Name: Visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em vênulas mesentéricas após lesão de isquemia-reperfusão mesentérica por microscopia intravital (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Aprenda a visualizar armadilhas extracelulares de neutrófilos em vênulas mesentéricas após lesão de isquemia-reperfusão por microscopia intravital em modelo murino. Este método permite observar dinâmicas celulares in vivo.

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<meta charset="utf8"></head><body>Papel endotelial de PAR1 na adesão de leucócitos e formação de TNE durante lesão de I/R

<table><tbody><tr><td>Laranja acridina</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>&nbsp; Placa de 96 poços A-6014</td><td></td></tr><tr><td>Multiply PCR-Platten&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>721977202.00</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de anestesia para roedores</td><td>GROPPLER medizintechnik</td><td>Uni Vet -Porta T-8</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia IVM</td><td>B Braun Melsungen</td><td>53402101</td><td></td></tr><tr><td>massa preta</td><td>Staedtler</td><td></td><td>massa de modelar</td></tr><tr><td>CD146 Microesferas, rato</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-007</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus</td><td>Olympus cellSense Dimension Desktop 2.3</td><td>câmera</td></tr> de <tr><td>dispositivo de carga acoplada com software</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>ORCA-R2</td><td>câmera</td></tr><tr><td>cotonetes</td><td>B&ouml; ttger</td><td>09-119-9100</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat Curvado 125mm/5"</td><td>Indigo Instruments&nbsp;</td><td>22466</td><td></td></tr><tr><td>Creme depilatório</td><td>Balea</td><td>não aplicável</td><td></td></tr><tr><td>Dorbene Vet</td><td>zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Etanol p.a. 99,5 %</td><td>Roth</td><td>5504.20</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Extra Estreita &ndash; Straight/Sharp-Sharp/10.5</td><td>FST</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Janssen-Cilag GmBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fórceps "Dumont #5" (Inox, ponta 0.1mm, comprimento 11 cm)</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Graphpadprism</td><td>Graphpad</td><td>Prism 10</td><td>software</td></tr><tr><td>isoflurano&nbsp;</td><td>Piramal</td><td>4150097146757.00</td><td></td></tr><tr><td>iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5ml</td><td>BioRad</td><td>1725125.00</td><td></td></tr><tr><td>Fita médica Leukofix</td><td>BSNMedical</td><td>0213600</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Dissociação do Fígado, mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-807</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de separação LS MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Smart Strainer 100 &micro; m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>Microseal B Seal Seals</td><td>Biorad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>hameln</td><td>5918501.00</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>Braun 2350748</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas</td><td>FST</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de Seda Trançada Não Absorvível, Tamanho: 7/0, 91 Metros&nbsp;</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>18020-70</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência Olympus BX51WI</td><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>PCR para tiras de tubo</td><td>Sarstedt</td><td>72985002.00</td><td></td></tr><tr><td>Tampas de tubo PCR</td><td>Sarstedt</td><td>65989002.00</td><td></td></tr><tr><td>Cateter de plietileno</td><td>Smith Medical Deutschland GmbH</td><td>800/100/100</td><td></td></tr><tr><td>Prolene (8648G), polipropileno 6-0, Matéria&nbsp;</td><td>Johnson & Johnson Medical GmbH</td><td>8695H</td><td></td></tr><tr><td>Relia Prep RNA Miniprep Systems</td><td>Promega</td><td>Z6112</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Inscrição Reversa (cDNA de Alta Capacidade)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813.00</td><td></td></tr><tr><td>Escala escolar&nbsp;</td><td>KERN & SOHN GmbH</td><td>EMB 500-1</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Mola - Inclinada para o Lado</td><td>FST</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo</td><td>Leica</td><td>M50</td><td></td></tr><tr><td>Straight Hemostats 135mm/5.5"</td><td>Indigo Instruments&nbsp;</td><td>22468</td><td></td></tr><tr><td>Seringa 1 mL</td><td>Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Laranja</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de Temperatura TC-1000</td><td>FMI F&ouml; hr Medical Instruments GmbH</td><td>não aplicável</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de tecido - 1x2 dentes</td><td>FST</td><td>18057-14</td><td></td></tr><tr><td>braçadeira vascular</td><td>Fine Science Tools</td><td>18055-02</td><td></td></tr><tr><td>Vetiva mini</td><td>WAHL</td><td>1584-0480</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em vênulas mesentéricas após lesão de isquemia-reperfusão mesentérica por microscopia intravital

