Name: Controle espaço-temporal da atividade proteica por meio da regulação alostérica optogenética (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Descubra o controle optogenético da atividade proteica usando LightR para regulação alostérica da tirosina quinase Src. Este método permite estudos reversíveis da dinâmica de sinalização celular em células HeLa com alta resolução espacial.

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<meta charset="utf8"></head><body>Controle optogenético da atividade enzimática usando interruptor alostérico regulado por luz

<table><tbody><tr><td>#1.5 Lamínulas de Vidro 25 mm Redondas</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>64-0715</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL&nbsp;</td><td>Científica dos EUA</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x Tampão</td><td></td><td></td> Laemmli <td>Para 500 mL: 5.18 g de&nbsp; Tris-HCL, 131,5 mL de glicerol, 52,5 mL de 20% SDS, 0,5 g de azul de bromofenol, pH final 6,8</td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Gel Pré-moldado</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus Buffer&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>60 LED Microscópio Anel de Luz</td><td>Boli Optics</td><td>ML46241324</td><td>LED Azul, 60 mm de diâmetro, 5 W</td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Erk 1/2 Anticorpo</td><td>Sinalização Celular</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH Anticorpo</td><td>invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCherry Anticorpo</td><td>invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MEK</td><td>Sinalização Celular</td><td>9122</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p130Cas</td><td>BD Biosciences</td><td>610271</td><td></td></tr><tr><td>Sinalização Celular</td><td>Anti-paxilina</td><td>2542</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-Erk 1/2 T202 / Y204</td><td>Sinalização Celular</td> de Anticorpo <td>9101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-pY249 p130Cas</td><td>Sinalização Celular</td><td>4014</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-Y118 Sinalização Celular de Paxilina</td><td></td><td>2541</td><td></td></tr><tr><td>Anto-fosfo-S217 / 221 Célula MEK</td><td> Sinalização</td><td>9121</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Compatable Fonte de Alimentação</td><td>Computador Corporativo</td><td>LJH -186</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno Rev3</td><td>Arduino</td><td>&lrm; </td><td></td>A000066</tr><tr><td>Câmara Celular Attofluor</td><td>invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)&nbsp;</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>Inativado por Calor Triplo 0.1 &micro; m estéril filtrado&nbsp;</td></tr><tr><td>bRaf-V600E-Venus</td><td></td><td></td><td>Presente do Dr. John O'Bryan, MUSC</td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>GoldBiotech</td><td>A-420&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilina (Dissódico)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-103-25</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Corante de membrana plasmática vermelho escuro</td><td>invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>Colony Screen MasterMix&nbsp;</td><td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>células competentes DH5a&nbsp;</td><td>NEB&nbsp;</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder&nbsp;</td><td>GoldBio&nbsp;</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>Enzima Dpn1&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-Ditiotreitol, Reagentes Cleland's&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros&nbsp;</td><td></td><td></td>409910250</tr><tr><td>FastLightR-bRaf-mVenus</td><td>Addgene</td><td>#162155</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina de plasma bovino&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6 Reagente de Transfecção&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Reagente de Transfecção</td></tr><tr><td>Gel Verde Mancha de Ácido Nucleico&nbsp;</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>Tinta de Carregamento em Gel Roxo 6x&nbsp;</td>Kit de extração de gel <td>NEB</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K0692</td><td>Kit de Extração de Gel&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit Miniprep de Plasmídeo GeneJET</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (100x) 100 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Células HEK 293T&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Células HeLa&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Iot Relay</td><td>Digital Loggers</td><td>DLI 705020645490</td><td>Relé de controle AC/DC para iluminação</td></tr><tr><td>Kanamycin Monosulfate</td><td>Gold Biotechnology</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-045-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar&nbsp;</td>Sistema de Luz de Crescimento LED <td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td>Sistema de lâmpada de painel LED&nbsp;</td></tr><tr><td>LightR-bRaf-mVenus</td><td>Addgene</td><td>#162154</td><td></td></tr><tr><td>LightR-iCre-miRFP670</td><td>Addgene</td><td>#162158</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2024a</td><td>Software para execução de Scripts CellGEO</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td>Software de Análise de Imagem</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>Óleo</td> Mineral <td>Fisher Chemical M33-500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Kit MiniPrep M5310</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Escolha do gene:</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Géis Pré-moldados 12 poços</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>Grau de Biologia Molecular Água&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>46-000-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Espelho Polichroic Multibanda</td><td>89903BS</td><td>Chroma</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS sem Ca e Mg&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-iCre</td><td>Addgene</td><td>#89573</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry</td><td>Addgene</td><td>#122963</td><td></td></tr><tr><td>pCEFL-ERK2</td><td></td><td></td><td>Presente do Laboratório do Dr. Channing Der, Tubos</td></tr><tr><td>de PCR UNC&nbsp;</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>0.2 mL 8-Strip Tubos e Caps, Rigid Strip Individualmente Attached Dome Caps&nbsp;</td></tr><tr><td>Phusion Plus DNA Polimerase</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>pmiRFP670-N1</td><td>Addgene</td><td>#79987</td><td></td></tr><tr><td>Polygon 400 Iluminador Padronizado</td><td>Mightex</td><td>DSI-G-00C</td><td></td></tr><tr><td>Primers&nbsp;</td><td>Membranas de PVDF IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>Immun-Blot PVDF/Papel de Filtro Sanduíches&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T0.25% Tripsina, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sódio</td><td>Corning&nbsp;</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetato-EDTA (TAE) 50x&nbsp;</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>BP1332-1&nbsp;</td><td>Para eletroforese&nbsp;</td></tr><tr><td>Objetiva de Microscópio UPlanSApo 40x</td><td>Olympus</td><td>1-U2B828</td><td></td></tr><tr><td>USB TTL Box</td><td>National Instruments</td><td>6501</td><td>Para interface TTL</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Fisher Chemical&nbsp;</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr></tbody></table>

