Name: Um protocolo para culturas de explante de gliomas difusos de baixo grau com mutação IDH1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Aprenda um protocolo de cultura de explante não enzimático para gliomas difusos de baixo grau com mutação IDH1. Este método mantém células tumorais por meses, preservando a expressão proteica e permitindo estudos de plasticidade celular.

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Os fragmentos tumorais usados aqui fazem parte da coleção NEUROLOGY de amostras de tecido fresco mantidas pelo Centro de Recursos Biológicos do Hospital Universitário de Montpellier (CRB@chu-montpellier.fr). Esta pesquisa foi conduzida no âmbito do projeto intitulado "Gliomacult: Caracterização e Culturas Primárias de Gliomas de Baixo Grau", liderado pelo Prof. J. P. Hugnot (Projeto No. RECH / P722 / 1-5). Este trabalho foi apoiado por La ligue contre le cancer, ARC (Association for Cancer Research), ARTC, ARTC SUD, Les Etoiles dans la mer, EMBALL'ISO, Région Occitanie, INCA. O K.A.C é apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia de Humanidades (CONAHCYT), México, e pela Associação para Pesquisa de Tumores Cerebrais (ARTC), França.

Os fragmentos tumorais utilizados neste protocolo foram obtidos a partir de uma coleção bem caracterizada e eticamente aprovada, com consentimento dos pacientes. Esta pesquisa foi conduzida sob o projeto intitulado Gliomacult: Caracterização e Culturas Primárias de Gliomas de Baixo Grau (Número do Projeto: RECH/P722/1-5) e foi aprovada pelo conselho científico do biobanco de tumores em 28 de agosto de 2023.
1. Preparação das placas de cultura
OBSERVAÇÃO: Realize estes passos sob uma capela de fluxo laminar estéril para cultura de tecidos.
<ol>
	<li>Pelo menos 1 h antes do cultivo, prepare placas de 24 poços revestidas com poli-D-lisina (PDL) e laminina.
	<ol>
		<li>Dilua 10 mg de pó de PDL em 100 mL de tampão borato (pH 8,4) para uma concentração final de 100 µg/mL. Após a dissolução, filtre a solução (0,22 µm) para garantir esterilidade. O PDL está pronto para uso; prepare alíquotas de 3 mL e armazene-as a -20 °C.</li>
		<li>Descongele o tubo de laminina 1-2 mg/mL a 4 °C para evitar a formação de gel. Prepare alíquotas de 50 µL e armazene-as a -20 °C. 
		NOTA: Deve-se evitar repetidos ciclos de descongelamento e congelamento.</li>
		<li>Revestimento das placas
		<ol>
			<li>Etapa opcional: coloque lamínulas estéreis Ø, 13 mm, apropriadas para placas de cultivo celular, em uma placa de 24 poços, uma lamínula por poço. 
			NOTA: Este passo destina-se à posterior imunomarcação de explantes de glioma.</li>
			<li>Para o revestimento dos poços, misture 3 mL da solução de PDL em 9 mL de PBS 1x e adicione 50 µL de laminina. Adicione 500 µL dessa solução a cada poço, obtendo uma concentração de revestimento de 1-2 µg/cm². Incube as placas revestidas à temperatura ambiente, preferencialmente com agitação lenta (15 RPM), por pelo menos 1 h.</li>
			<li>Imediatamente antes do cultivo, remova a solução de PDL-laminina e lave duas vezes com PBS 1x estéril. 
			NOTA: Não deixe os poços secarem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Meios de cultura
<ol>
	<li>Cultive explantes com mutação no IDH1 em um meio definido composto por DMEM/F12 suplementado com L-glutamina, juntamente com uma mistura substituta de soro contendo N2 e B27 sem vitamina A. Utilize antibióticos, incluindo ciprofloxacina, gentamicina e fungina, para prevenir contaminação bacteriana e fúngica. Adicionalmente, incorpore fatores de crescimento como heparina, EGF e FGF2 ao meio, filtre-o (0,2 µm) e armazene-o por até 2 semanas a 4 °C. 
	NOTA: Para detalhes sobre os ingredientes do meio e sua preparação, consulte Tabela 1 e a Tabela de Materiais.</li>
</ol>
3. Preparação do explante
<ol>
	<li>Antes do processamento da amostra, prepare o ambiente de trabalho e as ferramentas estéreis conforme ilustrado na Figura 1A. Sanitize um resfriador borrifando-o com etanol a 70%. Esterilize as tesouras e pinças imergindo-as em etanol a 70% e enxaguando-as com PBS.</li>
