Name: Isolamento e caracterização de exossomos derivados de tecidos de baço de camundongo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Aprenda a isolar exossomos derivados de baço de camundongo usando colagenase tipo I e ultracentrifugação diferencial. Este protocolo preserva a integridade da membrana celular para estudos de doenças cardiovasculares.

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As amostras foram obtidas de camundongos, com aprovação ética concedida pelo Comitê de Ética da Universidade Médica de Guangdong. Descrições detalhadas de materiais, equipamentos e software usados neste protocolo são fornecidas na Tabela de Materiais. Os detalhes da preparação antes da extração são ilustrados na Figura 1, enquanto o processo de extração e enriquecimento do Spleen-Exo é descrito na Figura 2.
1. Preparação
<ol>
	<li>Pré-arrefecer centrífugas de alta e ultra-alta velocidade a 4 °C e ajustar a temperatura de um agitador de mesa a 37 °C.</li>
	<li>Prepare placas de cultura de células (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">100 mm), tubos de centrífuga estéreis de 50 mL, gelo e filtro de células estéreis (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm) conforme mostrado na Figura 1A, B.</li>
	<li>Esterilize tesouras e pinças com spray de álcool 75%, seguido de esterilização em alta temperatura. Essas ferramentas são mostradas na Figura 1C.</li>
	<li>Coloque o tecido do baço em uma placa de Petri estéril <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">de 100 mm no gelo e lave o sangue da superfície com 1x solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) gelada. Seque os tecidos do baço com gaze estéril e pese-os após a secagem. NOTA: Se o tecido estiver congelado, descongele-o em um prato por 15 min no gelo antes de prosseguir.</li>
	<li>Hidrate o filtro de células (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm) colocando 1 mL de PBS estéril no filtro usando uma pipeta de transferência estéril.</li>
	<li>Prepare o tampão digestivo (0,1% colagenase tipo I) usando 1x PBS com um misturador de vórtice. NOTA: Use 10 mL de tampão digestivo para cada 100 mg de tecido do baço. A concentração de colagenase foi escolhida neste estudo com base nas instruções do produto. Para outros tipos de tecido, os pesquisadores podem precisar ajustar esses parâmetros com base na densidade e composição do tecido. Experimentos preliminares com concentrações e tempos de digestão variados são recomendados para determinar as condições ideais para cada tipo de tecido.</li>
</ol>
2. Digestão de tecidos
<ol>
	<li>Pique o tecido em pequenos pedaços uniformes com uma tesoura em uma placa de cultura sobre gelo (Figura 3A) e transfira para um tubo de centrífuga de 50 mL com uma pipeta de transferência estéril.</li>
	<li>Adicione o tampão de digestão ao tubo de acordo com o peso do tecido do baço, conforme indicado acima (Figura 3B), agite o tubo com um ângulo de 45° em um agitador horizontal a 37 °C. Monitore o progresso da digestão e pare a digestão quando os pedaços de tecido se dispersarem e a maioria perder a forma. O tempo de digestão deve variar entre os tecidos. Nas condições experimentais deste estudo, o tempo de digestão é de aproximadamente 30 min.</li>
	<li>Transferir a mistura digerida para um filtro celular (Ф70 μm) à temperatura ambiente (RT) para remover os detritos fibrosos e de tecido maior. NOTA: Filtração completa imediatamente após a digestão.</li>
	<li>Recolher o filtrado num novo tubo de centrifugação de 50 ml.</li>
</ol>
3. Isolamento de exossomos por centrifugação diferencial
<ol>
	<li>Centrifugar os filtrados a 500 x g durante 10 min a 4 °C. Um pellet contendo células residuais, detritos celulares e núcleos pode ser visto após a centrifugação, conforme mostrado na Figura 3C.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar a 3000 x g durante 20 min a 4 °C. Um pellet contendo corpos apoptóticos e microssomas pode ser visto após a centrifugação, conforme mostrado na Figura 3D.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar a 10.000 x g durante 30 min a 4 °C. Pellet contendo microvesículas e membrana plasmática pode ser visto após centrifugação, conforme mostrado na Figura 3E.</li>
