Name: Modelando o glicocálice endotelial pós-pneumonectomia em um chip fluídico 3D - uma abordagem para fabricar um sistema organo-on-chip baseado em vascular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Aprenda a construir um sistema organ-on-chip vascular para modelar o glicocálice endotelial pós-pneumonectomia. Este método biomimético permite investigar a relação entre danos ao glicocálice e complicações cirúrgicas.

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A pneumonectomia é uma intervenção cirúrgica invasiva e de alto risco realizada para extração do pulmão direito ou esquerdo1. Este procedimento é normalmente utilizado como uma opção de tratamento para várias doenças graves, como câncer de pulmão, tuberculose pulmonar e lesões pulmonares traumáticas2. Embora o procedimento seja promissor, ele apresenta riscos significativos, destacados pelo aumento das taxas de complicações pós-operatórias, variando de arritmias a edemas pulmonares1.
As pneumonectomias têm um impacto profundo na dinâmica cardiovascular, direcionando todo o débito cardíaco do coração para o pulmão remanescente3. Sabe-se que esse redirecionamento do fluxo sanguíneo aumenta a pressão e as tensões de cisalhamento dentro da vasculatura pulmonar remanescente4. Com essas vastas alterações nos padrões de fluxo sanguíneo, o glicocálice endotelial (GCX) desempenha um papel fundamental na detecção dessas mudanças nos padrões de fluxo sanguíneo5.
O GCX é uma camada gelatinosa que regula as atividades bioquímicas em resposta a mudanças em seu ambiente 6,7. Sua expressão demonstrou aumentar com a exposição prolongada ao fluxo uniforme e diminuir com a exposição ao fluxo perturbado em comparação com a cultura estática 8,9. O GCX exibe uma espessura variável variando de 0,1-1 μm em toda a vasculatura e funciona como uma camada essencial de mecanotransdução que reveste as células endoteliais dos vasos sanguíneos10. A rede é composta por uma densa camada de açúcares, lipídios e proteínas, conforme mostrado na Figura 1. Esses açúcares se ligam para formar glicanos, que podem existir livremente na corrente sanguínea ou ligados a proteínas ou lipídios, resultando na formação de proteoglicanos, glicoproteínas ou glicolipídios 7,11. Os proteoglicanos são compostos por cadeias de glicosaminoglicanos (GAG), que se ligam à membrana celular por meio de proteínas ou receptores plasmáticos. Esses GAGs incluem sulfato de heparano (HS), ácido hialurônico (HA), sulfato de condroitina (CS), sulfato de dermatano e sulfato de queratana12. O sulfato de heparano é o GAG predominante, representando mais de 50% do total de GAGs encontrados no GCX. Essas cadeias laterais podem se ligar a proteínas centrais incorporadas, que incluem glipicanos (ancorados por glicosilfosfatidilinositol) e sindecanos (com um domínio que atravessa a membrana), juntamente com CD44 (um receptor de adesão de superfície). Os complexos descritos acima desempenham um papel crucial na regulação dos fatores de crescimento, reações anti-inflamatórias, facilitando a dilatação dos vasos e controlando a permeabilidade vascular13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67246/67246fig1v2.jpg"> 
