Name: Usando Mycobacterium smegmatis como um bioindicador para condições de crescimento limitado por zinco em micobactérias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprenda a usar Mycobacterium smegmatis como bioindicador para condições de crescimento limitado por zinco em micobactérias. Este método padronizado permite estudar adaptações bacterianas e proteínas ribossômicas alternativas.

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Este estudo foi financiado pelo Prêmio CAREER da National Science Foundation (NSF) 1844854, pelo Prêmio de Inovação da American Lung Association IA -937538 e pelo Instituto Nacional de Saúde (NIH) NIAID R21 AI109293 para SP O endereço atual da Allexa D. Burger é o Centro de Pesquisa em Biociências do Pacífico, Universidade do Havaí em Mānoa, Honolulu, Havaí, EUA.

Assessing Bioindicator Phenotypes for Zinc Limitation in M. smegmatis

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<li>Middag, R., de Baar, H. J. W., Bruland, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationships+between+dissolved+zinc+and+major+nutrients+phosphate+and+silicate+along+the+GEOTRACES+GA02+transect+in+the+west+Atlantic+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Biogeochem+Cycles%22%5BJournal%5D)">The relationships between dissolved zinc and major nutrients phosphate and silicate along the GEOTRACES GA02 transect in the west Atlantic ocean.</a> Global Biogeochem Cycles. 33 (1), 63-84 (2019).</li>
<li>Corbin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelation+and+inhibition+of+bacterial+growth+in+tissue+abscesses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses.</a> Science. 319 (5865), 962-965 (2008).</li>
<li>Panina, E. M., Mironov, A. A., Gelfand, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+bacterial+zinc+regulons%3A+Enhanced+ion+transport%2C+pathogenesis%2C+and+rearrangement+of+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of bacterial zinc regulons: Enhanced ion transport, pathogenesis, and rearrangement of ribosomal proteins.</a> Proc Natl Acad Sci. 100 (17), 9912-9917 (2003).</li>
<li>Outten, C. E., O’Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtomolar+sensitivity+of+metalloregulatory+proteins+controlling+zinc+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Femtomolar sensitivity of metalloregulatory proteins controlling zinc homeostasis.</a> Science. 292 (5526), 2488-2492 (2001).</li>
<li>Merchant, S. S., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+economy%3A+microbial+strategies+for+optimizing+growth+in+the+face+of+nutrient+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Micro+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elemental economy: microbial strategies for optimizing growth in the face of nutrient limitation.</a> Adv Micro Physiol. 60, 91-210 (2012).</li>
<li>Makarova, K. S., Ponomarev, V. A., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+C+or+not+two+C%3A+recurrent+disruption+of+Zn-ribbons%2C+gene+duplication%2C+lineage-specific+gene+loss%2C+and+horizontal+gene+transfer+in+evolution+of+bacterial+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Biol%22%5BJournal%5D)">Two C or not two C: recurrent disruption of Zn-ribbons, gene duplication, lineage-specific gene loss, and horizontal gene transfer in evolution of bacterial ribosomal proteins.</a> Genom Biol. 2 (9), RESEARCH 0033(2001).</li>
<li>Yutin, N., Puigbò, P., Koonin, E. V., Wolf, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenomics+of+prokaryotic+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phylogenomics of prokaryotic ribosomal proteins.</a> PLoS One. 7 (5), e36972(2012).</li>
<li>Prisic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+regulates+a+switch+between+primary+and+alternative+S18+ribosomal+proteins+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Zinc regulates a switch between primary and alternative S18 ribosomal proteins in Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol Microbiol. 97 (2), 263-280 (2015).</li>
<li>Dow, A., Prisic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+ribosomal+proteins+are+required+for+growth+and+morphogenesis+of+Mycobacterium+smegmatis+under+zinc+limiting+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Alternative ribosomal proteins are required for growth and morphogenesis of Mycobacterium smegmatis under zinc limiting conditions.</a> PLoS One. 13 (4), e0196300(2018).</li>
<li>Chen, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+translation+by+alternative+bacterial+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Selective translation by alternative bacterial ribosomes.</a> Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19487-19496 (2020).</li>
<li>Natori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fail-safe+system+for+the+ribosome+under+zinc-limiting+conditions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A fail-safe system for the ribosome under zinc-limiting conditions in Bacillus subtilis.</a> Mol Microbiol. 63 (1), 294-307 (2007).</li>
<li>Gabriel, S. E., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+Zur-controlled+ribosomal+proteins+to+growth+under+zinc+starvation+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Contributions of Zur-controlled ribosomal proteins to growth under zinc starvation conditions.</a> J Bacteriol. 191 (19), 6116-6122 (2009).</li>
<li>Wolf, Y. I., Rogozin, I. B., Kondrashov, A. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+alignment%2C+evolution+of+prokaryotic+genome+organization%2C+and+prediction+of+gene+function+using+genomic+context%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Res%22%5BJournal%5D)">Genome alignment, evolution of prokaryotic genome organization, and prediction of gene function using genomic context.</a> Genom Res. 11 (3), 356-372 (2001).</li>
<li>Akanuma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+ribosomal+protein+S14+demonstrated+by+the+reconstruction+of+chimeric+ribosomes+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Evolution of ribosomal protein S14 demonstrated by the reconstruction of chimeric ribosomes in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 203 (10), e00599(2021).</li>