controle espaço-temporal da atividade proteica por meio da regulação alostérica optogenética

Spatiotemporal Control of Protein Activity through Optogenetic Allosteric Regulation

O LightR-Src é projetado e gerado seguindo a estratégia descrita na Figura 1A,B. A análise bioquímica de LightR-Src acessa a fosforilação de substratos Src endógenos conhecidos, p130Cas (Y249)22 e paxilina (Y118)23 em resposta à luz azul a 60 min de iluminação contínua (Figura 2B). Notavelmente, nenhuma ativação de fundo da Src quinase é observada quando LightR-Src é expresso apenas na escuridão por 16-18 h após a transfecção. Além disso, o mutante cataliticamente inativo de LightR-Src com mutação D388R não induz fosforilação do substrato Src, demonstrando que a fosforilação é realizada por LightR-Src ativo e não causada por efeito inespecífico da iluminação da luz azul (Figura 2B). Reconhecendo relatos de atividade oscilatória da quinase Src27 em células vivas, investigamos se LightR-Src poderia ser ajustado para exibir ativação cíclica. O LightR-Src original exibiu cinética de desativação lenta (Figura 2C), levando à geração de uma nova variante, Fast-LightR-Src, abrigando a mutação I85V em ambos os VVDs. A Figura 2D ilustra que o Fast-LightR-Src mostra uma cinética de desativação marcadamente mais rápida e é completamente inativado dentro de 10 minutos após desligar a luz, em comparação com mais de uma hora para LightR-Src. Usando o FastLightR-Src, também conseguimos ciclos repetidos de ativação/inativação (Figura 2E). Esses resultados demonstram coletivamente a capacidade da ferramenta LightR de alcançar uma regulação específica e rigidamente controlada da atividade de Src em células vivas.
A aplicação do FastLightR-Src também permite avaliar os efeitos da ativação transitória do Src na morfodinâmica celular. A ativação do FastLightR-Src nas células HeLa induz a disseminação celular, e esse processo é interrompido assim que o FastLightR-Src é inativado. Após a ativação, observamos a translocação de FastLightR-Src do compartimento perinuclear para aderências focais e membrana plasmática, um comportamento exibido pela Src quinase do tipo selvagem11,12. As células iluminantes que expressam o mutante cataliticamente inativo D388RLightR-Src não mostram tais efeitos de espalhamento ( Figura 3B, C ). Isso confirma ainda mais que o FastLightR-Src funciona de forma semelhante ao seu homólogo do tipo selvagem. A iluminação local de uma região celular resulta na ativação localizada de FastLightR-Src indicada pelo acúmulo local LightR Src na adesão focal e acompanhada pela formação de saliências locais da membrana (Figura 4B (i), (ii)) e deslocamento do centróide celular (Figura 4C (i), (ii)) resultando em movimento celular em direção à luz. Tendo estabelecido a aplicação da ferramenta LightR para a regulação da Src quinase, mostramos a ampla utilidade do LightR estendida à regulação da bRaf quinase e DNA recombinase Cre. A análise de LightR-bRaf mostra fosforilação induzida por luz do substrato endógeno de bRaf, MEK1 e fosforilação a jusante de ERK1/2 quinases24,25 em níveis comparáveis aos do mutante bRaf constitutivamente ativo (V600E) (Figura 5A). Por outro lado, o D575RLightR-bRaf cataliticamente inativo não demonstra fosforilação de MEK1 e ERK1/2, comparável a amostras LightR-bRaf não iluminadas, confirmando assim a especificidade da regulação de LightR-bRaf. A imagem de células vivas demonstrou que ciclos repetidos de ativação/inativação de FastLightR-bRaf induzem a translocação repetida de ERK2 para dentro e para fora do núcleo, corroborando com os resultados conhecidos da ativação de bRaf28 (Figura 5B). A ativação do LightR-Cre resulta na recombinação bem-sucedida de um gene repórter mCherry, demonstrando a aplicabilidade do LightR a diferentes classes de enzimas ( Figura 5C ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig01.jpg"> 
Figura 1: Estratégia de desenvolvimento da abordagem LightR. (A) Estruturas cristalinas de dois monômeros vívidos no estado escuro (PDB: 2PD7) e o dímero no estado iluminado (PDB: 3RH8). (B) Representação de desenho animado do design LightR. Dois fotorreceptores VVD conectados em tandem inseridos no domínio catalítico interrompem a atividade catalítica da proteína no escuro. A dimerização do VVD em resposta à luz azul restaura a atividade da proteína. (C) Estruturas cristalinas de (i) domínios catalíticos Src (PDB 1Y57) e (ii) bRaf (PDB 4MNF). (ii) Estrutura da Cre recombinase (PDB 1MA7). As setas amarelas indicam o local de inserção do LightR e indicam o aminoácido substituído. (D) Diagrama esquemático da estratégia de clonagem para inserção do domínio LightR em uma sequência enzimática alvo19. Na Etapa 1, primers especificamente projetados são usados para a síntese de PCR de um fragmento LightR flanqueado por locais de recozimento no gene alvo antes e depois do local de inserção. Na Etapa 2, o fragmento LightR assim produzido é mostrado para ser usado como um "megaprimer" para inserção de LightR no gene da enzima alvo por mutagênese dirigida ao local de mudança rápida. Os painéis A-C foram adaptados e modificados com permissão de Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig02.jpg"> 
