Name: Caracterização abrangente da mineralização tecidual em um modelo ex vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprenda a caracterizar a mineralização tecidual em modelos ex vivo de regeneração óssea usando micro-CT, nanoindentação e espectroscopia Raman. Este método multimodal permite avaliar a formação de novo tecido ósseo com rigor científico.

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<meta charset="utf8"></head><body>Análise multimodal da formação óssea usando modelos de explante

<ol><li>Feroz, S., Cathro, P., Ivanovski, S., Muhammad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+bone+grafts+and+substitutes%3A+A+review+of+recent+advancements+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Adv%22%5BJournal%5D)">Biomimetic bone grafts and substitutes: A review of recent advancements and applications.</a> Biomed Eng Adv. 6, 100107(2023).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP2+activity%2C+although+dispensable+for+bone+formation%2C+is+required+for+the+initiation+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">BMP2 activity, although dispensable for bone formation, is required for the initiation of fracture healing.</a> Nat Genet. 38 (12), 1424-1429 (2006).</li>
<li>Hadjidakis, D. J., Androulakis, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boneremodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Boneremodeling.</a> Ann N Y Acad Sci. 1092, 385-396 (2006).</li>
<li>Boivin, G., Meunier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+degree+of+mineralization+of+bone+tissue+measured+by+computerized+quantitative+contact+microradiography%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tiss+Int%22%5BJournal%5D)">The degree of mineralization of bone tissue measured by computerized quantitative contact microradiography.</a> Calcified Tiss Int. 70 (6), 503-511 (2002).</li>
<li>Boivin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+remodeling+on+the+mineralization+of+bone+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporo+Int%22%5BJournal%5D)">Influence of remodeling on the mineralization of bone tissue.</a> Osteoporo Int. 20 (6), 1023-1026 (2009).</li>
<li>Zanghellini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+analysis+and+comparison+of+stoichiometric+and+structural+characteristics+of+parosteal+and+conventional+osteosarcoma+with+massive+sclerosis+in+human+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Multimodal analysis and comparison of stoichiometric and structural characteristics of parosteal and conventional osteosarcoma with massive sclerosis in human bone.</a> J Str Biol. 216 (3), 108106(2024).</li>
<li>Trento, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((formation+around+two+titanium+implant+surfaces+placed+in+bone+defects+with+and+without+a+bone+substitute+material%3A+A+histological%2C+histomorphometric%2C+and+micro-computed+tomography+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Implant+Dent+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">formation around two titanium implant surfaces placed in bone defects with and without a bone substitute material: A histological, histomorphometric, and micro-computed tomography evaluation.</a> Clin Implant Dent Relat Res. 22 (2), 177-185 (2020).</li>
<li>Palmquist, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiscale+analytical+approach+to+evaluate+osseointegration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci+Mater+Med%22%5BJournal%5D)">A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration.</a> J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).</li>
<li>Budán, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+radiomics+evaluation+of+bone+formation+utilizing+multimodal+%28SPECT%2FX-ray+CT%29+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel radiomics evaluation of bone formation utilizing multimodal (SPECT/X-ray CT) in vivo imaging.</a> PLoS ONE. 13 (9), e0204423(2018).</li>
<li>Hulsart-Billström, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surprisingly+poor+correlation+between+in+vitro+and+in+vivo+testing+of+biomaterials+for+bone+regeneration%3A+results+of+a+multicentre+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cells+Mater%22%5BJournal%5D)">A surprisingly poor correlation between in vitro and in vivo testing of biomaterials for bone regeneration: results of a multicentre analysis.</a> Eur Cells Mater. 31, 312-322 (2016).</li>
<li>Cramer, E. E. A., Ito, K., Hofmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+bone+models+and+their+potential+in+preclinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Osteoporo+Rep%22%5BJournal%5D)">Ex vivo bone models and their potential in preclinical evaluation.</a> Curr Osteoporo Rep. 19 (1), 75-87 (2021).</li>
<li>Chan, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trabecular+bone+explant+model+of+osteocyte-osteoblast+co-culture+for+bone+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A trabecular bone explant model of osteocyte-osteoblast co-culture for bone mechanobiology.</a> Cell Mol Bioeng. 2 (3), 405-415 (2009).</li>