Figura 1: Diagrama de componentes GCX. Esquema representando os componentes do glicocálice endotelial. Este esquema exibe o glicocálice apical, que é encontrado no lúmen do vaso, mostrando seus proteoglicanos e glicoproteínas ligados à membrana. Criado com BioRender.com <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67246/67246fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Embora a conexão precisa entre pneumonectomias e danos ao GCX não seja bem estudada, existe uma correlação plausível entre os padrões de fluxo sanguíneo alterados induzidos por pneumonectomias e a integridade do GCX. Sabe-se que o fluxo sanguíneo perturbado na vasculatura inflige danos ao GCX6. Nossa hipótese é que o aumento do fluxo perturbado e as mudanças no estresse de cisalhamento na vasculatura remanescente após uma pneumonectomia podem causar danos ao GCX ao longo do tempo. Essa deterioração acelerada pode catalisar complicações e morbidades pós-operatórias, aumentando os riscos inerentes à saúde geral do paciente13.
Esse protocolo teve como objetivo modelar a vasculatura pulmonar após a pneumonectomia, seguindo o procedimento geral descrito na Figura 2. Simulações de fluidos foram conduzidas em um modelo de design auxiliado por computador replicando a vasculatura pulmonar humana com e sem pneumonectomia. Os modelos de pneumonectomia foram criados projetando a vasculatura pulmonar 3D em software de modelagem 3D, com base em dimensões derivadas de tomografias computadorizadas e dados da literatura, simplificando-os ainda mais para simulações de fluxo em software de dinâmica de fluidos computacional (CFD). As simulações identificaram áreas específicas de interesse, escolhidas por áreas onde a tensão de cisalhamento foi aumentada nos modelos de pneumonectomia quando comparados ao controle. Essas áreas de interesse foram escolhidas para replicar para a construção de um modelo in vitro . O modelo in vitro utilizou um desenho de câmara fluídica para simular múltiplas seções da vasculatura com geometria normal e geometria de pneumonectomia para simular a diferença nas condições de fluxo.
Células endoteliais microvasculares de pulmão humano (HLMVECs) foram cultivadas em substratos de polidimetilsiloxano revestidos com fibronectina (PDMS), moldados para imitar uma região de bifurcação selecionada. Os meios de cultura de células endoteliais microvasculares foram perfundidos através do sistema usando uma bomba peristáltica. Finalmente, as células e o GCX foram fixados, imunomarcados com um anticorpo de coloração GCX e visualizados usando um microscópio fluorescente para avaliar sua condição após a exposição ao fluxo de fluido. Uma linha do tempo geral do protocolo pode ser encontrada na Tabela 1.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67246/67246fig2.jpg"> 
Figura 2: Sequência de desenvolvimento OOC. Sequência do desenvolvimento de um novo sistema OOC para estudar os efeitos da pneumonectomia pulmonar (1) Tomografia computadorizada gerada da vasculatura pulmonar humana. (2) Geometria de tomografia computadorizada usada para identificar regiões de interesse para o modelo CAD 3D. (3) Simulações de escoamento de fluidos para determinação de geometrias de interesse para o modelo in vitro . (4) Molde PDMS modelado contendo áreas de interesse dos resultados da simulação (5) Molde inserido em caixa de acrílico para fixar o molde para perfusão (6) Configuração concluída da câmara de fluxo (7) Configuração completa da câmara de fluxo transferida para a incubadora (8) Imagens de campo claro e fluorescentes tiradas após exposição à tensão de cisalhamento. Criado com BioRender.com <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67246/67246fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Cronograma geral do protocolo. Sequência geral de etapas de execução dentro do protocolo com duração média (h) de cada etapa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67246/Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