	<li>Transfira imediatamente a ressecção tumoral para cultura sobre gelo, idealmente dentro de 2 h após a extração cirúrgica (Figura 1B). 
	NOTA: A amostra tumoral deve ter um diâmetro mínimo de 9-10 mm para garantir melhores resultados. O tecido é transportado sem meio de cultura, pois esse método é preferido para fins histológicos. A ausência de líquido evita a formação de cristais de gelo durante o congelamento rápido, preservando assim a integridade do tecido para exames histológicos subsequentes, se necessário.</li>
	<li>Coloque a placa de cultura com o espécime tumoral sobre o resfriador e enxágue suavemente com PBS 1X para remover o excesso de sangue.</li>
	<li>O tumor ressecado frequentemente apresenta tamanho significativo e heterogeneidade, composto por massa tumoral, tecido infiltrado e componentes não tumorais (Figura 1C). Selecione porções com coloração acinzentada e textura macia ou semelhante a geléia para o isolamento de células tumorais, pois tendem a conter mais células tumorais. Por outro lado, evite regiões duras e brancas, pois podem conter poucas células tumorais adequadas para cultura (Figura 1D), bem como áreas escurecidas, que provavelmente são resultado de eletrocauterização e podem não fornecer resultados confiáveis para análise.</li>
	<li>Transfira as amostras selecionadas para um microtubo de 1,5 mL ou criovial para trituração. Adicione 1 mL de meio estéril ao microtubo de 1,5 mL ou criovial e pique a amostra com as tesouras estéreis até obter pequenos fragmentos (1-2 mm3). 
	NOTA: Aproximadamente 1-2 min de piquetagem são necessários para obter fragmentos pequenos, tipicamente com tamanho de 1-2 mm3 (Figura 1E).</li>
	<li>Com tesouras estéreis, corte cuidadosamente a extremidade de uma ponteira azul de 1.000 µL para criar uma abertura ampla, com cerca de 3-4 mm de diâmetro. Usando essa ponteira modificada, pipete 50-200 µL dos fragmentos de tecido triturado e distribua-os uniformemente em cada poço. Como os fragmentos menores tendem a sedimentar rapidamente, re-homogeneíze suavemente a suspensão em cada poço para garantir uma distribuição uniforme. 
	​NOTA: Evite sobrecarga e mantenha o equilíbrio, não introduzindo um número excessivo de fragmentos em cada poço (Figura 1F).</li>
	<li>Incube os fragmentos tumorais a 37°C em uma incubadora com 5% de CO2 e umidade de 100%. Troque o meio diariamente se a atividade metabólica do tumor (indicada pelo escurecimento rápido do meio) e o número de fragmentos em cada poço exigirem. Durante a troca do meio, proceda com cuidado, aspirando delicadamente o meio com uma pipeta equipada com ponteira de 200 µL, tomando o cuidado de não perturbar os fragmentos tumorais aderidos.</li>
</ol>
<img alt="Processo de preparação do tecido tumoral; configuração do equipamento; amostras de tecido; resultados da centrifugação; gráfico de análise." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67260/67260fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Procedimento de cultura de explantes tumorais. Uma ressecção de glioma difuso de baixo grau foi obtida de um paciente de 44 anos diagnosticado com astrocitoma grau II de acordo com a classificação da OMS de 2021. O tumor apresentava mutação no IDH1 (Éxon 4 c.395 G&gt;A, p.Arg132His) e mutação no TP53 (Éxon 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis), juntamente com ausência de coloração para ATRX. Nenhuma mutação foi detectada nos sítios de ligação Ets/TCF (C250T e C228T) do gene TERT. (A) A superfície de trabalho compreende um pacote refrigerante, proporcionando um ambiente que minimiza a degradação da amostra e mantém a viabilidade dos componentes biológicos. Essas precauções são importantes para preservar a qualidade e a integridade do tecido. (B) O transporte da amostra do hospital para o laboratório deve ser feito sob gelo. (C) Fragmento da ressecção tumoral. As setas indicam as partes mais adequadas para cultura. (D) A dissecação do tumor é realizada para selecionar a parte mais relevante a ser picada. Em nossa experiência, a substância branca geralmente tem menor probabilidade de gerar explantes bem-sucedidos. (E) Fragmentos tumorais de aproximadamente 1-2 mm³ de diâmetro em um tubo de 15 mL após serem picados mecanicamente com tesoura. (F) O número de fragmentos tumorais necessário para o semeadura adequada é mostrado para poços em uma placa de 24 poços. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67260/67260fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