Figura 2: Caracterização bioquímica de LightR-Proteins. (A) Representação esquemática do protocolo experimental para caracterização bioquímica de LightR Src. (B) As células LinXE que expressam transitoriamente a construção LightR Src com um mCherry e uma etiqueta myc no terminal C foram continuamente iluminadas com luz azul por 60 min, usando uma configuração de LED de 465 nm. Os lisados celulares foram sondados quanto à fosforilação de substratos Src, paxilina e p130Cas. Os resultados do Western Blot mostram fosforilação da paxilina endógena e p130Cas em resposta à ativação de LightR-Src em células vivas. (C, D) As células LinXE que expressam transitoriamente as construções LightR-Src indicadas com a etiqueta tandem mCherry-myc no terminal C foram continuamente expostas à luz azul por tempos especificados (0 min e 30 min) e depois colocadas no escuro por períodos de tempo indicados. Os lisados celulares foram sondados para fosforilação de substratos de Src, mostrando a comparação da cinética de ativação e desativação entre (C) LightR-Src e (D) FastLightR-Src. (E) As células LinXE que expressam transitoriamente as construções LightR-Src indicadas com a etiqueta tandem mCherry-myc no terminal C foram continuamente expostas à luz azul por 20 minutos, seguidas de incubação repetida no escuro por 10 minutos e na luz por 20 minutos. Os lisados celulares foram coletados e sondados para fosforilação de substratos de Src, mostrando a eficiência da ciclagem de Src quinase entre os estados de ativação e inativação. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes com resultados semelhantes. Os números exibidos ao lado de cada painel de western blot B-E representam os pesos moleculares das proteínas, medidos em kilodaltons (kDa). Os painéis B-E foram adaptados e modificados com permissão de Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig03v3.jpg"> 
Figura 3: Controle de iluminação global e temporal e efeito na atividade do FastLightR-Src. (A) Representação em desenho animado do esquema experimental de iluminação cíclica global e temporal e as análises de dados subsequentes. (B, C) A regulação da morfologia celular e a localização de FastLightR-Src por luz azul são representadas em imagens representativas de células HeLa obtidas de uma série de lapso de tempo usando microscopia de fluorescência de campo amplo. Essas células estavam co-expressando transitoriamente FastLightR-Src-mCherry-myc (N = 10 células) ou D388RLightR-Src-mCherry-myc cataliticamente inativo (N = 9 células) junto com Stargazin-iRFP670 (marcador de membrana plasmática). A imagem de células vivas foi realizada a cada minuto, enquanto as células eram iluminadas globalmente com luz azul (contornos azuis). (B) As setas amarelas destacam a localização do FastLightR-Src em estruturas que se assemelham a aderências focais. As imagens foram obtidas a partir de uma série de lapso de tempo de células HeLa usando microscopia de fluorescência de campo amplo. (C) A quantificação das mudanças na área celular induzidas pela ativação de FastLightR-Src vs. D388RLightR-Src é mostrada em cada painel. A janela de iluminação é indicada como retângulos azuis. Os gráficos representam intervalos de confiança médios ± 90%. Os painéis B e C foram adaptados e modificados com permissão de Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig04.jpg"> 