<li>Doke, S. K., Dhawale, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+animal+testing%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Pharma+J%22%5BJournal%5D)">Alternatives to animal testing: A review.</a> Saudi Pharma J. 23 (3), 223-229 (2015).</li>
<li>Moussi, H., et al. New formulation of injectable and degradable calcium phosphate/silanized hyaluronic acid composite foam: Investigation in a rabbit model of long bone defect. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoussi%2C+H+%22SSRN%22">SSRN</a>. , (2024).</li>
<li>Paré, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+and+axially+vascularized+calcium+phosphate-based+implants+for+segmental+mandibular+defects%3A+A+promising+proof+of+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Standardized and axially vascularized calcium phosphate-based implants for segmental mandibular defects: A promising proof of concept.</a> Acta Biomater. 154, 626-640 (2022).</li>
<li>Roschger, P., Fratzl, P., Eschberger, J., Klaushofer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+quantitative+backscattered+electron+imaging+for+the+measurement+of+mineral+density+distribution+in+human+bone+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Validation of quantitative backscattered electron imaging for the measurement of mineral density distribution in human bone biopsies.</a> Bone. 23 (4), 319-326 (1998).</li>
<li>Roschger, P., Plenk, H., Klaushofer, K., Eschberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+scanning+electron+microscopy+approach+to+the+quantification+of+bone+mineral+distribution%3A+backscattered+electron+image+grey-levels+correlated+to+calcium+K+alpha-line+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Micro%22%5BJournal%5D)">A new scanning electron microscopy approach to the quantification of bone mineral distribution: backscattered electron image grey-levels correlated to calcium K alpha-line intensities.</a> Scanning Micro. 9 (1), 75-86 (1995).</li>
<li>Porter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+and+inexpensive+paraffin-embedding+method+for+dynamic+bone+formation+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quick and inexpensive paraffin-embedding method for dynamic bone formation analyses.</a> Sci Rep. 7, 42505(2017).</li>
<li>Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Undecalcified+bone+preparation+for+histology%2C+histomorphometry+and+fluorochrome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis.</a> J Vis Exp. (35), e1707(2010).</li>
<li>Kazanci, M., Roschger, P., Paschalis, E. P., Klaushofer, K., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+osteonal+tissues+by+Raman+spectral+mapping%3A+Orientation-composition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Bone osteonal tissues by Raman spectral mapping: Orientation-composition.</a> J Str Biol. 156 (3), 489-496 (2006).</li>
<li>Unal, M., Ahmed, R., Mahadevan-Jansen, A., Nyman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+assessment+of+bone+by+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Compositional assessment of bone by Raman spectroscopy.</a> Analyst. 146 (24), 7464-7490 (2021).</li>
<li>Oliver, W. C., Pharr, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+technique+for+determining+hardness+and+elastic+modulus+using+load+and+displacement+sensing+indentation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments.</a> J Mater Res. 7 (6), 1564-1583 (1992).</li>
<li>Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+anatomical+study+of+the+human+knee+and+six+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Knee%22%5BJournal%5D)">A comparative anatomical study of the human knee and six animal species.</a> Knee. 19 (4), 493-499 (2012).</li>
<li>Allen, M. J., Houlton, J. E. F., Adams, S. B., Rushton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+anatomy+of+the+stifle+joint+in+Sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Surg%22%5BJournal%5D)">The surgical anatomy of the stifle joint in Sheep.</a> Vet Surg. 27 (6), 596-605 (1998).</li>
