Quantificação microscópica em tempo real e de alto rendimento da liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e avaliação da farmacologia dos antagonistas

Desenvolvemos um método de microscopia em tempo real para a quantificação de armadilhas extracelulares de neutrófilos ou TNEs. Esses TNEs desempenham um papel importante na defesa imunológica inata. No entanto, ficou claro que o acúmulo de TNEs nos tecidos contribui para a fisiopatologia de múltiplas doenças inflamatórias e autoimunes.

Devido às implicações patológicas dos TNEs, o interesse no desenvolvimento de antagonistas da NETosis aumentou. Para estudar a inibição da NETosis, desenvolvemos um método de microscopia em tempo real para a quantificação da liberação de NET humana, permitindo-nos estudar a NETosis e sua inibição de maneira de alto rendimento. Os neutrófilos são células sensíveis e podem alterar sua capacidade de resposta a estímulos durante o processo de purificação devido ao estresse mecânico, microbiano e outros tipos de estresse.

Portanto, é importante validar o protocolo de isolamento de neutrófilos para minimizar a ativação de neutrófilos. Portanto, essa técnica permite o estudo da liberação de NET de indivíduos saudáveis e doentes. Além disso, permite estudar a cinética de formação de TNE induzida por diferentes estímulos fisiológicos.

Com esta técnica de microscopia de alto rendimento, fomos capazes de demonstrar que o antagonista NETosis CIT-013, um anticorpo monoclonal direcionado às histonas citrulinadas 2A e 4, foi capaz de inibir eficientemente a liberação de NET com um IC 50 ou 4,6 nanomolar. Isso demonstra que este ensaio é adequado para testar antagonistas de NETosis. Depois de coletar o sangue periférico do voluntário saudável em um tubo de heparina de lítio, transfira o sangue para um tubo novo de 50 mililitros.

Enxágue o tubo de heparina de lítio com DPBS e transfira-o para o mesmo tubo de 50 mililitros, garantindo que a proporção de sangue para DPBS seja de 1:1. Após a mistura, adicione sangue diluído sobre a solução de gradiente de densidade. Centrifugue o sangue a 400 G por 40 minutos com aceleração e pausa mínimas.

Rejeitar a camada superior de plasma com uma pipeta de 10 mililitros. Em seguida, use uma pipeta de pasteur de plástico para descartar as células mononucleares do sangue periférico e a solução de gradiente de densidade. Agite suavemente a camada contendo eritrócitos e neutrófilos antes de ressuspendê-la em 15 mililitros de DPBS.

Adicione 25 mililitros de solução de 6% de dextrano e cloreto de sódio a 0,9% e misture invertendo o tubo. Após 25 minutos de incubação, transferir a camada superior de neutrófilos para um novo tubo de 50 ml com uma pipeta de 10 ml e centrifugar a 500 g durante 10 minutos. Transvasar o tubo para rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 mililitros de tampão de lise de potássio com cloreto de amónio.

Adicione 40 mililitros do mesmo tampão de lise e incube à temperatura ambiente enquanto inverte continuamente o tubo até que a solução se torne translúcida. Centrifugar o tubo a 350 G durante 10 minutos. Depois de remover o sobrenadante, lenta e gota, adicione cinco mililitros de meio de cultura, 10% em cima do pellet de neutrófilos sem colocar os neutrófilos em suspensão.

Agite suavemente o tubo até que a maioria dos eritrócitos presentes no topo do pellet de neutrófilos seja ressuspensa no meio de cultura. Depois de remover o sobrenadante, ressuspenda o pellet de neutrófilos em 10 mililitros de meio de cultura, 10% Uma vez totalmente ressuspenso, adicione até 50 mililitros de meio de cultura 10% e centrifugue a mistura antes de ressuspender o pellet em 10 mililitros de Armadilha Extracelular de Neutrófilos ou tampão de ensaio NET. Para começar, adicione solução de 0,001% de poli-L-lisina a cada poço da placa de 96 poços e incube por uma hora a 37 graus Celsius.

Lave os poços três vezes com 200 microlitros de DPBS e seque os poços ao ar. Em seguida, ressuspenda o número necessário de neutrófilos na armadilha extracelular de neutrófilos ou no tampão de ensaio NET. Transfira quatro vezes o corante de DNA concentrado em tampão de ensaio NET para cada poço.

Adicione quatro vezes os estímulos concentrados de NETosis no tampão de ensaio NET aos poços correspondentes. Em seguida, adicione quatro vezes os antagonistas NETosis concentrados no tampão de ensaio NET e na suspensão de neutrófilos aos poços correspondentes. Centrifugar a placa a 100 G durante dois minutos.