	<li>Ultracentrifugar o sobrenadante resultante a 120.000 x g durante 2 h a 4 °C. Um pellet pode ser visto no fundo do tubo após a centrifugação, conforme mostrado na Figura 3F.</li>
	<li>Rejeitar o sobrenadante, lavar o sedimento com PBS e voltar a fazer a ultracentrifugação a 120.000 x g durante 2 h a 4 °C para obter exossomas. Um pellet pode ser visto no fundo do tubo após a centrifugação, conforme mostrado na Figura 3G.</li>
	<li>Dissolver os exossomas isolados com PBS estéril (200 μL por baço) e armazenar os exossomas isolados num novo tubo de centrifugação de 2 ml a -80 °C.</li>
</ol>
4. Caracterização de exossomas por microscopia eletrónica de transmissão (MET)
NOTA: O TEM foi usado para determinar se o Exo extraído exibia características de vesícula. As amostras Exo identificadas por microscopia electrónica devem ser amostras frescas ou armazenadas brevemente a 4 °C durante um curto período de tempo.
<ol>
	<li>Fixe os exossomos (2-6 μg / μL) com paraformaldeído de grau de microscopia eletrônica (EM) a 2% em RT por 2 h.</li>
	<li>Coloque 10 μL de solução de exossomo em uma malha de cobre, incube em RT por 10 min, enxágue com água destilada estéril e seque o excesso de líquido com papel absorvente.</li>
	<li>Manchar a malha de cobre com acetato de uranilo a 2% por 1 min, secar o excesso de líquido com papel de filtro e secar sob uma lâmpada incandescente por 2 min.</li>
	<li>Observar a amostra preparada ao microscópio electrónico de transmissão a 80 kV.</li>
</ol>
5. Distribuição de tamanho e medição da concentração de partículas de exossomos
<ol>
	<li>Carregar as nanopartículas de poliestireno padrão (250 nm) no citómetro de nanofluxo.</li>
	<li>Meça a concentração de proteína de amostras Exo usando um kit de ensaio de proteína BCA. Dilua a amostra Exo com PBS de acordo com os resultados do ensaio de proteína BCA (dilua os exossomos para 1-10 ng/μL) e, em seguida, carregue as amostras Exo no nanofluxo para medir a intensidade de dispersão lateral (SSI).</li>
	<li>Calcule a concentração de Exo de acordo com a proporção de SSI para concentração de partículas nas nanopartículas de poliestireno padrão. NOTA: Para medição de tamanho, uma curva padrão é gerada carregando nanopartículas de sílica padrão com tamanhos de gradiente (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) para o citômetro de nanofluxo. O carregamento da amostra Exo segue isso. A distribuição de tamanho do Exo foi calculada de acordo com a cura padrão.</li>
</ol>
6. Confirmação de lise e immunoblot de proteínas exossômicas
<ol>
	<li>Adicione 100 μL de tampão de lise de ensaio de imunoprecipitação de rádio (RIPA) ao pellet de exossomo para análise de proteínas.</li>
	<li>Vórtice vigorosamente, cubra com parafilme, balance por 20 min em RT e depois vórtice novamente.</li>
	<li>Centrifugue brevemente a 1000 x g por 30-60 s para coletar a amostra, transfira para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e armazene a -20 ° C a -80 ° C até a análise.</li>
	<li>Para immunoblot, misture amostras com tampão de carga 5x para atingir uma concentração de 1x e prepare-se para eletroforese em gel.</li>
	<li>Se forem desejados controles de homogeneizado de tecido inteiro, use um tampão de lise forte com um inibidor de protease para lisar o tecido, conforme detalhado acima. Em seguida, centrifugue as amostras a 10.000 x g por 10 min e descarte a matriz extracelular restante, células inteiras ou detritos celulares intactos.</li>
	<li>Ferva o tampão de amostra contendo exossomos ou homogeneizado de tecido a 95 °C por 5-10 min. Carregue a mesma proteína por pista em um gel SDS-PAGE a 10%. Carregue a proteína igual do homogeneizado do tecido como controle.</li>
	<li>Prossiga com a eletroforese em gel sob uma tensão de 80 V por aproximadamente 2 h usando o tampão de eletroforese convencional. Realize a análise de western blot para confirmar a expressão da proteína Exo nos lisados purificados e comparar a abundância relativa de Exo em frações.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Técnicas de refinamento para isolamento de exossomos derivados do baço murino