<li>Kleuskens, M. W. A., van Donkelaar, C. C., Kock, L. M., Janssen, R. P. A., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+human+osteochondral+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ortho+Res%22%5BJournal%5D)">An ex vivo human osteochondral culture model.</a> J Ortho Res. 39 (4), 871-879 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,20 filtros</td><td>VWR&nbsp;</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de 18 G (1,2x40 mm)</td><td>Sterican</td><td>4665120</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 3</td><td>mL HENKE-JECT</td><td>8300005762</td><td></td></tr><tr><td>37% de ácido clorídrico&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>1.00317.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético (glacial)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A6283&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acetona&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20063-365&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>361186</tr><tr><td>Hidróxido de amónio</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>318612</tr><tr><td>Fosfato tricálcico apático&nbsp;</td><td>Centro de Engenharia Biomédica e de Saúde (Minas Saint Etienne, França)</td><td>TV26U&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Azophloxine</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>210633</tr><tr><td>Peróxido de benzoíla</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>8.01641.0250</td><td></td></tr><tr><td>BMP2</td><td>Medtronic&nbsp;</td><td>InductOs 1,5 mg/mL</td><td></td></tr><tr><td>Croceína Brillant&nbsp;</td><td>Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>2107507</tr><tr><td>CTVox&nbsp;</td><td>Bruker-DataViewer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Lâmina</td> <td>Skyscan-Diamond</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Struers</td><td>MOD13</td><td></td></tr><tr><td>Serra de diamante</td><td>Struers</td><td>Accutom-50</td><td></td></tr><tr><td>DiaPro Mol B3 solução de diamante</td><td>Struers</td><td>40600379</td><td></td></tr><tr><td>DiaPro Nap B1 solução de diamante</td><td>Struers</td><td>40600373</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>102404598</tr><tr><td>Dibutil Ftalato</td><td>Chimie-Plus Laboratoires</td><td>28656</td><td></td></tr><tr><td>Software DragonFly&nbsp;</td><td>ORS</td><td>2022.1.0.1231.&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Águia Modificado (DMEM) de Dulbecco alta glicose, GlutaMAX(TM), piruvato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Eosine Y- Surgipath&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>1002830105</tr><tr><td>Eritrosina B</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>102141057</tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>20820362</tr><tr><td>Eukitt&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>6.00.01.0003.06.01.01</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto férrico hexahidratado (FeCl3, 6H2O)&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>1.03943.0250</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)&nbsp;</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF00</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fucsina</td><td>Merck&nbsp;</td><td>1.05231.0025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solução Salina Balanceada Hank's (HBSS)</td><td>Biosera</td><td>MS01NG100J</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>86.118.9&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Prensa isostática</td><td>Nova Suisse</td><td>Pmax 1500 bar</td><td></td></tr><tr><td>Granulometria de difração a laser</td><td>&nbsp; Malvern</td><td>Mastersizer 3000</td><td></td></tr><tr><td>Prolabo Verde Claro</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>28947135</tr><tr><td>Carbonato de lítio</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A13149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pano de polimento MD-Mol</td><td>Struers</td><td>40500077</td><td></td></tr><tr><td>Metilciclohexano</td><td>VWR&nbsp;</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metilciclohexano&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metilciclohexano&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metilmetacrilato</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>8.00590.2500</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT, micro-scanner&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>Skyscan 1272</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico (NAH2PO4)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>71496</td><td></td></tr><tr><td>Argamassa</td><td>Fritsch&nbsp;</td><td>Pulverisette 6</td><td></td></tr><tr><td>N,N, Dimetilanilina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>803060</td><td></td></tr><tr><td>Estação de nanoindentação</td><td>Anton Paar</td><td>NHT2</td><td></td></tr><tr><td>ND-Nap pano de polimento</td><td>Struers</td><td>40500080</td><td></td></tr><tr><td>OATS Conjunto de sistema de transferência de autoenxerto osteocondral, 4,75 mm</td><td>Arthrex</td><td>AR-1981-04S</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de sistema de transferência de autoenxerto osteocondral OATS, 8 mm</td><td>Arthrex</td><td>AR-1981-08S</td><td></td></tr><tr><td>Laranja G</td><td>Ral</td><td>Paraformaldeído M15</td><td></td></tr><tr><td>(PFA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de embutir descartáveis Peel-a-way</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18646C-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (P/S)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfomolíbdico&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>221856-100 