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules After Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy

Para estudar os efeitos dependentes das células endoteliais no rolamento e adesão de leucócitos, bem como na formação de NET, inicialmente, a eficácia da deficiência de F2r induzível por VE-Caderina Cre foi examinada em células endoteliais. A classificação magnética de células foi empregada para isolar as células endoteliais hepáticas. Posteriormente, o RNA foi isolado, seguido por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Os camundongos F2rΔEC , nos quais a Cre recombinase expressa sob o controle do promotor VE-Caderina está ausente, mostraram níveis de mRNA F2r (PAR1) significativamente reduzidos (aprox. em um terço) em comparação com os controles WT (Figura 1).
Após a confirmação da deficiência na linhagem de camundongos, a lesão I/R mesentérica foi realizada para examinar o impacto da PAR1 expressa pelas células endoteliais vasculares no rolamento e adesão dos leucócitos, visualizada por microscopia intravital (Figura 2A,B). Após 1 h de isquemia, a pinça foi removida e o vaso foi autorizado a reperfundir. O rolamento e a adesão dos leucócitos foram observados e registrados (corados de verde, indicados por setas brancas). Embora ambos os grupos tenham mostrado aumento do número de leucócitos aderentes após a lesão de I/R, a deficiência de F2r endotelial (PAR1) resultou em uma adesão leucocitária acentuada, mas não significativamente diminuída, ao endotélio mesentérico ativado por I/R, sugerindo um papel ativo da ativação endotelial de PAR1 no recrutamento de leucócitos para as vênulas mesentéricas isquêmicas (Figura 2C).
O próximo objetivo foi examinar se a expressão endotelial de PAR1 regula a formação de NET induzida por lesão de I/R. Portanto, os ácidos nucléicos extracelulares foram corados com um corante impermeável às células30 e visualizados os TNEs gerados usando microscopia intravital (indicada por setas pretas) (Figura 2A,B). Após a lesão de I/R, os TNEs foram observados apenas no grupo WT expressando níveis normais de PAR1 nas células endoteliais, indicando um papel regulador de PAR1 na NETosis (Figura 2C,D). Notavelmente, quando a expressão endotelial de F2r foi suprimida, nenhum NETs estava presente nas vênulas mesentéricas lesionadas por I / R.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67264/67264fig01.jpg"> 
Figura 1: Expressão de mRNA F2r (PAR1). Expressão de células endoteliais hepáticas F2r de camundongos WT (n = 6) e F2rΔEC (n = 9) em relação ao gene de manutenção L32. Os dados são apresentados como mediana com intervalo de confiança de 95%. O teste de Mann-Whitney foi utilizado para comparar dois grupos independentes, *p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67264/67264fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67264/67264fig02.jpg"> 
Figura 2: PAR1 endotelial afeta a adesão leucocitária e a formação de NET em vênulas mesentéricas lesadas por I/R. Imagens representativas de microscopia intravital de leucócitos aderentes corados com laranja de acridina (setas brancas) e NETs corados com Sytox Orange (setas pretas) de camundongos WT e F2rΔEC antes (pré) e depois (pós) lesão de I/R (A) 10x e (B) 20x de aumento. Barras de escala: A, 50 μm; B, 20 μm. (C) Adesão leucocitária e (D) NETs por mm2 de camundongos WT (n = 7) e F2rΔEC (n = 4) antes (pré) e depois (pós) lesão de I / R. Todos os dados foram representados como mediana com intervalo de confiança de 95%. As comparações estatísticas foram realizadas por meio do teste ANOVA de duas vias, **p&lt; 0,01, e dos testes de comparações múltiplas de Sídák para comparar as médias de diferentes genótipos em cada momento (pré e pós-isquemia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67264/67264fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em vênulas mesentéricas após lesão de isquemia-reperfusão mesentérica por microscopia intravital

Intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury is an acute condition characterized by tissue damage resulting from restricted blood flow to the mesenteric ...

visualization-neutrophil-extracellular-traps-mesenteric-venules-after

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Neutrófilos Traps Extracelular (NET) são um mecanismo inato importante imunológico para combater as bactérias patogênicas, fungos e parasitas. Aqui nós descrevemos métodos para isolar granulócitos neutrófilos do sangue humano e para ativá-las para formar redes. Nós apresentamos técnicas de preparação para visualizar NETs em microscopia óptica e eletrônica.

