td>Megamix-Plus FSC</td><td>BioCytex</td><td>7802</td><td>FSC contas de poliestireno&nbsp;</td></tr><tr><td>MoFLO Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>MoFLO Astrios EQ equipado com 4 lasers, azul, amarelo - verde, violeta e vermelho</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-FLOT1 do rato</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610820</td><td>Anticorpo Western Blot</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Calnexina do coelho</td><td>Anticorpo</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Origene TA336279 Western BlotAnticorpo anti-CD9 e CD81 para coelhos (kit de anticorpos ExoAb)</td><td>Anticorpos Western Blot</td><td>EXOAB-KIT-1</td> da <td>System Biosciences</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-TSG101 para coelhos&nbsp;</td><td>Merck</td><td>HPA006161</td><td>Western Blot anticorpo</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Rainbow Partículas Fluorescentes</td><td>Spherotech</td><td>URFP-30-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultracel 100 kDa MWCO</td><td>Merck</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>VER01 - Verity Shells</td><td>Exometria</td><td></td><td>Grânulos de sílica Organo para calibração de dispersão</td></tr></tbody></table>

configurando uma classificação bem-sucedida para isolamento de vesículas extracelulares

Setting a Successful Sorting for Extracellular Vesicle Isolation

Os grânulos de poliestireno FSC foram classificados para validar a configuração do instrumento e as condições de classificação. Os grânulos de poliestireno FSC são uma mistura de grânulos fluorescentes que variam de 100 nm, 300 nm, 500 nm e 900 nm e são visíveis no canal FITC. A Figura 7A mostra a escala logarítmica SSC versus o gráfico de pontos da escala logarítmica FITC com as quatro populações de grânulos antes da classificação. As populações fluorescentes de 100 nm, 300 nm e 500 nm foram fechadas e classificadas. As contas classificadas foram analisadas quanto à pureza e enriquecimento como uma prova inicial de conceito (Figura 7B). Todas as populações ficaram puras após a triagem. O ruído de fundo de referência é sempre visível nos gráficos de pontos antes e depois da classificação.
Para atender aos requisitos listados no MISEV2018/2023 e demonstrar a natureza das vesículas e seu grau de pureza, foram realizados experimentos para analisar marcadores presentes ou ausentes nas EVs. As EVs são positivas para alguns marcadores de superfície específicos15: CD9, CD63, CD81 e CD44. CD9, CD63 e CD81 pertencem à família das tetraspaninas de proteínas de membrana e são os marcadores mais comuns para identificar exossomos16. O CD44 é um marcador altamente expresso por CTMs e ASCs17.
Os EVs também são positivos para a proteína citosólica Caveolina, conforme demonstrado pelo experimento de citometria de fluxo intracelular. Além disso, o western blot confirma a positividade para CD9, CD81, TSG101, Flotilina e a negatividade para Calnexina (Figura 2).
Em seguida, os ASC-EVs marcados com CFSE foram classificados conforme relatado no protocolo. Esse procedimento de triagem foi repetido quatro vezes, mantendo exatamente as mesmas condições de preparo, coloração e classificação das amostras (Tabela 1). Desta forma, a repetibilidade do protocolo foi demonstrada.
Um conjunto de experimentos foi realizado para analisar a população de ASC-EVs classificada por CFSE e demonstrar que suas características não mudaram por meio da classificação. Em particular, a expressão de CD9, CD63, CD81 e CD44 não muda após a classificação (Figura 6A).
Outro ponto crítico diz respeito às dimensões dos EVs e como eles podem mudar após o procedimento de classificação devido ao estresse induzido pela pressão. A análise pós-classificação foi difícil de realizar devido à pequena quantidade de amostra, mas a análise de rastreamento de nanopartículas demonstra que a distribuição das duas amostras de ASC-EVs (pré e pós-classificação) foi a mesma (Figura 6B). Finalmente, a análise de EVs por meio de TEM demonstra que sua morfologia parece não ser significativamente alterada após a classificação (Figura 6C).
É importante observar que, conforme sugerido pelas diretrizes da estrutura MIFlowCyt-EV18, foi observada uma redução na quantidade de EVs positivos para CFSE após o tratamento com amostra Triton X-100 a 0,1%, apoiando assim sua origem vesicular (Figura 8).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67232/67232fig07.jpg"> 
Figura 7: Classificação de esferas de poliestireno FSC. (A) Gráfico de pontos SSC / FITC de contas antes da classificação. Gráfico de pontos SSC/FITC de grânulos reanalisados após a classificação: (B) grânulos classificados de 100 nm, (C) grânulos classificados de 300 nm e (D) grânulos classificados de 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67232/67232fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67232/67232fig08.jpg"> 
Figura 8: Degradação da membrana EV na presença do Triton X-100. Triton X-100 na concentração de 0,1% foi adicionado à amostra por 15 min à temperatura ambiente. Gráficos de dispersão representativos de três experimentos independentes de amostras não tratadas (esquerda) e tratadas (direita) são relatados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67232/67232fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Experimentar</td>
			<td>Número de EVs classificados</td>
			<td>Número de EVs classificados CFSE+</td>
			<td>Pressão (psi)</td>
			<td>Bico mm</td>
			<td>Frequência (Hz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>74 x 106</td>
			<td>4,8 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>44 x 106</td>
			<td>7 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>38 x 106</td>
			<td>3 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>16 x 106</td>
			<td>2 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Quadro 1: Repetibilidade do procedimento de triagem

