Um protocolo para culturas de explante de gliomas difusos de baixo grau com mutação IDH1

Em nosso laboratório, nos concentramos no tipo raro de tumores cerebrais que são chamados de gliomas difusos de baixo grau. Esses gliomas afetam frequentemente adultos jovens e são caracterizados por uma mutação no gene chamado IDH-1. Os principais avanços no campo dos gliomas são, em primeiro lugar, o uso de modelos 3D, como tumoróides ou organoides, em segundo lugar, o uso de imagens diretamente no cérebro de camundongos transplantados com gliomas e, em terceiro lugar, o uso de RNA transcriptômico e de célula única especial.

O principal desafio que enfrentamos quando trabalhamos com gliomas mutantes IDH-1 é a baixa proliferação dessas células e sua dificuldade de serem mantidas em cultura, e para que tenhamos derivado e definido um protocolo para manter as células vivas, e para algumas delas, conseguimos derivar uma linhagem celular, mas não para todos os pacientes. Ao estudar células mutantes IDH-1 in vitro, mas também in vivo, descobrimos que essas células são bastante plásticas e podem adotar o destino de duas células, semelhantes a astrócitos ou ovais, e também descobrimos que o nudge está desempenhando um papel importante nessa plasticidade. Com este novo protocolo de explante, conseguimos manter as células mutantes IDH-1 in vitro por semanas, mas ainda mais, por meses, e mostramos que existem diferentes tipos de células tumorais, como encontramos no paciente.

Também descobrimos que existem algumas células do ambiente tumoral, como as células microgliais, que permitem estudar a interação entre as células tumorais e seu ambiente, de modo que esses modelos oferecem uma representação mais precisa da diversidade biológica encontrada nos tumores. Para começar, prepare o espaço de trabalho e organize todas as ferramentas esterilizadas. Transfira a ressecção do tumor para o gelo para preservar a viabilidade do tecido para cultura.

Examine a ressecção do tumor quanto ao tamanho e heterogeneidade. Selecione porções que exibam uma cor cinza com uma textura macia ou gelatinosa, pois essas áreas são ricas em células tumorais. Transfira as amostras de tumor selecionadas para um microtubo de 1,5 mililitro ou criovial e adicione um mililitro de meio.

Usando uma tesoura estéril, corte as amostras em pequenos pedaços medindo de um a dois milímetros cúbicos. Em seguida, com uma tesoura estéril, apare a extremidade de uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros para criar uma ampla abertura de aproximadamente três a quatro milímetros de diâmetro. Pipete 100 a 200 microlitros dos fragmentos de tecido picados com uma ponta cortada nos poços de uma placa.

Rehomogeneizar suavemente a suspensão para garantir uma distribuição uniforme, pois os fragmentos menores tendem a se assentar rapidamente. Coloque a placa em uma incubadora ajustada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 100% de umidade. Substitua o meio diariamente se a atividade metabólica do tumor causar amarelecimento rápido ou se a densidade do fragmento exigir.

Para começar, obtenha a suspensão de tecido tumoral picado. Para a preparação do meio de congelamento, adicione dois mililitros de DMSO a oito mililitros de meio de cultura de células. Combine um volume da suspensão de tumor picada com um volume igual do meio de congelamento 20% DMSO preparado.

Pipete cuidadosamente a mistura para cima e para baixo para garantir uma mistura completa. Transfira rapidamente os criogenianos para um recipiente criogênico para facilitar a redução gradual da temperatura e, em seguida, incube durante a noite a menos 80 graus Celsius antes de transferir para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. Para descongelar, remova os criogeniais do nitrogênio líquido e coloque-os imediatamente em banho-maria a 37 graus Celsius.

Aqueça-os até que aproximadamente 80% das células tenham descongelado. Para remover o DMSO, transfira rapidamente a suspensão para um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo cinco mililitros de PBS 1X pré-aquecido e centrifugue o tubo a 300 G por cinco minutos. Remover o sobrenadante e repetir a lavagem com PBS, seguida de centrifugação.

Aspire o sobrenadante, garantindo que o pellet permaneça intacto. Ressuspenda o pellet em uma quantidade apropriada de meio e transfira-o para uma placa de 24 poços de Laminina PDL pré-revestida. Incube a placa a 37 graus Celsius.

Células exibindo morfologias alongadas, bipolares ou multipolares foram observadas crescendo a partir de explantes tumorais aderidos à superfície do poço após uma duração mínima de cultura de quatro semanas. As células derivadas de tumores exibiram morfologia comparável entre tumores frescos e criopreservados em três casos, como mostrado por aparências alongadas e bipolares formando redes intrincadas. A migração radial da célula derivada do tumor ao longo da fibra foi claramente observada.

As culturas de explantes sem sucesso mostraram fragmentos não aderentes e numerosas células gitter, caracterizadas por autofluorescência e conteúdo lipídico.