Neutrófilos Traps Extracelular: Como Gerar e visualizá-los

Nós descrevemos um protocolo de brightfield microscopia intravital para medir a dinâmica interações neutrófilos-célula endotelial durante o recrutamento de neutrófilos em resposta à fonte de um chemoattractant neutrófilos in vivo. Neutrófilos rastejando intraluminal, a migração transendotelial e quimiotaxia em tecido muscular do rato cremaster são visualizados com o tempo decorrido, fotografia, vídeo e rastreados com ImageJ.

Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

Este vídeo demonstra a indução e visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos ou TNEs em neutrófilos pré-marcados usando soro de paciente contendo anticorpos anticitoplasma de neutrófilos. Além disso, o uso de um corante de DNA impermeável e microscopia de fluorescência permite a visualização de NETs.

Indução e visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em neutrófilos pré-marcados

Aqui descrevemos uma técnica experimental de microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos. Esta tecnologia microscópico será valiosa para estudar o mecanismo molecular da doença vascular e para testar agentes farmacológicos, em condições fisiopatológicas.

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Esta aplicação simplificada de microscopia intravital de veias mesentérias em camundongos pode ser usada em diferentes modelos de inflamação para observar as interações leucócitos-endoteliais e plaquetas-leucócitos.

Interações Intravital Microscopia de leucócito-endothelial e plaquetas-leucócitos em mesenterial Veias Ratos

Detalhamos um protocolo para monitorar o comportamento de neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas em estado estacionário e condições inflamatórias usando microscopia confocal intravital em camundongos anestesiados.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Este protocolo descreve a indução de um modelo de isquemia-reperfusão (IR) em pele de orelha de rato usando íman de fixação. Usando um modelo de imagens intravital custom-built, estudamos nas respostas inflamatórias in vivo pós-reperfusão. A lógica por trás do desenvolvimento desta técnica é ampliar a compreensão de como leucócitos responder a uma lesão IR pele.

Induzindo a lesão de isquemia-reperfusão na pele da orelha de rato por Intravital Multiphoton imagem de respostas imunes

Os monócitos são importantes mediadores de arteriogenesis no contexto da doença arterial periférica. Usando uma membrana basal, como matriz e microscopia intravital, este protocolo investiga monócito homing e relacionados ao tumor angiogênese após injeção de monócitos no modelo murino de ligadura de artéria femoral.

Microscopia intravital de monócitos Homing e angiogênese relacionados ao Tumor em um modelo murino de Doença Arterial periférica

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são estruturas tridimensionais geradas por granulócitos estimulados de neutrófilos. Tornou-se claro nos últimos anos que as redes estão envolvidas em uma grande variedade de doenças. A detecção de redes no tecido pode ter relevância diagnóstica, sendo necessários protocolos padronizados para a rotulagem de componentes NET.

Rotulagem de imunofluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e murinos em tecido embebido em parafina

Descrevemos um método para identificar armadilhas extracelulares (NETs) em trombo cardiogênico felino fixo e parafinado de parafina usando recuperação de antígeno induzido pelo calor e um protocolo de rotulagem de dupla imunorotulagem.

Identificação de Armadilhas Extracelulares De Neutrófilos em Trombo Arterial Felino Embutido parafina usando Microscopia de Imunofluorescência

Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) estão associadas a várias doenças, e a imunofluorescência é frequentemente usada para sua visualização. No entanto, existem vários protocolos de coloração e, em muitos casos, apenas um tipo de tecido é examinado. Aqui, estabelecemos um protocolo geralmente aplicável para coloração de NETs em tecido humano e de camundongo.

Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

Aprenda a visualizar armadilhas extracelulares de neutrófilos em vênulas mesentéricas após lesão de isquemia-reperfusão por microscopia intravital em modelo murino. Este método permite observar dinâmicas celulares in vivo.

Visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em vênulas mesentéricas após lesão de isquemia-reperfusão mesentérica por microscopia intravital (Vídeo) | JoVE Journal

Visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em vênulas mesentéricas após lesão de isquemia-reperfusão mesentérica por microscopia intravital

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