4. Criopreservação e descongelamento de tumor picado
OBSERVAÇÃO: A criopreservação garante um backup em caso de contaminação e perda de culturas de explantes ou para processar as amostras tumorais posteriormente.
<ol>
	<li>Criopreservação: Prepare o meio de congelamento (solução de DMSO a 20% v/v) adicionando 2 mL de DMSO a 8 mL de meio de cultura celular.</li>
	<li>Combine um volume da suspensão de tumor picado com um volume igual do meio de congelamento com 20% de DMSO para obter uma concentração final de 10% de DMSO. Pipete cuidadosamente a mistura para cima e para baixo para garantir uma mistura completa e, em seguida, distribua aproximadamente 1 mL em crioviales.</li>
	<li>Transfira rapidamente as crioviales para um recipiente criogênico para redução gradual da temperatura, seguido de incubação durante a noite a -80 °C antes do armazenamento final em nitrogênio líquido. 
	NOTA: Este passo deve ser realizado imediatamente após as células serem colocadas no meio de congelamento, pois certos crioprotetores, como o DMSO, podem ser prejudiciais se as células forem expostas a eles à temperatura ambiente por mais tempo do que o necessário.</li>
	<li>Descongelamento: Retire as crioviales do nitrogênio líquido e coloque-as imediatamente em um banho-maria a 37 °C até que cerca de 80% das células tenham descongelado.</li>
	<li>Para remover o DMSO, pipete rapidamente a suspensão em um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de PBS 1x pré-aquecido e centrifugue a 300 × g por 5 min.</li>
	<li>Remova o sobrenadante e repita a lavagem com PBS 1X seguida de centrifugação (passo 4.5). Aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet, e adicione a quantidade apropriada de meio para transferir para uma placa de 24 poços revestida com PDL-Laminina e coloque no incubador.</li>
	<li>Após 24 h, verifique se as células aderiram. Após alguns dias, remova os fragmentos não aderentes substituindo o meio de cultura.</li>
</ol>
5. Passagem da cultura
OBSERVAÇÃO: Uma vez estabelecidos, os explantes podem ser usados para videomicroscopia ou imunomarcação. Alternativamente, se as células tumorais tiverem migrado para fora do explante e apresentarem aspecto saudável, o explante pode ser subcultivado por dissociação enzimática e resemado em poços para experimentos adicionais. No entanto, é importante observar que este protocolo não foi projetado para subcultivos repetidos. Normalmente, apenas uma única passagem pode ser realizada antes que as células tumorais entrem em senescência ou morram. Nem todas as culturas de explantes resultarão em passagem bem-sucedida.
<ol>
	<li>Para a repicagem, remova o meio antigo, lave com PBS 1X e adicione (125 µL) de tripsina-EDTA 0,05% aos poços, incubando por 3-4 min a 37 °C, seguido pela adição de 6,5 µL de inibidor de tripsina, 12 µL de CaCl2 20 mM (diluição final para 2 mM) e 1 µL de DNAse I. 
	NOTA: O tempo de incubação necessário para a dissociação pode variar conforme o cultivo. É importante verificar se as células se desprendem após pelo menos 3 min. Normalmente, o explante pode não se dissociar completamente em uma suspensão unicelular, e pequenos agregados geralmente são mantidos, os quais podem gerar novos cultivos de explantes.</li>
	<li>Com uma pipeta p1000 ajustada em 500-600 µL, realize uma lavagem suave para desagregar os explantes. Evite a formação de bolhas.</li>
	<li>Adicione 5 mL de PBS 1X e centrifugue por 5 min a 300 × g. Aspire o sobrenadante, ressuspenda o pellet em meio pré-aquecido fresco e realize a contagem para semeadura.</li>
	<li>Identifique culturas com potencial para gerar linhagens celulares observando células em divisão ao microscópio de contraste de fase. Essas células em divisão geralmente apresentam morfologia arredondada e cromossomos visíveis, conforme mostrado na Figura 2A.</li>
</ol>