<li>Owen, G. A., Pascoe, B., Kallifidas, D., Paget, M. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-responsive+regulation+of+alternative+ribosomal+protein+genes+in+Streptomyces+coelicolor+involves+Zur+and+%CF%83R%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Zinc-responsive regulation of alternative ribosomal protein genes in Streptomyces coelicolor involves Zur and σR.</a> J Bacteriol. 189 (11), 4078-4086 (2007).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+depletion+induces+ribosome+hibernation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Zinc depletion induces ribosome hibernation in mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (32), 8191-8196 (2018).</li>
<li>Li, Y., Corro, J. H., Palmer, C. D., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+from+remodeling+to+hibernation+of+ribosomes+in+zinc-starved+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Progression from remodeling to hibernation of ribosomes in zinc-starved mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19528-19537 (2020).</li>
<li>Graham, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+zinc+depletion+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Severe zinc depletion of Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 284 (27), 18377-18389 (2009).</li>
<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+biochemistry%2C+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 80 (2), 451-493 (2016).</li>
<li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+F+420+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel F 420 -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Mol Microbiol. 87 (4), 744-755 (2013).</li>
<li>Patino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+of+mycobacteria+as+a+tool+for+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence of mycobacteria as a tool for detection of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 46 (10), 3296-3302 (2008).</li>
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<li>Tobiasson, V., Dow, A., Prisic, S., Amunts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+depletion+does+not+necessarily+induce+ribosome+hibernation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Zinc depletion does not necessarily induce ribosome hibernation in mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 116 (7), 2395-2397 (2019).</li>
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<li>Singh, A. K., Reyrat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Mycobacterium smegmatis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit10C.1(2009).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Sampson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+elicited+by+a+double+Leucine+and+Pantothenate+auxotroph+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+Guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immunity%22%5BJournal%5D)">Protection elicited by a double Leucine and Pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in Guinea pigs.</a> Infect Immunity. 72 (5), 3031-3037 (2004).</li>
<li>Cheeseman, P., Toms-Wood, A., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+properties+of+a+fluorescent+compound+factor420%2C+from+Methanobacterium+strain+M.o.H%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation and properties of a fluorescent compound factor420, from Methanobacterium strain M.o.H.</a> J Bacteriol. 112 (1), 527-531 (1972).</li>
<li>Wayne, L. G., Hayes, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+for+sequential+study+of+shiftdown+of+Mycobacterium+tuberculosis+through+two+stages+of+nonreplicating+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immunity%22%5BJournal%5D)">An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence.</a> Infect Immunity. 64 (6), 2062-2069 (1996).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

Uma grande contribuição para a lacuna de conhecimento sobre os fundamentos mecanicistas dos ribossomos Alt é a dificuldade em alcançar condições limitantes de Zn2+ in vitro. A contaminação por traços de Zn2+ no ambiente de laboratório é comum; assim, alcançar condições de crescimento limitadas por Zn2+ reprodutíveis é um desafio. A contaminação por Zn2+ pode se originar de várias fontes, embora a fonte mais significativa e comum de contaminação e variabilidade seja a água ultrapura usada para enxaguar materiais de laboratório e fazer meios. Os sistemas de água ultrapura devem ser mantidos adequadamente e devem ser lavados por 1 minuto antes de enxaguar o material de laboratório ou usar água como meio. Os frascos que não são lavados ou bem enxaguados com água ultrapura podem causar contaminação por Zn2+ , e isso será aparente pelo aumento da densidade celular em certos frascos, mas não em outros do mesmo lote de ZLM. Frascos novos podem ser usados para avaliar se a fonte de contaminação por Zn2+ é de frascos ou meios reutilizados. A contaminação por Zn2+ no ZLM deve ser remediada pelo aumento do enxágue dos itens usados para fazer mídia e um conjunto designado de materiais para a preparação do ZLM. Se nenhuma dessas medidas for bem-sucedida em atingir os fenótipos bioindicadores esperados, o [Zn2+] em água ultrapura e ZLM deve ser quantificado para descartar a possibilidade de que a fonte de água esteja contaminada com Zn2+. Conforme relatado anteriormente, o [Zn2+] de ZLM é de 115 ± 37 nM23, e concentrações abaixo de 70 nM e acima de 150 nM geralmente levam a fenótipos depletados de Zn2+ e contaminados com Zn2+, respectivamente. No entanto, uma boa preparação do meio é apenas um fator que afeta o resultado, e Zn2+ inadequado ou excessivo pode ocorrer devido à preparação inadequada do inóculo e/ou cultura, ou seja, decantação deficiente do meio repleto de Zn2+ durante as etapas de lavagem. Todas as culturas de M. smegmatis incluídas aqui foram preparadas da mesma maneira - os resultados de crescimento contaminados com Zn2+ (ZLM-C) e empobrecidos com Zn2+ (ZLM-D) são incluídos para destacar a variabilidade que pode ocorrer entre diferentes lotes de meios usando o mesmo sistema de água ultrapura, mesmo quando os experimentos são feitos corretamente.
