Otimização da preparação do antígeno para ensaio de inibição da hemaglutinação da sorologia do vírus da doença de Newcastle

Nossa pesquisa se concentra na otimização da preparação de antígenos para os ensaios de inibição da hemaglutinação. Para melhorar a precisão da detecção de anticorpos NDV, fornecemos um método para a preparação rápida e precisa da solução de antígeno 4-HAU. O ensaio HI continua sendo o método mais comum para detecção de anticorpos NDV.

No entanto, novas tecnologias, incluindo sistemas automatizados de manuseio de líquidos, plataformas sorológicas de alto rendimento e ferramentas avançadas de imagem também podem ser integradas ao ensaio HI. Eles permitem análises mais rápidas e precisas, especialmente ao lidar com grandes lotes. Estabelecemos um método eficiente para detecção mais precisa dos títulos de AH da solução estoque de antígeno, combinado com um método rigoroso de retrotitulação e um processo de ajuste bem definido.

Essa abordagem fornece um método preciso e minimiza as tarefas computacionais, aumentando a eficiência do teste e a confiabilidade, e contribuindo para melhorar a vigilância e o controle da doença nas populações avícolas. A suspensão de hemácias de galinha e a leitura visual dos resultados do AH HI ainda contribuem para a variabilidade. Nosso laboratório se concentrará em padronizar a suspensão de hemácias e explorar a visão computacional ou outros métodos para digitalizar os resultados do ensaio HA HI, reduzindo a subjetividade e aumentando a consistência.

Para começar, adicione três mililitros de solução Alserver em um tubo de centrífuga cônico estéril de 15 mililitros. Colete um mililitro de sangue da veia da asa de cada uma das três galinhas não imunes. Em seguida, transfira imediatamente o sangue coletado para o tubo anticoagulante e misture suavemente o conteúdo por inversão.

Encha o tubo com PBS estéril para elevar o volume total para 12 mililitros. Misture a solução suavemente para garantir uma distribuição uniforme dos componentes. Em seguida, coloque o tubo em uma centrífuga equipada com um rotor horizontal e centrifugue a 500 G por 10 minutos.

Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante e a camada de glóbulos brancos do tubo. Usando uma pipeta, pipete reversa um mililitro do pellet de hemácias em 99 mililitros de solução estéril de PBS para preparar uma suspensão de 1% de hemácias. Para reconstituir o antígeno liofilizado, adicione dois mililitros de PBS estéril à ampola que o contém.

Agite suavemente a ampola para dissolver completamente o conteúdo e deixe repousar por dois a três minutos para minimizar a formação de bolhas. Alíquota reconstituída em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro e armazene-a em um freezer ajustado a menos 20 graus Celsius até o uso. Para começar, dispense 40, 80, 120 e 160 microlitros de PBS, respectivamente, em quatro poços adjacentes de uma placa de microtitulação descartável de fundo em V de 96 poços.

Adicione 20 microlitros do antígeno reconstituído a cada poço e pipete para cima e para baixo 10 vezes para criar diluição. Em seguida, rotule uma nova placa de microtitulação claramente para as etapas subsequentes e dispense 25 microlitros de PBS em cada poço nas fileiras de um a cinco. Usando uma pipeta multicanal, coloque 25 microlitros das soluções de antígeno diluídas nos primeiros poços das fileiras um a cinco.

Pipete o conteúdo para cima e para baixo pelo menos cinco vezes para garantir uma distribuição uniforme. Em seguida, transfira 25 microlitros do primeiro poço de cada linha para o segundo poço, misturando bem. Rejeitar 25 microlitros da solução final após a 11.a coluna.

Em seguida, adicione 25 microlitros de PBS e 1% de suspensão de hemácias de frango, respectivamente, a cada poço, começando com os poços que contêm a menor concentração de antígeno. Coloque a placa de microtitulação no agitador de microplacas para misturar bem. Deixe a placa intacta na bancada em temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos para permitir que as hemácias na 12ª coluna assentem completamente.

Calcular o factor de diluição para a preparação da solução de antigénio 4-HAU utilizando a fórmula aqui indicada. Determinar o volume total da solução de 4-HAU necessário e os volumes necessários da solução-mãe de antigénio e PBS utilizando a fórmula indicada. Usando uma pipeta, transfira o volume calculado de PBS para um recipiente.

Adicionar o volume correspondente de solução-mãe de antigénio e homogeneizar para preparar a solução de antigénio 4-HAU. Em seguida, dispense 25, 50, 75, 100, 125 e 150 microlitros de PBS em seis poços adjacentes de uma placa de microtitulação. Adicione 25 microlitros da solução de antígeno 4-HAU a cada poço e pipete para cima e para baixo 10 vezes para garantir a diluição adequada.

Usando uma pipeta multicanal, transfira 25 microlitros de cada solução de antígeno diluída da fileira inicial para os poços de outra fileira. Em seguida, adicione 25 microlitros de PBS a cada poço, seguidos por 25 microlitros de uma suspensão de hemácias de frango a 1% em cada poço. Coloque a placa em um agitador de microplacas por aproximadamente 20 segundos para misturar bem o conteúdo.

Observe cuidadosamente os padrões de hemaglutinação nos poços e registre os resultados.