<table><tbody><tr><td># 8-32 x 3/4 pol. Parafuso de Máquina Zincado de Cabeça Redonda Combo (Pacote com 8)</td><td>Everbilt</td><td>204274613</td><td>-</td></tr><tr><td>0,25% EDTA-tripsina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cônico de 15mL</td><td>Thermo Científico</td><td>12-565-269</td><td>-</td></tr><tr><td>Prato 35x10mm, Nunclon Delta</td><td>Thermo Científico</td><td>153066</td><td>-</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de polipropileno estéril cônico de 50mL</td><td>Thermo Científico</td><td>12-565-271</td><td>-</td></tr><tr><td>Rolhas de borracha variadas</td><td>Marca de pescador</td><td>14-132</td><td></td></tr><tr><td>Frascos tratados com cultura de células BioLite (25 cm ^ 2)</td><td>Thermo Científico</td><td>12-556-009</td><td>-</td></tr><tr><td>Frascos tratados com cultura de células BioLite (75 cm ^ 2)</td><td>Thermo Científico</td><td>12-556-010</td><td>-</td></tr><tr><td>COMSOL Multifísica</td><td>COMSOL</td><td>N/A</td><td>-</td></tr><tr><td>Adesivo de dupla face&nbsp;</td><td>3M</td><td>16758005</td><td>-</td></tr><tr><td>Tampa de Vidro Científica Richard-Allan da Epredia&nbsp;</td><td>Thermo Científico</td><td>22-050-218</td><td>-</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>A5256701&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>33016015&nbsp;</td><td>20 &mu; Diluição g/mL</td></tr><tr><td>Banhos-maria de controle digital Fisherbrand Isotemp: Modelo 210</td><td>Marca de pescador</td><td>15-462-10Q</td><td>-</td></tr><tr><td>Seringa Estéril Fisherbrand (60mL)</td><td>Marca de pescador</td><td>14-955-461</td><td>-</td></tr><tr><td>Células endoteliais microvasculares do pulmão humano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>540-05A&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Microscópio Fluorescente Keyence BZX810</td><td>Keyence</td><td>N/A</td><td>-</td></tr><tr><td>Kit de Elastômetro de Silicone Krayden Dow Sylgard 184. Claro, (1,1 LB)</td><td>Dow</td><td>4019862</td><td>-</td></tr><tr><td>Folha de acrílico fundido Marga Cipta 1/2' de espessura, 48x96'</td><td>Marga Cipta</td><td>N/A</td><td>-</td></tr><tr><td>Cabeça de Bomba Masterflex L/S Easy-Load II</td><td>MasterFlex</td><td>77200-50</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação de Bomba de Precisão Masterflex L/S, Silicone Curado com Platina, L/S 16; 25 pés</td><td>MasterFlex</td><td>96410-16</td><td>-</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica padrão Masterflex L/S</td><td>Masterflex</td><td>07522-20</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta 0,2 a 2 &mu; L</td><td>Marca de pescador</td><td>FBE00002</td><td>-</td></tr><tr><td>Micropipeta 10 a 100 &mu; L</td><td>Marca de pescador</td><td>FBE00100</td><td>-</td></tr><tr><td>Micropipeta 100 a 1000 &mu; L</td><td>Marca de pescador</td><td>FBE01000</td><td>-</td></tr><tr><td>Micropipeta 5 a 50 &mu; L</td><td>Marca de pescador</td><td>FBE00050</td><td>-</td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Células Endoteliais Microvasculares (500ml)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>111-500</td><td>-</td></tr><tr><td>Filtros de seringa estéreis Nalgene</td><td>Thermo Científico</td><td>725-2520</td><td>-</td></tr><tr><td>Microscópio Fluorescente Nikon Eclipse TS-100</td><td>Nikon</td><td>NI-TS100</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (DPBS, 10X), fórmula de Dulbecco</td><td>Thermo Científico</td><td>J61917. K3</td><td>-</td></tr><tr><td>Prusament PLA Prusa Galaxy Preto 1kg</td><td>Prusa</td><td>PRM-PLA-GLX-1000</td><td>-</td></tr><tr><td>Microscópio híbrido rebelde, vertical e invertido, descubra o eco</td><td>ECO</td><td>76376-746</td><td>-</td></tr><tr><td>Selante de Silicone</td><td>Loctite</td><td>908570</td><td>-</td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>Dassault Systèmes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas descartáveis de poliestireno estéril com lupa (10mL)</td><td>Marca de pescador</td><td>13-678-11E</td><td>-</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas descartáveis de poliestireno estéril com lupa (25mL)</td><td>Marca de pescador</td><td>13-678-11</td><td>-</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas descartáveis de poliestireno estéril com lupa (50mL)</td><td>Marca de pescador</td><td>13-678-11F</td><td>-</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas descartáveis de poliestireno estéril com lupa (5mL)</td><td>Marca de pescador</td><td>13-678-11D</td><td>-</td></tr><tr><td>Estreptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugado</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>S32354</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugado</td><td>Invitrogen</td><td>S32354</td><td>-</td></tr><tr><td>Reservatório de seringas</td><td>BD</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Alfa Aesar 1LT Albumina, Bovino, Fração V, 35% soln., Grau de Reagente, Livre de Ácidos Graxos, com azida como preservati</td><td>Thermo Científico</td><td>N12H004</td><td>-</td></tr><tr><td>Conectores de tubulação</td><td>Marca de pescador</td><td>01-000-161</td><td>-</td></tr><tr><td>Meio de Montagem Anti-desbotamento VECTASHIELD com DAPI&nbsp;</td><td>Vectashield</td><td>H-1200-10</td><td>-</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 revestida de água VWR</td><td>Avantar&nbsp;</td><td>10810-744</td><td>-</td></tr><tr><td>Anticorpo biotinilado WGA</td><td>Vetor</td><td>B-1025</td><td>-</td></tr></tbody></table>