Para garantir que as células de cultura em ZLM produzam fenótipos bioindicadores limitantes de Zn2+ reprodutíveis, é importante rotular exclusivamente os frascos, sempre usá-los para a mesma condição (ou seja, com ZLM ou ZRM), rastrear frascos em vários usos e descartar frascos que estão no final de seu ciclo de vida ou que continuam a produzir fenótipos bioindicadores contaminados com Zn2+ com ZLM. A preparação adequada do inóculo é muito importante para alcançar o crescimento limitante do Zn2+, pois o transporte de Zn2+ de células de sementes inadequadamente lavadas é uma fonte comum de contaminação por Zn2+ que pode ser difícil de analisar a partir de ZLM contaminado com Zn2+. As culturas de M. smegmatis devem ser analisadas e colhidas após 72 h de crescimento em ZLM (e ZRM cultivado em paralelo). A morfogênese e os fenótipos bioindicadores são pronunciados de 48 a 72 h; portanto, avaliar ou colher culturas para limitação de Zn2+ muito cedo (ou muito tarde) pode não produzir o fenótipo bioindicador completo. As culturas que são empobrecidas em Zn2+ exibirão comprimentos de células semelhantes às que estão contaminadas com Zn2+; assim, F420 fluorescência e OD600 devem ser usados para diferenciar os dois. Da mesma forma, as culturas contaminadas com Zn2+ nem sempre crescem melhor do que as bactérias limitadas por Zn2+, mas a fluorescência F420 e o comprimento celular do tipo selvagem e o mutante ΔaltRP devem revelar se a condição limitada por Zn2+ é alcançada.
O mesmo vale para M. tuberculosis, pois a perda do fenótipo do bioindicador F420 em culturas limitadas a Zn2+ é pronunciada entre 8-10 dias de crescimento em ZLM. Embora M. tuberculosis não exiba um forte fenótipo bioindicador limitado por Zn2+ como M. smegmatis, o método de crescimento apresentado aqui tem sido usado para associar a perda do fenótipo do bioindicador F420 com o crescimento limitado por Zn2+ usando ensaios funcionais e transcriptômica nas cepas virulentas e atenuadas de M. tuberculosis (ref23e dados não publicados). Portanto, seguir a fluorescência F420 é uma maneira acessível de monitorar e verificar condições biológicas limitantes de Zn2+ em M. tuberculosis. É importante notar que o mecanismo que leva à redução da fluorescência F420 durante as condições limitantes de Zn2+ permanece sem solução, assim como a distinção de se a fluorescência reduzida se deve à diminuição da abundância do pool de coenzimas como um todo ou a uma mudança em seu estado redox, uma vez que apenas a forma oxidada emite fluorescência29.
Conforme demonstrado aqui, a preparação de meios limitantes de Zn2+ é matizada e existem vários fatores que podem influenciar a concentração efetiva de íons Zn2+ no meio, mesmo seguindo o mesmo protocolo e usando os mesmos reagentes. Traços de Zn2+ em ZLM permitem crescimento e expressão suficientes do fenótipo limitante de Zn2+. Essa diminuição gradual de Zn2+ para atingir a limitação é semelhante ao modelo de hipóxia de Wayne, no qual o oxigênio é gradualmente consumido por bactérias cultivadas em um frasco fechado30. Como a hipóxia e os fenótipos limitados por Zn2+ dependem do crescimento bacteriano, se não houver oxigênio suficiente, ou neste modelo, Zn2+, no inóculo ou meio, as bactérias pararão de crescer antes de serem capazes de se submeter ao programa morfogênico relevante. Portanto, embora a contaminação por Zn2+ seja um problema mais óbvio quando se deseja atingir a limitação de Zn2+ , a depleção de Zn2+ também pode representar um problema devido ao comprometimento do crescimento e ao gatilho dependente de Zn2+ perdido durante o crescimento ativo. Além disso, o uso de leitores de placas monocromadores ou baseados em filtro com modos de leitura superior ou inferior para intensidade de fluorescência afeta ligeiramente a porcentagem F375/420 calculada. Portanto, os valores de cada laboratório podem não ser diretamente comparáveis aos aqui apresentados, mas devem ser semelhantes e seguir as mesmas tendências. Assim, os métodos e procedimentos para fazer ZLM que produza crescimento limitante de Zn2+ devem ser otimizados para cada laboratório e sistema de água ultrapura, e os fenótipos bioindicadores apresentados aqui devem ser usados como padrão para definir condições limitantes de Zn2+.