g</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfotúngstico</td><td>Aldrich&nbsp;</td><td>12863-5&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de polir</td><td>Sturers</td><td>Dap V</td><td></td></tr><tr><td>Poupinel</td><td>MEMMERT</td><td>TV26U&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microespectrômetro Raman</td><td>Renishaw</td><td>InVia Qontor</td><td></td></tr><tr><td>Safran du G&acirc; tinais&nbsp;</td><td>Labonord&nbsp;</td><td></td><td></td>11507737</tr><tr><td>Microscópio eletrônico de varredura</td><td>Carl Zeiss</td><td>Evo LS 10</td><td></td></tr><tr><td>SEM</td><td>Zeiss</td><td>Carl Zeiss Evo LS10</td><td></td></tr><tr><td>Folhas de SiC / Papéis de moagem</td><td>Struers</td><td>40400008 (# 320), 40400011 (# 1000), 40400122 (# 2000), 40400182 (# 4000)</td><td></td></tr> <tr><td>Tinta prateada</td><td>Ciências de microscopia eletrônica</td><td>12686-15</td><td></td></tr><tr><td>Stub padrão com copo de Faraday, padrões de carbono, alumínio e silício</td><td>Micro-Analysis Consultants Ltd</td><td>8602</td><td></td></tr><tr><td>T25 frasco</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>VWR&nbsp;</td><td>28975.325</td><td></td></tr><tr><td>Xylidine Ponceau</td><td>Aldrich&nbsp;</td><td>19.976-1&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização abrangente da mineralização tecidual em um modelo ex vivo

Comprehensive Characterization of Tissue Mineralization in an Ex Vivo Model

Uma imagem de micro-TC do explante é mostrada na Figura 2. O uso da segmentação manual não pode separar de forma ideal o osso do cimento, presente no canal central, usando o limiar global. Para melhorar o reconhecimento do osso trabecular e do cimento, propomos o uso de aprendizado profundo. O deep learning é poderoso para reconhecer as características do biomaterial e ajuda a melhorar a separação entre osso e cimento, permitindo uma melhor avaliação das interações cimento-osso. Isso é de extrema importância para quantificar com precisão a quantidade de osso formado na interface com o cimento e não incorporar pixels falsos nesse cálculo.
No entanto, simplesmente quantificar o osso na interface não é suficiente para caracterizar o osso recém-formado. Um estudo mais aprofundado da qualidade da matriz óssea e da composição celular é necessário para entender melhor a resistência do novo osso e os mecanismos celulares que levaram à formação dessa nova matriz. A matriz óssea pode ser caracterizada por meio de duas abordagens complementares: qBEI e microespectroscopia Raman. Um exemplo de uma imagem qBEI é apresentado na Figura 3. Com o qBEI, cada pixel codificado em tons de cinza é transformado em uma concentração de cálcio. Este é um pré-requisito para avaliar a distribuição do teor de cálcio no osso trabecular e para entender (i) o grau de mineralização do osso neoformado na interface com o cimento e (ii) se a presença de cimento interrompe a mineralização do osso trabecular. A vantagem do qBEI é sua capacidade de adquirir uma imagem de alta resolução em um tempo muito curto, ao contrário da microespectroscopia Raman, que requer um tempo de aquisição mais longo. Os parâmetros qBEI, comomédia de Ca,pico de Ca elargura de Ca, podem ser derivados da distribuição de cálcio e usados para comparar a resposta entre dois cimentos ou biomateriais.
Por outro lado, o qBEI não fornece nenhuma informação sobre a qualidade da fase orgânica da matriz óssea na interface com o biomaterial. Informações adicionais sobre as propriedades do material da fase orgânica são derivadas da microespectroscopia Raman. A microespectroscopia Raman é realizada no mesmo espécime usado para qBEI após uma rápida retificação e polimento da superfície para remover a camada condutora de carbono. Na microespectroscopia Raman, os espectros são adquiridos em cada local de pixel. Exemplos de espectros Raman brutos não processados e processados são fornecidos na Figura 4. Cada espectro contém informações sobre a composição do pixel analisado e inclui picos relacionados à resina de incorporação, neste caso, pMMA, a fase mineral, picos v1PO4 e v1CO3, e a fase orgânica, picos Pro, Hyp, CML, Amida III, PG, CH2, Pen. e Amida I. No exemplo da Figura 4, o espectro não tratado mostra a contribuição da resina de revestimento em ~ 812 cm-1 e uma linha de base curva diferente de zero devido à fluorescência, embora um laser vermelho infravermelho próximo seja usado. O processamento do espectro é um pré-requisito para garantir o cálculo preciso dos vários parâmetros Raman, em particular a eliminação da fluorescência de fundo. Ao adquirir dados, o usuário deve garantir o posicionamento preciso e evitar a saturação do detector para confirmar a presença do pico v1PO4 localizado ~960 cm-1. Após o pós-processamento, as taxas de intensidade de pico são calculadas de acordo com a localização do modo vibracional característico.