<ol><li>Dasgupta, P., Balasubramanyian, V., De Groot, J. F., Majd, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+low-grade+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of low-grade gliomas.</a> Cancers (Basel). 15 (3), 596(2023).</li>
<li>Tirosh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+supports+a+developmental+hierarchy+in+human+oligodendroglioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma.</a> Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).</li>
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<li>Augustus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+CRYAB%2B+KCNN3%2B+SOX9%2B+astrocyte-like+and+EGFR%2B+PDGFRA%2B+OLIG1%2B+oligodendrocyte-like+tumoral+cells+in+diffuse+idh1-mutant+gliomas+and+implication+of+NOTCH1+signalling+in+their+genesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Identification of CRYAB+ KCNN3+ SOX9+ astrocyte-like and EGFR+ PDGFRA+ OLIG1+ oligodendrocyte-like tumoral cells in diffuse idh1-mutant gliomas and implication of NOTCH1 signalling in their genesis.</a> Cancers (Basel). 13 (9), 2107(2021).</li>
<li>Hubert, C. G., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+explants+as+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived explants as tumor models.</a> Cancer Cell. 40 (4), 348-350 (2022).</li>
<li>Abdullah, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+patient-derived+organoid+models+of+lower-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Establishment of patient-derived organoid models of lower-grade glioma.</a> Neuro Oncol. 24 (4), 612-623 (2022).</li>
<li>Yuzhakova, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+3d+tumor+spheroid+model+from+the+patient%27s+glioblastoma+cells+and+its+study+by+metabolic+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sovrem+Tekhnologii+Med%22%5BJournal%5D)">Development of a 3d tumor spheroid model from the patient's glioblastoma cells and its study by metabolic fluorescence lifetime imaging.</a> Sovrem Tekhnologii Med. 15 (2), 28-38 (2023).</li>
<li>Kloosterman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+microglia+across+contexts+of+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Morphology of microglia across contexts of health and disease.</a> Cell. 187, 5336-5356.e30 (2024).</li>
<li>Thomas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2021+updates+to+the+World+Health+Organization+classification+of+adult-type+and+pediatric-type+diffuse+gliomas%3A+A+clinical+practice+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">2021 updates to the World Health Organization classification of adult-type and pediatric-type diffuse gliomas: A clinical practice review.</a> Chin Clin Oncol. 12 (1), 7(2023).</li>
<li>Azar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+characterization+of+IDH1-mutated+diffuse+low+grade+gliomas+reveals+tumor+heterogeneity+and+absence+of+EGFR%2FPDGFRalpha+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular characterization of IDH1-mutated diffuse low grade gliomas reveals tumor heterogeneity and absence of EGFR/PDGFRalpha activation.</a> Glia. 66 (2), 239-255 (2018).</li>
<li>Bhaduri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+radial+glia-like+cancer+stem+cells+contribute+to+heterogeneity+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Outer radial glia-like cancer stem cells contribute to heterogeneity of glioblastoma.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 48-63.e6 (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