<ol><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Curr Biol. 28 (8), R435-R444 (2018).</li>
<li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).</li>
<li>Crescitelli, R., Lasser, C., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li>
<li>de Jong, B., Barros, E. R., Hoenderop, J. G. J., Rigalli, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+extracellular+vesicles+as+drug+delivery+systems+and+their+potential+in+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in extracellular vesicles as drug delivery systems and their potential in precision medicine.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1006(2020).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).</li>
<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Front Mol Biosci. 7, 33(2020).</li>
<li>Leung, L. L., Riaz, M. K., Qu, X., Chan, J., Meehan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+extracellular+vesicles+in+oral+cancer%2C+from+transcriptomics+to+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Profiling of extracellular vesicles in oral cancer, from transcriptomics to proteomics.</a> Semin Cancer Biol. 74, 3-23 (2021).</li>
<li>Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles in human disease.</a> N Engl J Med. 379 (10), 958-966 (2018).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enrichment+method+for+small+extracellular+vesicles+derived+from+liver+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue.</a> J Vis Exp. (192), e64499(2023).</li>
<li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
<li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+and+particle+biomarkers+define+multiple+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers.</a> Cell. 182 (4), 1044-1061.e18 (2020).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yiwei+decoction+promotes+apoptosis+of+gastric+cancer+cells+through+spleen-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Yiwei decoction promotes apoptosis of gastric cancer cells through spleen-derived exosomes.</a> Front Pharmacol. 14, 1144955(2023).</li>
<li>Useckaite, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+paired+human+liver+homogenate+and+tissue-derived+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of paired human liver homogenate and tissue-derived extracellular vesicles.</a> Proteomics. 24 (11), e2300025(2023).</li>
<li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci Methods. 307, 210-220 (2018).</li>
<li>Lai, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+processing+and+characterization+approaches+for+research+and+technology+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Exosome processing and characterization approaches for research and technology development.</a> Adv Sci (Weinh). 9 (15), e2103222(2022).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome%3A+A+review+of+its+classification%2C+isolation+techniques%2C+storage%2C+diagnostic+and+targeted+therapy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications.</a> Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).</li>
<li>Roh, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+exosomes+alleviate+particulate+matter-induced+inflammatory+response+and+skin+barrier+damage+in+atopic+dermatitis-like+triple-cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived exosomes alleviate particulate matter-induced inflammatory response and skin barrier damage in atopic dermatitis-like triple-cell model.</a> PLoS One. 19 (1), e0292050(2024).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+extracellular+vesicles+from+tissues+of+the+central+nervous+system+by+PROSPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).</li>
<li>Kurian, T. K., Banik, S., Gopal, D., Chakrabarti, S., Mazumder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+methods+for+isolation+and+quantification+of+exosomes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Elucidating methods for isolation and quantification of exosomes: A review.</a> Mol Biotechnol. 63 (4), 249-266 (2021).</li>
<li>Menu, E., Vanderkerken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+multiple+myeloma%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Exosomes in multiple myeloma: from bench to bedside.</a> Blood. 140 (23), 2429-2442 (2022).</li>