No entanto, é questionável se as mudanças na composição do material levaram a mudanças na resposta biomecânica. Para coletar informações sobre a biomecânica do osso recém-formado, realizamos sistematicamente investigações de nanoindentação na mesma amostra usada para microespectroscopia Raman. As informações mecânicas dos tecidos são obtidas a partir de curvas de nanoindentação representadas por curvas de carga versus profundidade (Figura 5). Vale ressaltar que a profundidade não volta a zero no final do ensaio, representando a deformação plástica e os danos permanentes criados ao material. A taxa de fluência de recuo é derivada da curva de profundidade versus tempo.
Finalmente, a coloração histológica é usada para avaliar a resposta do tecido ao biomaterial no nível celular (Figura 6). As colorações histológicas propostas permitem determinar a presença de tecido osteóide, mas também a identificação de células (macrófagos, células gigantes multinucleadas, osteoclastos, osteoblastos) e a possível presença de uma cápsula fibrosa na interface com o biomaterial. Isso é muito importante para entender a biocompatibilidade de um biomaterial, mas também a persistência de novo osso quando o biomaterial é degradado.
No geral, a abordagem multimétodo permite um estudo aprofundado da formação óssea, da qualidade do osso recém-formado e da composição celular. Quando realizadas na ordem sequencial proposta, todas as investigações podem ser realizadas na mesma amostra, reduzindo o custo e o tempo de processamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig01.jpg"> Figura 1: Resumo gráfico. Um resumo das etapas do protocolo é fornecido aqui. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig02.jpg"> Figura 2: Análises de micro-CT e deep learning. (A) Reconstrução 3D de imagens de micro-CT. (B) Segmentação óssea e de cimento: comparação entre segmentação manual e deep learning. Barra de escala = 5 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig03.jpg"> Figura 3: Imagem eletrônica retroespalhada quantitativa para determinar o teor de cálcio. (A) A imagem retroespalhada composta de níveis de cinza obtidos na microscopia eletrônica de varredura (SEM) é convertida pelo software de análise de imagem em (B) um mapa de cálcio mostrando os pontos quentes da amostra óssea. (C) A distribuição do conteúdo de cálcio versus área óssea é plotada e os três principais parâmetros qBEI, Camean, Capeak elargura de Ca, são calculados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig04.jpg"> Figura 4: Exemplo de espectros Raman. (A) Espectro Raman bruto não processado obtido na faixa espectral de 800 a 1800 cm-1. O fundo de fluorescência é claramente visível, pois os espectros não começam em 0. A contribuição da resina (pMMA) é claramente visível em ~ 812 cm-1. (B) Espectro processado. A posição dos diferentes modos vibracionais de interesse é indicada no espectro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig05.jpg"> Figura 5: Investigação das propriedades mecânicas do tecido por nanoindentação. (A) O dispositivo de nanoindentação é composto por uma parte óptica usada para definir a localização da região de interesse na superfície do bloco de amostra e, em seguida, o bloco é traduzido sob a parte de indentação. (B) Carga versus tempo e profundidade versus tempo são plotados durante o teste de indentação e são usados para gerar o (C) curva carga versus profundidade. Neste exemplo, a profundidade escolhida foi fixada em 400 nm. A carga máxima (Lm), a profundidade no final do carregamento (hl), a profundidade após o período de pausa (hm), a inclinação do segmento de descarga (S) e a área sob a fase de carga-descarga do teste (Wplast) são derivadas da curva de carga versus profundidade e são usadas para calcular os diferentes parâmetros de nanoindentação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig06.jpg"> Figura 6: Análise histológica dos explantes osteocondrais tratados com cimento após 28 dias de cultivo. (A) A coloração Movat demonstra a estrutura do tecido, incluindo o osso e o cimento preenchendo o defeito. (B) A coloração HES ilustra a integração do tecido e a resposta celular ao redor do cimento. Barra de escala: 2,5 mm. (C) Ampliação da área destacada em (B), que detalha a interface entre o cimento e o tecido circundante, onde as células podem ser observadas invadindo o cimento. Barra de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Caracterização abrangente da mineralização tecidual em um modelo ex vivo

The extensive characterization of tissue mineralization in the context of bone regeneration represents a significant challenge, given the numerous ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Aprenda a caracterizar a mineralização tecidual em modelos ex vivo de regeneração óssea usando micro-CT, nanoindentação e espectroscopia Raman. Este método multimodal permite avaliar a formação de novo tecido ósseo com rigor científico.

Caracterização abrangente da mineralização tecidual em um modelo ex vivo

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