O desenvolvimento de modelos in vitro e pré-clínicos para gliomas de baixo grau com mutação no IDH1 é particularmente desafiador devido ao crescimento lento desses tumores e à complexidade de replicar as extensas alterações genômicas e epigenômicas causadas pela mutação no IDH. Além disso, essas células tumorais infiltrativas interagem ativamente com células vizinhas, incluindo células imunes, endoteliais, gliais e neuronais, possivelmente dependendo delas para sobreviver. Essa interação complexa é difícil de replicar em...

Os gliomas difusos são os tumores cerebrais primários mais frequentes. Atualmente, esses tumores são incuráveis, apesar do tratamento muito intenso (cirurgia, rádio e quimioterapia)1. Evidências crescentes apóiam a hipótese de que a gliomagênese se origina de células-tronco adultas ou progenitoras gliais residentes no cérebro2. Embora os glioblastomas representem o tipo mais agressivo, os gliomas difusos de baixo grau (DLGG, tumores de grau 2) também são prevalentes (15% dos gliomas difusos)1,3. Os DLGGs crescem lentamente e migram ao longo dos tratos de substância branca, uma marca registrada dessa neoplasia 'difusa' < classe sup = "ref">4. Esses DLGG muitas vezes recorrem apesar do tratamento, progredindo para malignidades de alto grau (graus 3 e 4)5.
DLGG são caracterizados por uma mutação missense no gene da isocitrato desidrogenase 1 ou 2 (IDH1 ou IDH2), resultando na produção aberrante do oncometabolito 2-hidroxiglutarato (2HG). Isso interrompe a diferenciação celular por meio de desregulações epigenéticas6. Os gliomas mutantes IDH1 são classificados em subtipos: os astrocitomas geralmente têm mutações em ATRX e P53, enquanto os oligodendrogliomas são caracterizados por deleções 1p19q7. Esses tumores exibem uma heterogeneidade de células tumorais. O sequenciamento e a imunocaracterização de RNA de célula única revelaram uma população diversificada de células tumorais, exibindo fenótipos semelhantes a células-tronco, astrócitos e oligodendrócitos dentro desses tumores8,9.
Em contraste com o glioblastoma, que se beneficia de culturas e linhagens celulares de longo prazo prontamente disponíveis, existe uma notável escassez de ferramentas celulares adaptadas para investigar tumores mutantes IDH11. Isso representa um obstáculo significativo para o avanço do desenvolvimento terapêutico e aprofundamento de nossa compreensão da gliomagênese mutante IDH1 e progressão da doença. As linhagens celulares tradicionais cultivadas em soro, embora utilizadas há muito tempo, replicam inadequadamente os tumores originais, exibindo perfis transcricionais alterados. Alternativamente, as condições de cultura sem soro, seja em modelos tumoróides 2D ou 3D, preservam de forma mais eficaz os perfis transcricionais das células tumorais e seus fenótipos in vivo, como invasão no tecido cerebral normal10,11.
Além disso, as culturas de células de curto prazo derivadas da peça cirúrgica de um paciente preservam o perfil molecular e a diversidade celular do tumor, representando melhor as características biológicas dos tumores em comparação com as linhagens celulares12. Aqui, apresentamos um método não enzimático direto para cultura de cultura de gliomas difusos de baixo grau com mutação IDH1 como explantes derivados de ressecções de pacientes frescos ou congelados, com o objetivo de atender à necessidade de modelos in vitro aprimorados para pesquisa de glioma e desenvolvimento terapêutico. Eles também oferecem o potencial de derivar linhagens celulares mutantes de IDH1.

<table><tbody><tr><td>Anti-ASCL1</td><td>BD Pharmingen&trade;</td><td>Diluição 556604</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anti-ATRX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>HPA001906 Diluição 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD68</td><td>Agilent</td><td>M081401-2</td><td>Diluição 1:500</td></tr><tr><td>Anti-GFAP</td><td>Aves Labs</td><td></td><td>AB_2313547 Diluição 1:500</td></tr><tr><td>Anti-IBA1</td><td>Fujifilm Wako Anticorpos</td><td>019-19741</td><td>Dilituion 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-IDH1 (R132H) camundongo Anticorpo monoclonal</td><td>Dianova</td><td>DIA-H09</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ki67</td><td>BD Pharmingen&trade;</td><td>556003</td><td>Dilituion 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-OLIG1</td><td>R& D Systems&reg;</td><td>AF2417</td><td>Dulituion 1:300</td></tr><tr><td>Anti-OLIG2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MABN50</td><td>Diluição 1:250</td></tr><tr><td>Anti-SOX9</td><td>Abcam&reg;</td><td>Diluição EPR14335-78</td><td>1:100</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50x), menos vitamina A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino (BSA)</td><td>CiteAb</td><td>A-421-100</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacina HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1044-1G</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Corning&reg;</td><td>432000</td><td>Recipiente de Congelamento de Células, para 12 x Frascos Criogênicos de 1 mL ou 2 mL</td></tr><tr><td>Lamínula de cobertura &Oslash;, 13 mm</td><td>Karl Hecht&trade; Assistente&trade;</td><td></td><td></td>328017</tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, sem glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Tamponado com Fosfato Salino (PBS) 1x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish</td><td>Corning&reg;</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom Corning</td><td>&reg;</td><td>353047</td><td>Placa de Cultura de Células Multipoços tratada com TC, com Tampa, Estéril&nbsp;</td></tr><tr><td>Fungin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-fn-1</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>Humano EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Humano FGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplemento (100x )</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>Soro acrodisc 37 mm filtro de seringa com GF/0.2 &micro; m Supor</td><td>PALL Corporation</td><td>4525</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de tripsina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Z1 Apotome 3 microscópio</td><td>Zeiss</td><td></td><td>microscópio de epifluorescência de campo amplo reto</td></tr></tbody></table>