Configurando uma classificação bem-sucedida para isolamento de vesículas extracelulares

Extracellular vesicles (EVs) released by mesenchymal stromal cells (MSCs) contain a set of microRNAs with regenerative and anti-inflammatory roles. ...

setting-a-successful-sorting-for-extracellular-vesicle-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Source: DeMarino, C., et al. Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus. J. Vis. Exp. (2019)The video demonstrates the separation of EVs from virions and other contaminants by density gradient centrifugation, followed by capture and concentration with hydrogel nanoparticles. Washed fractions are then ready for downstream identification of those enriched in EVs.

Separation and Enrichment of Extracellular Vesicles in the Presence of Virions

Este vídeo descreve a técnica de extração de vesículas extracelulares de tecidos frescos ou congelados. As vesículas extracelulares isoladas podem ser usadas para análises posteriores para descobrir seus papéis significativos na patogênese da doença.

Extração de Vesículas Extracelulares: Uma Técnica para Isolar Vesículas Extracelulares de Amostras de Tecidos Inteiros Usando Centrifugação Diferencial

Este vídeo demonstra o método de purificação baseado em ultracentrifugação com gradiente de densidade para isolar subpopulações de vesículas extracelulares adequadas para estudos de caracterização.

Purificação de subpopulações de vesículas extracelulares: uma técnica para purificar subpopulações de vesículas extracelulares usando ultracentrifugação com gradiente de densidade

lesões no figado são acompanhadas por expansão de células progenitoras que representa uma população celular heterogénea. classificação Novel deste compartimento celular permite a distinção dos vários subgrupos. O método descrito aqui ilustra a análise de citometria de fluxo e de alta pureza isolamento de vários subconjuntos que podem ser utilizadas para ensaios posteriores.

Isolamento e Enriquecimento de fígado progenitoras Subconjuntos identificado por um marcador combinação de superfícies Novel

Este protocolo isola vesículas extracelulares (EVs) longe de virions com alta eficiência e rendimento através da incorporação de precipitação EV, ultracentlee gradiente de densidade, e captura de partículas para permitir um fluxo de trabalho simplificado e uma redução de partida requisitos de volume, resultando em preparações reprodutíveis para uso em todas as pesquisas EV.

Purificação de preparações de vesículas extracelulares de alto rendimento longe do vírus

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