Name: Quantificação de genomas virais adeno-associados em amostras de vetores purificados por reação em cadeia da polimerase por gotículas digitais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 43 s
Description: Aprenda a quantificar genomas de vírus adeno-associados usando ddPCR para terapia gênica. Este protocolo validado padroniza a titulação de vetores AAV, oferecendo maior precisão e confiabilidade em aplicações clínicas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo padronizado para quantificação do genoma viral usando PCR digital de gotículas

<ol><li>Balakrishnan, B., Jayandharan, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+biology+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+used+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Basic biology of adeno-associated virus (AAV) vectors used in gene therapy.</a> Curr Gene Ther. 14 (2), 86-100 (2014).</li>
<li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tissue-tropism+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">In vivo tissue-tropism of adeno-associated viral vectors.</a> Curr Opin Virol. 21, 75-80 (2016).</li>
<li>Pupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors%3A+The+Rubik%27s+cube+of+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy.</a> Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).</li>
<li>Gimpel, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+process+and+product+characterization+of+recombinant+adeno-associated+virus-based+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for process and product characterization of recombinant adeno-associated virus-based gene therapies.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 20, 740-754 (2021).</li>
<li>Brimble, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+packaging+of+translatable+P5-associated+DNA+contaminants+in+recombinant+AAV+vector+preps%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Preventing packaging of translatable P5-associated DNA contaminants in recombinant AAV vector preps.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 24, 280-291 (2022).</li>
<li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product-related+impurities+in+clinical-grade+recombinant+AAV+vectors%3A+Characterization+and+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Product-related impurities in clinical-grade recombinant AAV vectors: Characterization and risk assessment.</a> Biomedicines. 2 (1), 80-97 (2014).</li>
<li>Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDobnik%2C+D+%22Front+Microbiol%22">Front Microbiol</a>. 10, (2019).</li>
<li>Sidransky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ras+oncogene+mutations+in+the+stool+of+patients+with+curable+colorectal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors.</a> Science. 256 (5053), 102-105 (1992).</li>
<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Anal Chem. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li>
<li>Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+digital+droplet-based+AAV+genome+titration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration.</a> Methods Mol Biol. 1950, 51-83 (2019).</li>
<li>Bio-Rad Laboratories Inc. Planning droplet digital PCR experiments. , 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/en-in/life-science/learning-center/introduction-to-digital-pcr/planning-ddpcr-experiments">https://www.bio-rad.com/en-in/life-science/learning-center/introduction-to-digital-pcr/planning-ddpcr-experiments</a> (2024).</li>
<li>Dorange, F., Le Bec, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+approaches+to+characterize+AAV+vector+production+%26+purification%3A+Advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Ther+Insights%22%5BJournal%5D)">Analytical approaches to characterize AAV vector production & purification: Advances and challenges.</a> Cell Gene Ther Insights. 4 (2), 119-129 (2018).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Prantner, A., Maar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+concentration%2C+characterization%2C+and+integrity+analysis+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+using+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR.</a> PLoS One. 18 (1), e0280242(2023).</li>
<li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Front Microbiol. 10, 1570(2019).</li>