um protocolo para culturas de explante de gliomas difusos de baixo grau com mutação idh1

A Protocol for Explant Cultures of IDH1-mutant Diffuse Low-grade Gliomas

Os gliomas difusos, os tumores cerebrais primários mais prevalentes, são categorizados em graus baixos e altos com base em critérios histopatológicos e mutações genéticas. Os gliomas difusos de baixo grau constituem um subconjunto, afetando predominantemente adultos jovens e predispondo a gliomas de alto grau. Existem dois tipos principais de gliomas difusos de baixo grau: astrocitomas e oligodendrogliomas, cada um definido por características genéticas e histológicas distintas. Esses tumores apresentam caracteristicamente uma variante mutante da enzima metabólica IDH1, interrompendo a diferenciação celular. Eles são heterogêneos, compreendendo células-tronco proliferativas e células gliais quiescentes mais diferenciadas. 
Modelos de tumores in vitro específicos do paciente têm um potencial significativo para desvendar mecanismos oncogênicos e adaptar a seleção de medicamentos para terapia personalizada. No entanto, a ausência de modelos in vitro confiáveis especificamente para gliomas de baixo grau com mutação IDH1 tem dificultado a pesquisa fundamental e translacional. Aqui, apresentamos um método simples para cultivar tumores mutantes em IDH1 como explantes em meios definidos sem a necessidade de dissociação enzimática. Esses explantes podem ser sustentados por longos períodos, mantendo a expressão da proteína mutante IDH1, bem como marcadores para células progenitoras de oligodendrócitos, como ASCL1 (MASH1), OLIG1 e OLIG2 e para astrócitos (GFAP, SOX9). Eles também podem ser estabelecidos a partir de tumores congelados no DMSO. Essas culturas podem servir como uma plataforma valiosa para triagem de drogas, videomicroscopia e estudos genéticos, facilitando assim os avanços na compreensão e tratamento desses tumores desafiadores. Eles também oferecem o potencial de derivar linhagens celulares mutantes de IDH1.

Após alguns dias, alguns fragmentos tumorais aderirão às superfícies das placas, iniciando a migração celular a partir dos explantes. O tempo entre o cultivo inicial e o aparecimento de células tumorais em crescimento varia de acordo com a amostra. Os cultivos iniciais frequentemente contêm grande quantidade de detritos celulares, dificultando a avaliação da presença de células viáveis. Consequentemente, o cultivo deve ser mantido por um mínimo de 4 semanas. Assim que as células começarem a crescer, serão observadas célu...

IDH1-mutante gliomas difusos de baixo grau são tumores raros e difíceis de cultivar. Apresentamos um método simples de explante não enzimático que preserva a expressão da proteína mutante IDH1 e sustenta as culturas por meses. É importante ressaltar que essa técnica funciona com tumores criopreservados, oferecendo um recurso valioso para a pesquisa de gliomas.

Um protocolo para culturas de explante de gliomas difusos de baixo grau com mutação IDH1

Diffuse gliomas, the most prevalent primary brain tumors, are categorized into low and high grades based on histopathological criteria and genetic ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo demonstra o processo de isolamento e cultura de células progenitoras gliais de glio pontino intrínseco difuso ou tecido do tronco cerebral afetado por DIPG. Células gliais isoladas do tecido tumoral via  uma digestão enzimática são cultivadas em meio neurobasal, o que promove seu crescimento e o desenvolvimento de neuroesferas flutuantes.