modelando o glicocálice endotelial pós-pneumonectomia em um chip fluídico 3d - uma abordagem para fabricar um sistema organo-on-chip baseado em vascular

Modeling the Endothelial Glycocalyx Post-Pneumonectomy in a 3D Fluidic Chip - An Approach to Fabricating a Vascular-based Organ-on-Chip System

Os resultados do estudo de simulação de fluido em estado estacionário de fluxo laminar mostraram um aumento na tensão de cisalhamento em certas bifurcações nos modelos de pneumonectomia quando comparados ao modelo controle, mostrado na Figura 11. Visualizadas na etapa 2.8 do protocolo, as áreas vermelhas denotam áreas de alta tensão de cisalhamento, enquanto as áreas azuis mostram áreas de baixa tensão de cisalhamento.
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Modelando o glicocálice endotelial pós-pneumonectomia em um chip fluídico 3D - uma abordagem para fabricar um sistema organo-on-chip baseado em vascular

Endothelial glycocalyx (GCX), a carbohydrate-rich layer coating the luminal surface of endothelial cells, plays a pivotal role in regulating cellular ...

modeling-endothelial-glycocalyx-post-pneumonectomy-3d-fluidic-chip-an

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Câmaras de fluxo microfluídicos gravados por fotolitografia e fabricada a partir de PDMS são aplicados para sondar os resultados funcionais associados com disfunção CE e inflamação. Numa experiência representativa, a capacidade de tensão de cisalhamento diferencial para modular a adesão celular monocítica a citocina activado CE monocamadas é demonstrada.

On-Chip fenotipagem endotelial Inflamatória

Uma plataforma de microcanais-on-a-chip foi desenvolvido pela combinação da técnica fotolitográfica refluído fotossensível, litografia macia, e microfluidos. A plataforma de microcanais reendotelizados imita a geometria tridimensional (3D) de microvasos in vivo, é executado sob fluxo de perfusão contínua controlada, permite a imagem de alta qualidade e em tempo real, e pode ser aplicado para a pesquisa microvascular.

Procedimento para o Desenvolvimento da Multi-profundidade Circular transversal reendotelizados microcanais-on-a-chip

Este protocolo descreve a implementação da degradação de hidrogel baseada em laser guiada por imagem para fabricar redes microfluídicas biomiméticas derivadas de vasculares incorporadas em hidrogéis de poli(etilenoglicol) diacrilato (PEGDA). Esses sistemas microfluídicos biomiméticos podem ser úteis para aplicações de engenharia de tecidos, geração de modelos de doenças in vitro e fabricação de dispositivos avançados "on-a-chip".

guiado por imagem, fabricação à base de laser de Redes microfluídicos Vascular derivadas

Aqui, apresentamos um protocolo que descreve a fabricação do stretchable, dual channel, dispositivos de cultura de célula órgão microplaqueta microfluidic para recapitulando a funcionalidade de nível de órgão em vitro.

