Visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em vênulas mesentéricas após lesão de isquemia-reperfusão mesentérica por microscopia intravital

O papel de genes específicos no início e no desenvolvimento da trombose, neste caso, investigamos a expressão endotelial de PAR1 na lesão de isquemia-reperfusão. Tentamos identificar o efeito do endotélio na resposta, tanto após a isquemia quanto durante a reperfusão. Um aspecto realmente importante que é pouco estudado até agora é identificar o papel dos comensais intestinais na lesão de isquemia-reperfusão mesentérica.

Para estudar essa questão, nosso grupo combinou microscopia intravital com um modelo de lesão de isquemia-reperfusão mesentérica, e combinamos isso com modelos de camundongos livres de germes. A aplicação de modelos de trombose em camundongos transgênicos em combinação com microscopia intravital, tais tecnologias permitem a observação in vivo dos comportamentos celulares durante o início da doença. Realizar modelos experimentais em organismos vivos é sempre um desafio, pois o experimento é influenciado por muitos fatores, incluindo sexo, idade, tratamento anestésico, mudanças nos regulamentos de bem-estar animal, etc.

Além disso, a pesquisa em trombose começou no século passado. Muitos fatores contribuintes ainda não foram resolvidos. Meu grupo estuda o papel da microbiota intestinal na trombose, aterosclerose, função plaquetária e vascularização.

Para começar, posicione o camundongo anestesiado e raspado em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento. Conecte o mouse ao sistema de oxigênio por meio de um cone nasal. Prenda os membros do mouse à almofada aquecida com fita cirúrgica.

Para a implantação do cateter na veia jugular, faça uma incisão transversal sobre a traqueia. Remova a pele que cobre o pescoço e isole a veia jugular direita. Em seguida, usando um fio de seda de cinco centímetros, feche a extremidade distal da veia e fixe-a com uma pinça cirúrgica.

Coloque três fios de seda aproximadamente dois centímetros abaixo da veia, um perto da extremidade distal e dois perto da extremidade proximal da veia jugular. Dê um nó cirúrgico, mas não feche o vaso. Encha um cateter de polietileno com cloreto de sódio a 0,9%.

Remova as bolhas de ar e conecte-o em uma seringa de um mililitro. Use uma tesoura para fazer um orifício entre o segundo e o terceiro nós e implante o cateter na veia jugular. Aspire a seringa para garantir que haja sangue no cateter.

Amarre o fio de seda para prender o cateter na veia. Em seguida, use uma fita médica para prender a seringa. Encha as seringas de um mililitro com laranja de acridina na concentração final de 0,5 miligramas por mililitro e corante de ácido nucleico com concentração de cinco micromolares.

Injete 50 microlitros de SYTOX Orange para armadilhas extracelulares de neutrófilos, ou NETs. Desinfete a pele abdominal do camundongo com rodadas alternadas de esfoliantes à base de iodo e álcool. Em seguida, usando um bisturi, faça uma laparotomia de três a cinco centímetros ao longo da alba linear.

Posicione suavemente o intestino para fora da cavidade abdominal usando duas pontas de algodão umedecidas com solução salina e identifique um local com cobertura mínima de gordura. Posicione pequenos ramos do intestino em uma massa preta para reduzir o sinal de fundo. Injete 50 microlitros de laranja de acridina através do cateter da veia jugular para visualizar os leucócitos corados.

Adquira o vídeo do intestino antes da reperfusão da isquemia. Prepare uma compressa umedecida com cloreto de sódio e coloque o intestino nela. Ocluir a artéria mesentérica superior com uma pequena pinça vascular.

Empurre suavemente o intestino de volta para a cavidade abdominal usando cotonetes umedecidos com solução salina. Use uma sutura 7-0 para fechar a parede abdominal e evitar a perda de umidade e temperatura. Após uma hora, remova a sutura.

Após o período isquêmico, aplique algumas gotas de solução salina na área cortada. Em seguida, remova suavemente os clipes microvasculares usando um aplicador de clipe. Usando pontas de algodão umedecidas com solução salina, posicione suavemente o intestino novamente para fora da cavidade abdominal e posicione os pequenos ramos da veia em uma massa preta.

Injetar 50 microlitros de laranja de acridina e capturar o vídeo pós-isquêmico da veia. Ligue o microscópio de fluorescência de campo amplo de alta velocidade equipado com um condensador de longa distância, um monocromador, uma objetiva de imersão em água 10 vezes maior e uma câmera de dispositivo de carga acoplada. Defina o tempo de exposição para 30 milissegundos e selecione o canal 5B com os filtros Alexa Fluor 488 e Rhodamine Red instalados para visualizar os leucócitos e TNEs.

Quantifique o recrutamento celular dentro de uma região de interesse de 0,06 milímetro quadrado. Em seguida, quantifique os leucócitos aderentes contando as células que permaneceram estacionárias ou presas ao revestimento endotelial durante um período de observação de 20 segundos. Identifique NETs marcados com corantes fluorescentes de leucócitos e ácidos nucleicos.

A adesão de leucócitos ao endotélio mesentérico isquêmico aumentou nos grupos de tipo selvagem e delta EC F2r após lesão de isquemia-reperfusão, com uma adesão notavelmente menor observada no grupo delta EC F2r, implicando um papel do PAR1 endotelial no recrutamento de leucócitos. Após a lesão de isquemia-reperfusão, os TNEs foram observados apenas no grupo selvagem expressando níveis normais de PAR1 nas células endoteliais, indicando um papel regulador de PAR1 na NETose.