Modelando o glicocálice endotelial pós-pneumonectomia em um chip fluídico 3D - uma abordagem para fabricar um sistema organo-on-chip baseado em vascular

O Mensah Lab está focado na pesquisa vascular e está desenvolvendo novas técnicas para pesquisar o glicocálice endotelial e seu papel na doença vascular. Desenvolvimentos recentes envolvem a criação de modelos in vitro mais avançados para pesquisa de glicocálice e pesquisa de estratégias terapêuticas para direcionar a saúde do glicocálice endotelial e o reparo de doenças. Os desafios experimentais incluem modelos in vitro incompletos, que não conseguem replicar com precisão o glicocálice saudável, bem como técnicas difíceis de quantificação e medição.

Nossa contribuição atual para o campo expandiu a compreensão atual do glicocálice endotelial, particularmente em seu papel na metástase do câncer, regeneração do glicocálice danificado e interações com receptores de superfície vascular. Nosso método apresenta um método barato e eficaz para a criação de sistemas vasculares organ-on-a-chip que expressam glicocálice endotelial mais bem desenvolvido e biomimético em comparação com as técnicas convencionais. Para começar, pesar 10 partes de base de elastômero de silicone em um tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Despeje uma parte do agente de cura no tubo que contém a base de elastômero de silicone até um volume final de 30 mililitros. Misture bem para obter uma solução uniforme. Agora despeje a solução bem misturada nos moldes e, em seguida, coloque os moldes em uma câmara de vácuo para desgaseificar o PDMS por 30 a 60 minutos ou até que não haja bolhas.

Remova o PDMS desgaseificado da câmara de vácuo e deixe-o curar à temperatura ambiente por 48 horas. Extraia o PDMS curado do molde de PLA. Em seguida, coloque dois pedaços de fita dupla-face em cada placa de cultura de células.

Em seguida, posicione cada metade da vasculatura PDMS em cima da fita em sua própria placa de cultura de células. Coloque várias gotas de 30 microlitros de fibronectina ao longo da vasculatura do PDMS usando uma micropipeta. Incline o PDMS conforme necessário e use uma ponta de pipeta para revestir uniformemente a superfície.

Após uma incubação de 30 minutos, aspire a solução de fibronectina do PDMS. Em seguida, deixe as peças secarem ao ar dentro do gabinete. Coloque plugues impressos em 3D em cada extremidade das metades da vasculatura do PDMS para evitar vazamento na suspensão da célula, usando dois plugues por peça.

Com uma micropipeta, semeie 300 microlitros de suspensão de células HLMVEC em cada peça de PDMS e incuba. Em seguida, retorne as metades ao gabinete e remova os quatro plugues. Adicione o meio de cultura HLMVEC para submergir as metades da vasculatura do PDMS e incube novamente por seis a 10 horas.

Agora aspire o meio HLMVEC da placa de Petri contendo as metades da vasculatura. Coloque cada metade do PDMS nos blocos de policarbonato, garantindo o alinhamento adequado. Aplique selante de silicone nas extremidades da vasculatura PDMS.

Insira o tubo de uma polegada de comprimento em ambas as extremidades da peça PDMS inferior. Em seguida, vire o bloco de acrílico superior contendo a metade superior do PDMS no bloco de acrílico inferior. Aparafuse os blocos de acrílico, garantindo que o bloco rosqueado esteja na parte inferior.

Conecte as extremidades livres da tubulação usando plugues impressos em 3D. Remova um tampão e injete suavemente 500 microlitros de meio de cultura HLMVEC na vasculatura usando uma micropipeta. Incline para remover as bolhas de ar e, em seguida, recoloque o plugue.

Traga o chip montado e os componentes estéreis para o gabinete de biossegurança. Conecte toda a tubulação e monte o sistema de fluxo, garantindo que a tubulação de entrada se conecte ao fundo do reservatório da seringa para facilitar o fluxo por gravidade. Agora, prepare suavemente o sistema de fluxo com meio HLMVEC.

Use uma pipeta sorológica de 50 mililitros. Injete 30 mililitros de meio na parte superior do reservatório da seringa e opere a bomba peristáltica em baixa velocidade para encher a tubulação. Lave cada metade da vasculatura PDMS em PBS por cinco minutos, adicionando solução suficiente para submergir totalmente a seção vascular.

A simulação de fluidos mostrou tensão de cisalhamento significativamente elevada nas bifurcações dos vasos no modelo de pneumonectomia em comparação com o modelo de controle. A microscopia de campo claro confirmou a ligação uniforme das células HLMVEC em condições estáticas e de fluxo a 93,1 mililitros por minuto após 24 horas. A imagem de fluorescência da bifurcação de entrada mostrou camadas celulares intactas e bem distribuídas nos modelos de controle e pneumonectomia.

A imagem imediatamente após a segunda bifurcação revelou perda celular substancial nos modelos controle e pneumonectomia. As células permaneceram aderentes e apresentaram coloração consistente na região a jusante da segunda bifurcação em ambos os modelos. Núcleos uniformes corados com DAPI nos modelos vasculares indicaram que a confluência foi mantida apesar da exposição ao fluxo.

Um teste de modelo de controle inicial resultou em distribuição celular desigual devido a bolhas de ar introduzidas durante a preparação do sistema.