Figura 4: Controle de iluminação subcelular local e efeito na atividade do FastLightR-Src. (A) Representação em desenho animado do esquema experimental de controle de iluminação subcelular local. (B) (i) Sequência de lapso de tempo ilustrando uma célula HeLa expressando FastLightR-Src-mCherry, localmente iluminada com luz azul (representada por um círculo azul). As imagens foram capturadas a cada minuto usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (objetiva de 60x). As imagens são apresentadas como imagens de contraste invertido obtidas em intervalos de tempo especificados. (ii) Imagens de projeção de células exibindo saliências formadas durante intervalos de tempo especificados. Limitar e mascarar a morfologia celular ao longo da linha do tempo experimental representa a plataforma para analisar a disseminação celular e a dinâmica da borda celular. A área iluminada especificada da célula é delineada por um círculo azul. (C) (i) Gráfico polar para células que representam a distância de migração do centróide (d) e o ângulo de desvio (θ) em relação à iluminação local da luz azul. Os pontos pretos representam células HeLa individuais expressando D388RLightR-Src cataliticamente inativo (N = 6 células) ou FastLightR-Src (N = 10 células). (ii) Representação esquemática demonstrando a distância de deslocamento do centróide (d) percorrida pelo centróide da célula desde o início (1) até a conclusão (2) da estimulação local da luz azul. O ângulo de desvio (θ) indica a extensão da divergência do movimento do centróide da célula em relação à localização da luz azul. O sombreamento cinza claro indica a região projetada pela célula em resposta à estimulação local do FastLightR-Src. A área iluminada especificada da célula é indicada por um círculo azul sólido. Os painéis B e C foram adaptados e modificados de Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig05.jpg"> 
Figura 5: Ampla aplicabilidade da abordagem LightR. (A) Regulação do LightR-bRaf. As células LinXE que expressam transitoriamente LightR-bRaf-Venus, D575R LightR-bRaf Venus cataliticamente inativo ou bRaf (V600E)-Venus constitutivamente ativo foram expostas à luz azul contínua pelo período de tempo especificado. Os lisados celulares foram sondados para a fosforilação das proteínas indicadas. (B) Imagens representativas obtidas de uma série de lapso de tempo de imagens de células vivas usando microscopia de fluorescência de campo amplo ilustram a regulação da resposta global à luz azul em células LinXE que co-expressam transitoriamente FastLightR-bRaf-Venus e mCherry-ERK2. Essas células foram iluminadas globalmente com luz azul (pulsos de 50 ms a cada segundo, 50 pulsos por minuto) por durações especificadas delineadas em azul. Imagens de células vivas de mCherry-ERK2 foram realizadas a cada minuto. As setas amarelas destacam os estágios da localização nuclear de ERK2 induzida pela ativação da luz azul do bRaf projetado. (C) As células LinXE foram co-transfectadas transitoriamente com um repórter Floxed-stop-mCherry e LightR-Cre-iRFP670. As células foram submetidas a condições escuras ou luz azul pulsante (2 s ligado, 10 s desligado) por até 8 h. As imagens para todos os pontos de tempo de cada canal foram adquiridas usando um microscópio de fluorescência de campo amplo (objetiva de 10x) em configurações idênticas e foram ajustadas para níveis consistentes de brilho e contraste para facilitar a comparação dos níveis de expressão de proteínas entre as amostras. O experimento foi repetido pelo menos três vezes, produzindo resultados semelhantes. A figura foi adaptada e modificada de Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela suplementar 1: Sequência LightR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 2: Descrição dos locais de inserção de LightR e lista de verificação para o design da proteína LightR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 3: Primers para clonagem LightR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%203.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 4: Condições de transfecção para análise bioquímica da atividade da LightR-Protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%204.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 5: Condições de transfecção para análise baseada em imagem da atividade da LightR-Protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%205.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 1: Iluminação pulsada usando o Ambiente de Desenvolvimento Integrado (IDE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo suplementar 2: Configurações de iluminação do microscópio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%202_Updated.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Controle espaço-temporal da atividade proteica por meio da regulação alostérica optogenética

Optogenetics offers the potential for mimicking complex spatiotemporal control of enzyme activity down to a subcellular resolution. However, most ...

spatiotemporal-control-protein-activity-through-optogenetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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