Isolando e Cultivando Células de Glioma Pontino Intrínseco Difuso

Gliomas malignos constituem um grupo heterogêneo de neoplasias gliais altamente infiltrativas com características clínicas e moleculares distintas. Xenograftos ortotópicos primários recapitulam as características histopatológicas e moleculares de subtipos de glioma malignos em modelos animais pré-clínicos.

Glioma Xenoenxertos Ortotópicos Primários Recapitulam crescimento infiltrativo e isocitar mutação desidrogenase I

Protocolo para propagação de amostras cirúrgicas de glioma de alto grau dissociadas em meio neuroesfera livre de soro para selecionar para células com fenótipo de células-tronco cancerosas. Para espécimes que não crescem como neurosferas, um protocolo alternativo é sugerido. Uma técnica de incorporação de parafina para manter a arquitetura da neurosfera 3D para imunocytoquímica é descrita.

Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D

Apresentado aqui é um método simples para o isolamento e análise de citometria de fluxo de células mononucleares de sangue periférico que se infiltram no glioma que produz dados quantitativos tempo-dependente do número e estado de activação das células do sistema imunológico que entram no microambiente do tumor cerebral precoce.

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Este protocolo descreve um método para o rápido processamento de amostras de glioma pontino intrínsecas difusas post-mortem para o estabelecimento de modelos de culturas de células derivadas de pacientes ou caracterização directa de células tumorais e microambiente.

Um protocolo para a Cultura rápidos post-mortem celular de Difuso Intrínseca Pontine glioma (DIPG)

Este estudo introduz e descreve protocolos para derivar dois organóides neurais humanos específicos como um modelo relevante e exato para estudar 1) desenvolvimento humano do glioblastoma dentro dos organóides neural humanos exclusivamente nos seres humanos e 2) neurônio dopaminérgicos diferenciação, gerando um organoide tridimensional.

Organóides neurais humanos para estudar câncer cerebral e doenças neurodegenerativas

Aqui apresentamos um sistema de cultura monocamada mista ex-vivo para o estudo da migração de células glioma humanas (hGC) em tempo real. Este modelo fornece a capacidade de observar interações entre hGCs e axônios mielinated e não-myelinated dentro de uma câmara compartimentada.

Monitoramento em tempo real da migração humana de células glioma em co-culturas de raiz dorsal Ganglion Axon-Oligodendrocyte

Este estudo apresenta um protocolo de imunocitoquímica de células vivas 3D aplicado a uma linhagem celular pediátrica de glioma difuso da linha média, útil para estudar em tempo real a expressão de proteínas na membrana plasmática durante processos dinâmicos como invasão e migração de células 3D.

Ensaios de imunocitoquímica de células 3D vivas de glioma difuso da linha média pediátrica

A desregulação proteômica desempenha um papel importante na disseminação de gliomas difusos infiltrantes, mas várias proteínas relevantes permanecem não identificadas. O processamento espacial digital (DSP) oferece uma abordagem eficiente e de alto rendimento para caracterizar a expressão diferencial de proteínas candidatas que podem contribuir para a invasão e migração de gliomas infiltrativos.

Perfil Espacial Digital para Caracterização do Microambiente em Glioma Infiltrante Difuso do Tipo Adulto

Aqui, descrevemos um método de geração de organoides de glioblastoma (GBM) a partir de amostras de pacientes primários ou culturas celulares derivadas do paciente e mantê-los até a maturidade. Esses organoides GBM contêm populações de células fenotipicamente diversas e recriam microambientes tumorais ex vivo.

Manutenção da Diversidade Celular Glioblastoma Humano Ex vivo usando cultura organoide tridimensional

Aprenda um protocolo de cultura de explante não enzimático para gliomas difusos de baixo grau com mutação IDH1. Este método mantém células tumorais por meses, preservando a expressão proteica e permitindo estudos de plasticidade celular.

Um protocolo para culturas de explante de gliomas difusos de baixo grau com mutação IDH1

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