<li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+lysate%2Ftissue+storage+at+-80+degrees+C+on+subsequently+extracted+EVs+of+epithelial+ovarian+cancer+tissue+origins%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Effects of lysate/tissue storage at -80 degrees C on subsequently extracted EVs of epithelial ovarian cancer tissue origins.</a> iScience. 26 (4), 106521(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>70 &micro; m Cell Strainer</td><td>Biologix Group Co., Ltd.USA</td><td>15-1070</td><td></td></tr><tr><td>Anti CD9 anticorpo</td><td>Cell Signaling Technology, Inc (CST), USA</td><td>983275</td><td></td></tr><tr><td>Anti GM130 anticorpo</td><td>Proteintech Group, Inc.China&nbsp;</td><td>66662-1-lg</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo TSG101</td><td>Abcam Plc, Reino Unido</td><td>125011</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de células</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, China</td><td>Tubo de</td> centrífuga 704001 <td></td></tr><tr><td></td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, China</td><td>788211</td><td></td></tr><tr><td>colagenase tipo I</td><td>Sigma-Aldrich Corp., EUA</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>Agitador</td> <td>termostático de mesaXangai bluepard instruments Co., Ltd., China</td><td>THZ-100</td><td></td></tr><tr><td>Eletroforese buffer</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China&nbsp;</td><td>G2081-1L</td><td></td></tr><tr><td>melhorou a</td><td>biotecnologia Co. de Shanghai Beyotime do jogo do ensaio da proteína do BCA, Ltd., China&nbsp;</td><td>P0010S</td><td></td></tr><tr><td>Flow NanoAnalyzer</td><td>NanoFCM Inc., China</td><td>N30E</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem de fluorescência / quimioluminescência&nbsp;</td><td>Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China</td><td>GelView 6000Plus</td><td></td></tr><tr><td>HRP Goat anti-Mouse IgG</td><td>Proteintech Group, Inc.China&nbsp;</td><td>15014</td><td></td></tr><tr><td>HRP Cabra anti-Coelho IgG</td><td>Proteintech Group, Inc.China&nbsp;</td>Leitor de microplacas <td>15015</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Molecular Devices, USA</td><td>CMax Plus</td><td></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>Shanghai&nbsp; Médico&nbsp; Instruments (group)&nbsp;Co., Ltd.,China</td><td>WA1010</td><td></td></tr><tr><td>Pinças microscópicas</td><td>Shanghai&nbsp; Médico&nbsp; Instrumentos (grupo)&nbsp;Co., Ltd.,China</td><td>WA3010</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge X1R Pro centrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>75009750</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura oftálmica</td><td>Xangai&nbsp; Médico&nbsp; Instruments (group)&nbsp;Co., Ltd.,China</td><td>Y00030</td><td></td></tr><tr><td>Pinças Oftálmicas</td><td>Xangai&nbsp; Médico&nbsp; Instruments (Group)&nbsp;Co., Ltd., China&nbsp;</td><td>JD1060</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-100 Centrífuga de ultrafiltração</td><td>Beckman Coulter, EUA</td><td>A94469</td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., China</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise RIPA (forte, sem inibidores)</td> <td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China&nbsp;</td><td>P0013K</td><td></td></tr><tr><td>Régua</td><td>Deli&nbsp; Fabricação&nbsp; Empresa, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Buffer de Carregamento de Amostras, 5x</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., China&nbsp;</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Transferência</td><td>Biologix Group Co., Ltd.USA</td><td>30-0238A1</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico de Transmissão</td><td>Hitachi, Japão</td> Tubo de Ultracentrifugação <td>H-7650</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter, EUA</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Transferência Ocidental&nbsp;</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China&nbsp;</td><td>G2028-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e caracterização de exossomos derivados de tecidos de baço de camundongo

Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues

Isolamento e purificação de exossomos derivados do baço Para isolar os exossomos do tecido do baço de camundongos, empregamos uma combinação de digestão de colagenase e ultracentrifugação diferencial (Figura 2). As etapas iniciais envolveram o pré-tratamento do tecido do baço para remover o sangue da superfície, seguido pela digestão com colagenase tipo I. Esse tratamento enzimático facilitou a quebra dos componentes da matriz extracelular, liberando assim os exossomos e preservando sua integridade. Após a digestão, uma série de etapas de centrifugação foi empregada para remover sequencialmente detritos celulares, corpos apoptóticos e vesículas maiores, culminando na ultracentrifugação do sobrenadante a 120.000 x g para pellet os exossomos. Os procedimentos de isolamento subsequentes produziram pellets solúveis em PBS enriquecidos com Exo derivado do baço, conforme mostrado na Figura 3G.
Resultados do GDT A morfologia dos exossomos isolados foi examinada usando microscopia eletrônica de transmissão, um método padrão-ouro para estudar a caracterização dos exossomos. O MET é comumente usado para validar a presença de exossomos, avaliar a qualidade dos exossomos e observar a morfologia dos exossomos. As imagens MET (Figura 4A) revelaram a presença de vesículas em forma de taça, que são características dos exossomos. Essas vesículas exibiam uma estrutura clara de bicamada lipídica, confirmando o isolamento bem-sucedido dos exossomos do tecido do baço.
Distribuição de tamanho do Spleen-Exo A distribuição de tamanho e a concentração dos exossomos foram determinadas usando um citômetro de nanofluxo. Os resultados (Figura 4B) indicaram que o diâmetro dos exossomos isolados variou de 30 a 150 nm, com um pico de concentração em aproximadamente 60 nm. O diâmetro das partículas isoladas foi predominantemente de 50-80 nm, com uma concentração média de partículas de 4,6 x 109 partículas/mL. Essa faixa de tamanho é consistente com as características dos exossomos relatadas anteriormente, validando ainda mais o protocolo de isolamento.
Análise de Western blot Para confirmar a presença de marcadores exossômicos, realizamos uma análise de western blot. Os marcadores exossômicos TSG101 e CD9 foram detectados nas amostras de Spleen-Exo, enquanto GM130, uma proteína da matriz de Golgi usada como controle negativo, não foi detectada (Figura 4C). Em comparação, a proteína desses marcadores foi expressa em tecidos do baço de camundongos (Spleen-T). Isso indica a alta pureza dos exossomos isolados, pois eram desprovidos de contaminantes celulares.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig01.jpg"> 
Figura 1: Preparação do insuprimento. (A) Tubos de centrífuga de 50 mL, placas de cultura, gelo e ferramentas cirúrgicas foram colocados em uma cabine de biossegurança. (B) Um filtro de células estéreis (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm). (C) Ferramentas de cirurgia esterilizadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig02.jpg"> 
Figura 2: Procedimento de isolamento Spleen-Exo. Prepare o tecido do baço e corte-o em pequenos pedaços em PBS gelado, seguido de digestão com colagenase tipo I e centrifugação conforme indicado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig03.jpg"> 
Figura 3: Imagens representativas do isolamento Spleen-Exo. (A) Pequenos blocos de baço prontos para digestão subsequente. (B) Blocos de tecido do baço com tampão de digestão. (C) Pellets após centrifugação de 500 x g . (D) Pellets após centrifugação de 3.000 x g . (E) Pellets após centrifugação de 10.000 x g . (F) Pellets após centrifugação de 120.000 x g . (G) Pellets de exossomos após centrifugação de 120.000 x g . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig04.jpg"> 
Figura 4: Identificação de Spleen-Exo. (A) Resultados do MET mostrando partículas isoladas como vesículas membranosas redondas ou ovais com morfologia em forma de taça. Barra de escala = 200 nm e 50 nm, respectivamente. (B) A análise da distribuição de tamanho pelo Flow Nano Analyzer mostrou que o diâmetro do Spleen-Exo variou predominantemente de 50 nm a 80 nm, com uma concentração média de partículas de 4,6 × 109 partículas/mL. (C) Análise de Western blot mostrando expressão de proteínas marcadoras específicas do exossomo (TSG101 e CD9) em Spleen-Exo, com expressão negativa de GM130. Esses marcadores foram detectáveis em amostras de proteínas extraídas de baços de camundongos (grupo Baço-T). As imagens representativas de western blot foram mostradas (n = 6 tecidos). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Isolamento e caracterização de exossomos derivados de tecidos de baço de camundongo

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed ...