<li>Suoranta, T., Laham-Karam, N., Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+accurate+titration+of+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for accurate titration of adeno-associated virus vectors.</a> Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1270-1279 (2021).</li>
<li>Bio-Rad. Droplet digital PCR applications guide. Bulletin 6407. , 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf</a> (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>pipeta de 8 canais 10 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,010</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de 8 canais 200 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,036</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de 8 canais 300 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,052</td><td></td></tr><tr><td>Tira de PCR de 8 poços</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler com 96&ndash; Módulo de Reação a Poços Profundos</td><td>Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Controle de Tampão para Sondas 9 mL (2 x 4,5 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix para Sondas (Sem dUTP) (2 x 1 mL)</td><td>Placas Bio-Rad</td><td>1863023</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR de 96 Poços (pacote de 25)</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Óleo de Leitor de Gotículas (2 x 1L)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>Porta-cartuchos DG8</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>Cartuchos DG8 para QX200/QX100 (pacote de 24)</td><td>Juntas Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 para QX200/QX100 (pacote de 24)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (10U/&micro; L) + tampão</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de Geração de Gotículas para Sondas (10 x 7 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Ponta do Filtro, 0.1-10 &mu; L, 34 mm, Rack, PCR Clean, ESTÉREIS&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078500</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Ponta de Filtro, 20-300 &mu; L, 55 mm, Rack, PCR Clean, ESTÉREIS&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078560</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Ponta de Filtro, 2-100 &mu; L, 53 mm, Rack, PCR Clean, ESTÉREIS&nbsp;</td>Primers liofilizados <td>Eppendorf</td><td>30078543</td><td></td></tr><tr><td>Forward e respectivos estoques mestres a 100 mM&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GFP como sequência de destino. Primer direto: 5'-GAACGGCATCAAGGTGAACT-3'Sonda</td></tr> <tr><td>lyopohilizada e estoque mestre a 100 &micro; M&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GFP como sequência de destino. Sonda Eco PrimeTime: /56-FAM/CAAGATCCG/ZEN/CCACAACATCGAGGA/3IABkFQ/</td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio (MgCl2)</td><td>Chemlab Analytical</td><td>CL00.1381</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>IDT</td><td>11-04-02-01</td><td></td></tr><tr><td>Placa de PCR Heat Seal, folha, perfurável (pacote de 100)</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-68 surfactante não iônico (100x)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24040032</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio (KCl)</td><td>Produtos químicos de pesquisa Honeywell</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>Software gerenciador QX</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Software para analisar dados de ddPCR</td></tr><tr><td>Gerador de gotículas QX200 Leitor de gotículas</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Reservatório</td> de reagente <td>de 1864003</td><td></td><td>Bio-Rad</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>613-1181</td><td></td></tr><tr><td>Primers liofilizados reversos e respectivos estoques mestres a 100 mM&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GFP como sequência de destino. Primer reverso: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'Tubo</td></tr> de <tr><td>reação SafeSeal, 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.200</td><td></td></tr><tr><td>DNA de esperma de salmão, cortado (10 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>TE tampão</td><td>IDT</td><td></td><td>Acompanhado de primers ao solicitar</td></tr><tr><td>cloridrato de Tris (Tris-HCl)</td><td>Roche</td><td>10812846001</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação de genomas virais adeno-associados em amostras de vetores purificados por reação em cadeia da polimerase por gotículas digitais