Em seguida, insira a placa no sistema de análise de microscopia de células vivas colocado em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Depois de colocar a placa de imagem de 96 poços contendo suspensão de neutrófilos em um sistema de análise de microscopia de células vivas, abra o software do sistema. Clique em agendar para adquirir e clique no botão de adição para iniciar.

Em seguida, selecione a verificação agendada e clique em Avançar. Para criar uma nova embarcação do zero, selecione nova na seção criar embarcação e clique em avançar. Na seção Tipo de Digitalização, selecione Padrão e clique em Avançar.

Selecione as configurações de varredura como célula por célula, nenhuma. Canais de imagem, contraste de fase em verde. Tempo de aquisição, 100 milissegundos e objetivo 20x.

Em seguida, clique em Avançar. Na seção Seleção de embarcação, selecione o tipo apropriado de embarcação a ser verificada e clique em Avançar. Especifique o local na gaveta do recipiente e clique em Avançar.

Na seção Padrão de Varredura, selecione os poços que precisam ser escaneados e o número de imagens por poço. Clique em Avançar. Na seção Caderno da embarcação, forneça informações sobre a embarcação.

Digite o nome da placa e clique em Avançar. Na seção Configuração da análise, selecione adiar a análise até mais tarde e clique em Avançar. Na seção Agendamento de Verificação, selecione criar novo agendamento com verificações em intervalos de e selecione uma hora na seção Adicionar Verificações ao Agendamento.

Selecione Parar a verificação cinco horas após a primeira verificação. Clique em Avançar e clique em Adicionar para agendar quando as informações de verificação estiverem corretas. Depois de adquirir imagens de contraste de fase e imunofluorescência de neutrófilos, inicie o software de análise de microscopia de células vivas.

Na visualização, selecione o experimento de microscopia de células vivas a ser analisado. Selecione Criar nova definição de análise e clique em Avançar. Em seguida, selecione analisador básico na seção Tipo de Análise e clique em Avançar.

Na seção Canal de imagem, selecione verde, desmarque a fase e clique em Avançar. Abra a janela de camadas de imagem, selecione verde e desmarque a fase. Desative o dimensionamento automático na seção verde e defina manualmente min e max.

Em seguida, abra a janela de tempos de varredura do vaso e selecione as imagens que representam os poços de controle positivo com NETs. Abra a janela de configurações de definição de análise e escreva NETs para o nome do objeto. Para a segmentação, selecione Adaptável.

Para o limite GCU, selecione entre três e cinco e defina Edge Split On entre menos 10 e zero. Em seguida, para limpeza, selecione Preenchimento de furo para 100 micrômetros quadrados e ajuste o tamanho para menos um pixel. Em Filtros, selecione a área maior que 200 micrômetros quadrados, a Intensidade média menor que 24,6 e a Intensidade integrada maior que 7.000.

Em seguida, clique em visualizar atual ou visualizar tudo para aplicar as configurações. Passe o mouse sobre as diferentes estruturas NET e ajuste as configurações de análise para ajustar as NETs de falso positivo e falso negativo. Quando as configurações da análise NET estiverem corretas, clique em Avançar.

Selecione os pontos de tempo e poços a serem analisados na seção de tempos de varredura e poço e clique em Avançar. Insira o nome da definição na seção Salvar e aplicar definição de análise e clique em Avançar. Clique em Concluir quando as informações da análise forem verificadas e corretas.

Abra a análise do experimento clicando na análise dentro do recipiente de interesse. Em seguida, abra a janela de métricas do gráfico. Em seguida, clique no botão de adição para criar uma métrica.

Ao apresentar dados como porcentagem de confluência NET, selecione Área na seção Métrica e selecione Confluência na seção Valor. Ao apresentar dados como uma porcentagem de neutrófilos NETting, selecione Contagem de objetos na seção Métrica e selecione Por imagem na seção Valor. Depois de definir as configurações de métrica, na seção Métricas definidas pelo usuário, selecione Confluência de área de NETs ou Contagem de objetos de NETs por imagem.

Selecione todos os pontos de tempo e poços necessários para análise nas seções Selecionar varreduras e Selecionar poço, respectivamente. Por fim, clique em Exportar dados. A estimulação do ionóforo de cálcio induziu NETose mais rápida em comparação com a PMA, o que resultou em uma maior proporção de neutrófilos liberando NETs.

Os TNEs induzidos por ionóforos de cálcio foram mais difusos além da membrana plasmática dos neutrófilos, enquanto os TNEs induzidos por PMA permaneceram mais próximos da membrana plasmática dos neutrófilos. Uma tendência para níveis elevados de NET foi observada quando os neutrófilos foram ativados com imunocomplexos revestidos, FMLP e cristais de urato monossódico. A liberação de NET em resposta a um 23187 foi completamente inibida por CIT-013 a uma concentração inibitória máxima de 4,6 nanomolar.