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Medicine

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Este vídeo descreve uma técnica simples e que economiza tempo para a dissociação de tecidos automatizado utilizando o Dissociator gentleMACS para preparar uma única célula suspensões de esplenócitos mouse.

Preparação de uma única célula Suspensões de Spleen rato com o Dissociator gentleMACS

Este artigo demonstra métodos para o isolamento, purificação e detecção de exossomos, bem como técnicas para análise de seu conteúdo molecular. Estes métodos são adaptáveis ​​para o isolamento exossomo de ambos os meios de cultura celular e fluidos biológicos, e podem além da análise de conteúdo molecular também ser útil em estudos funcionais.

Isolamento e Caracterização de RNA-Contendo exossomos

Neste artigo, vamos demonstrar o isolamento de murino residente de pulmão de células-tronco mesenquimais (MSC pulmão), sua expansão, caracterização e análise de propriedades imunomoduladores.

Isolamento &amp; Caracterização da Hoechst Baixa CD45 Negativo Mouse Células-Tronco Mesenquimais de pulmão

A presença de microRNAs (miRNAs estáveis) em exossomos gerou enorme interesse como um novo modo de comunicação intercelular, pela sua utilidade potencial como biomarcadores e como uma rota para a intervenção terapêutica. Aqui demonstramos purificação exosome de mídia e cultura de sangue, seguido por PCR quantitativo para identificar os miRNAs sendo transportados.

Purificação e microRNA Profiling de Exosomes derivados do sangue e Meios de Cultura

Técnicas que descrevem um procedimento de gradiente para separar exossomos de partículas do vírus da imunodeficiência humana (HIV) são descritas. Este procedimento foi usado para isolar exossomos de partículas de HIV no plasma humano de indivíduos infectados pelo HIV. Os exossomos isolados foram analisados quanto ao conteúdo de citocinas/quimiocinas.

Isolamento de exossomas a partir do plasma do HIV-1 indivíduos positivos

O líquido biliar é uma fonte valiosa de vesículas/exossomos extracelulares que contêm biomarcadores potencialmente importantes. Este protocolo representa um método robusto para isolar exossomos da bile humana para análises adicionais, incluindo perfis de miRNA.

Isolamento e Caracterização do perfil de exossomas de bílis humana contendo MicroRNA-

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar as células dendríticas de murino baços célula magnética classificando e subsequente transferência adotiva em ratos ingênuos. O modelo de células dendríticas ativadas de elevado-sal foi escolhido para explicar os procedimentos passo a passo de transferência adotiva e citometria de fluxo.

Isolamento e transferência adotiva de sal alta trataram apresentadoras de células dendríticas

Este protocolo ilustra 1) o isolamento e cultura de fibroblastos primários do músculo gastrocnêmio de camundongos adultos, bem como 2) purificação e caracterização de exossomos usando um método de ultracentrifugação diferencial combinado com gradientes de densidade de sacarose seguidos por análises de western blot.

Isolamento e Caracterização de Exossomos de Fibroblastos de Músculo Esquelético

Aqui descrevemos e demonstramos um protocolo para o isolamento da célula endotelial do fígado do camundongo primário (LSEC). O protocolo é baseado na perfusão da colagem hepática, purificação celular não parenquimal por centrifugação de baixa velocidade e seleção de contas magnéticas CD146. Também fenótipo e caracterizamos esses LSECs isolados usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura.

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

Este estudo utiliza citometria de fluxo e duas estratégias diferentes de gating em camundongos isolados com plexos cerebrais coroides; este protocolo identifica os principais subconjuntos de células imunes que povoam essa estrutura cerebral.

Isolamento e Caracterização das Células Imunes de Plexos Choroides de Camundongos Micro-dissecados

Aprenda a isolar exossomos derivados de baço de camundongo usando colagenase tipo I e ultracentrifugação diferencial. Este protocolo preserva a integridade da membrana celular para estudos de doenças cardiovasculares.

Isolamento e caracterização de exossomos derivados de tecidos de baço de camundongo

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