Quantification of Adeno-Associated Viral Genomes in Purified Vector Samples by Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Os resultados podem ser visualizados usando o software apropriado. Para cada poço, o gráfico de amplitude 1D exibe todas as gotículas relativas à sua amplitude. Espera-se uma separação clara entre gotículas positivas e negativas. Se mais de 10% do total de gotículas forem encontradas entre as nuvens de gotículas positivas e negativas (um fenômeno conhecido como chuva de gotículas), é necessário medir novamente a amostra (ver Figura 1). Informações adicionais sobre chuva de gotículas estão disponíveis na discussão.
Uma tabela de dados pode ser criada para resumir todas as informações registradas, incluindo o nome da amostra, número de gotículas aceitas (contagens de eventos) e concentração (cópias/μL). Idealmente, a contagem de eventos deve ficar entre 15.000 e 20.000 gotículas aceitas. Se a contagem de eventos para um poço estiver abaixo de 10.000, o ponto de dados deverá ser excluído da análise. Um exemplo dos dados de saída é fornecido na Tabela 5.
O título vg pode ser calculado com base na concentração (cópias/μL), levando em consideração as diluições da amostra. A faixa de trabalho de dd_PCR é de 10 a 10.000 cópias/μL. Valores abaixo de 10 cópias/μL devem ser excluídos da análise. Deve ser calculado o título vg para as amostras, bem como os controlos positivos e negativos. O valor medido do controlo positivo deve ter um coeficiente de variação (%CV) inferior a 20% em relação ao valor teórico. O controlo negativo deve ser inferior a 5 cópias/μl. Além disso, deve ser calculada a %CV entre repetições e diluições diferentes para cada amostra. Se o %CV entre diferentes diluições exceder 20%, o valor pode ser considerado impreciso e a amostra pode ter de ser novamente medida.
Uma medição bem-sucedida é caracterizada por uma separação clara das nuvens de gotículas positivas e negativas, pelo menos 10.000 gotículas aceitas, um valor entre 10 cópias/μL e 10.000 cópias/μL e um %CV entre repetições inferior a 20%.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67252/67252fig01.jpg"> Figura 1: Visualização de dd_PCR gotículas. (A) O gráfico de amplitude 1D demonstra uma separação clara de gotículas positivas e negativas, indicando particionamento de gotículas bem-sucedido. (B) O gráfico mostra uma má separação de gotículas positivas e negativas, conhecida como chuva de gotículas, o que sugere partição abaixo do ideal ou possíveis problemas com o ensaio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67252/67252fig02.jpg"> Figura 2: Fluxo de trabalho para quantificar genomas virais usando PCR de gotículas digitais. (1) Tampões, reagentes e soluções são preparados de acordo com as instruções do fabricante ou a etapa 1 do protocolo (Preparação de soluções de estoque). (2) 45 μL da solução de DNase I são aliquotados em cada tubo de uma tira de PCR de 8 tubos. Após o vórtice e a centrifugação breve das amostras, adicionam-se 5 μL da amostra a um dos tubos. A DNase I e a tira de PCR de oito tubos contendo amostra são incubadas em um termociclador por 1 h a 37 °C, seguidas de diluições seriadas das amostras. (3) O mastermix de PCR é preparado conforme descrito e 19,8 μL são aliquotados em cada tubo de uma tira de PCR de 8 tubos. Amostras de diluições seriais da etapa 2 são adicionadas ao mastermix. 20 μL do mastermix plus A solução de amostra é carregada na fileira do meio do cartucho e 60 μL de óleo de geração de gotículas são transferidos para os poços inferiores de um cartucho gerador de gotículas. O cartucho é então colocado no gerador de gotículas e funciona de acordo com as condições especificadas. Após a geração de gotículas, 42,5 μL da linha superior do cartucho são transferidos para uma placa de PCR de vários poços. (4) A placa PCR é carregada em um termociclador PCR e executada de acordo com as condições fornecidas. A placa é analisada usando um leitor dd_PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Dados de precisão. Esta tabela apresenta dados de precisão de quatro conjuntos de amostras de controle de qualidade (CQ), cada um com cinco concentrações (QC1-QC5). Cada CQ foi medido cinco vezes. O coeficiente de variação (%CV) entre diferentes ensaios, representando a repetibilidade (A), e entre diferentes conjuntos de amostras, representando precisão intermediária (B), é mostrado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 2: Diluições da amostra. A tabela mostra as diluições de amostra recomendadas com base no título do genoma viral esperado (vg/mL). Um total de três diluições são recomendadas para garantir que pelo menos dois valores estejam dentro da faixa de trabalho do ensaio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%202.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 3: dd_PCR composição da mixagem principal. Esta tabela descreve a composição do master mix dd_PCR, que inclui um primer direto e reverso (909 nM), sonda (227 nM) e dd_PCR supermix para sondas (sem dUTP, 1x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%203.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 4: Condições de termociclagem. A tabela detalha o programa de PCR recomendado, que inclui: (1) uma incubação de 10 minutos a 95 ° C para interrupção do capsídeo e ativação enzimática, (2) 40 ciclos de 30 s a 94 ° C para desnaturação do DNA e 1 minuto a 60 ° C para recozimento e extensão, (3) uma incubação de 10 minutos a 98 ° C para desativação enzimática, e 4) a temperatura de 4 °C. A temperatura de recozimento pode exigir otimização com base no conjunto de primer/sonda usado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%204.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 5: Exemplo de dados de saída de uma execução real do AAV. A tabela fornece um exemplo de dados de saída de uma execução real de AAV, em que uma amostra foi medida em duas diluições diferentes, cada uma em duplicata. O título do genoma viral (vg) (em vg/mL) é calculado usando a seguinte fórmula: 10 (pré-tratamento com DNase I) x 10 (diluição no master mix) x 1.000 (μL para mL) x diluição em tampão de diluição AAV. STDEV representa o desvio padrão e CV indica o coeficiente de variação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%205.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Quantificação de genomas virais adeno-associados em amostras de vetores purificados por reação em cadeia da polimerase por gotículas digitais

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of ...

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Bioengineering

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Quantificação de genomas virais adeno-associados em amostras de vetores purificados por reação em cadeia da polimerase por gotículas digitais

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