Fabricação escalável de Stretchable, Dual Channel, órgão Microfluidic Chips

O objetivo deste protocolo é bioimprimir diretamente as células epiteliais mamárias como esferoides multicelulares em redes endoteliais pré-formadas para criar rapidamente modelos de cocultura 3D de mama endotelial que podem ser usados para estudos de triagem de medicamentos.

Bioimpressão direta de esferoides de mama multicelular 3D em redes endoteliais

Aqui, fornecemos um chip microfluido e um sistema microfluido de circulação de circulação automaticamente controlado e altamente eficiente que recapitula o microambiente inicial da neovascularização, permitindo que as células endoteliais (CE) sejam estimuladas pelo alto estresse da cisalhamento luminal, nível fisiológico de fluxo transendelial e distribuição de vários fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF) simultaneamente.

Modelo microfluido para imitar evento inicial de neovascularização

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de pele simplificado e indiferenciado tridimensional usando uma plataforma microfluida micromaquinda. Uma abordagem de fluxo paralelo permite a deposição in situ de um compartimento dérmico para a semeadura de células epiteliais em cima, todas controladas por bombas de seringa.

Geração de um modelo simplificado de pele em um chip tridimensional em uma plataforma microfluida micromaquinda

O objetivo deste protocolo é explicar e demonstrar o desenvolvimento de um modelo microfluido tridimensional (3D) de tecido cardíaco humano altamente alinhado, composto por cardiomiócitos derivados de células-tronco co-cultivados com fibroblastos cardíacos (CFs) dentro de um hidrogel biomimético, à base de colágeno, para aplicações em engenharia de tecido cardíaco, triagem de medicamentos e modelagem de doenças.

Desenvolvimento de tecido cardíaco humano organizado 3D dentro de uma plataforma microfluida

O presente protocolo descreve as capacidades e as modalidades de cultura essenciais do Open-Top Organ-Chip para o estabelecimento e maturação bem-sucedidos de culturas organ-on-chip de espessura total de tecidos primários (pele, alvéolo, vias aéreas e intestino), proporcionando a oportunidade de investigar diferentes aspectos funcionais da interface epitelial/mesenquimal e vascular humana in vitro.

Reconstituindo a citoarquitetura e a função de tecidos epiteliais humanos em um chip de órgão de topo aberto

Os modelos de pulmão em chip superam as culturas 2D tradicionais, imitando a interface ar-líquido e a perfusão de células endoteliais, simulando o fluxo sanguíneo e a troca de nutrientes cruciais para estudos de fisiologia pulmonar. Isso aumenta a relevância da pesquisa pulmonar, oferecendo um ambiente dinâmico e fisiologicamente preciso para avançar na compreensão e no tratamento de infecções respiratórias.

Modelo Alveolus-on-Chip Imunocompetente para Estudo das Respostas Imunes da Mucosa Alveolar

Apresentamos um protocolo para produção de alto rendimento de canais vasculares com tamanhos flexíveis e padrões desejados em uma placa padrão de seis poços usando a tecnologia de bioimpressão 3D, conhecida como vasos em uma placa (VOP). Esta plataforma tem o potencial de avançar no desenvolvimento de terapêuticas para os distúrbios associados ao endotélio comprometido.

Método de bioimpressão de alto rendimento para modelagem da permeabilidade vascular em placas padrão de seis poços com flexibilidade de tamanho e padrão

Aprenda a construir um sistema organ-on-chip vascular para modelar o glicocálice endotelial pós-pneumonectomia. Este método biomimético permite investigar a relação entre danos ao glicocálice e complicações cirúrgicas.

Modelando o glicocálice endotelial pós-pneumonectomia em um chip fluídico 3D - uma abordagem para fabricar um sistema organo-on-chip baseado em vascular (Vídeo) | JoVE Journal

Modelando o glicocálice endotelial pós-pneumonectomia em um chip fluídico 3D - uma abordagem para fabricar um sistema organo-on-chip baseado em vascular

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