Devido à dificuldade em padronizar e reproduzir condições de crescimento limitadas por Zn2+, uma abordagem acessível para contornar a contaminação por Zn2+ é adicionar um agente quelante ao meio preparado sem adição de Zn2+. No entanto, essa abordagem confunde a verdadeira resposta biológica à limitação do Zn2+, muitas vezes criando um ambiente carente de Zn2+ e outros micronutrientes. Mesmo os agentes quelantes específicos de Zn2+ demonstraram regular positivamente a resposta à falta de ferro, além da resposta transcricional dependente de Zn2+ em M. tuberculosis23. Além disso, o uso de agentes quelantes requer titulação e tempo cuidadosos para evitar um ambiente severamente carente de Zn2+ que não reflita a resposta biológica durante a mudança de condições limitadas de Zn2+ para Zn2+ ou o crescimento sustentado em ambientes com disponibilidade limitada de Zn2+ livre. Finalmente, a adição de agentes quelantes pode não ser compatível com aplicações a jusante (por exemplo, infecções de macrófagos ou animais). Conclusões fundamentalmente diferentes foram tiradas sobre a forma e função dos ribossomos Alt obtidos com agentes quelantes versus depleção gradual de Zn2+ em culturas de crescimento ativo17,24. Destacados aqui estão diferentes fenótipos resultantes de diferenças relativamente pequenas na pureza da água em diferentes lotes de meios, mesmo quando o procedimento é feito corretamente. O sistema quantificável, reprodutível e biologicamente relevante para a geração de ribossomos Alt apresentado aqui, ou seja, em culturas de tipo selvagem limitadas a Zn2+ sem adição de quelantes, oferece um método padronizado que será fundamental para unificar contribuições em todo o campo para uma melhor compreensão da biologia alternativa do ribossomo.

O íon zinco (Zn2+) é um micronutriente essencial e um componente padrão dos meios microbiológicos. No entanto, muitas bactérias sofrem limitação de Zn2+ no ambiente, pois as condições limitantes de Zn2+ são generalizadas; solo1, marine2 e nichos dentro do hospedeiro3 são frequentemente limitados por Zn2+. Como tal, a maioria das bactérias desenvolveu mecanismos para superar a limitação do Zn2+ e preservar a função celular4. Os sistemas envolvidos na manutenção da homeostase do Zn2+ estão sob rígido controle transcricional5 e estão envolvidos na eliminação do Zn2+ usando sistemas de importação de Zn2+ de alta afinidade, mobilizando reservas celulares de Zn2+ e substituindo certas proteínas de ligação ao Zn2+ por parálogos alternativos independentes de Zn2+6. Um exemplo deste último são os parálogos de proteína ribossômica (RPs) independentes de Zn2+, que são uma característica comum de regulons responsivos a Zn2+ em bactérias4. Esses RPs independentes de Zn2+ altamente divergentes são distinguidos de seus parálogos de ligação de Zn2+ pela interrupção do motivo CXXC de ligação de Zn2+7. Mais da metade dos genomas procarióticos sequenciados contêm pelo menos um par de RPs duplicados onde, em muitos deles, um RP se liga a Zn2+, enquanto seu parálogo não8. Embora a notação C+/C- (indicando a presença/ausência do motivo de ligação Zn2+ rico em cisteína) seja comumente usada em referência a esses pares de RP parálogos7, os RPs independentes de Zn2+ também foram descritos como versões alternativas (Alt) dos parálogos primários (Prim) de RP de ligação a Zn2+, uma vez que os AltRPs servem como RPs alternativos para a biogênese do ribossomo no Zn2+-condição limitada em algumas bactérias e é uma palavra-chave com melhor capacidade de pesquisa9,10,11.
Como a expressão de AltRP é rigidamente regulada por Zn2+, é lógico supor que a expressão de AltRP oferece redundância funcional para proteínas ribossômicas dependentes de Zn2+ em face da limitação de Zn2+. De fato, essa característica dos AltRPs foi demonstrada para a bactéria modelo do solo Bacillus subtilis, onde o crescimento é resgatado durante a limitação de Zn2+ pela liberação da superfície PrimRP L31 e substituição pelo AltRP L3112,13. No entanto, alguns AltRPs são parálogos aos PrimRPs principais, por exemplo, S14, o que significa que sua incorporação é necessária durante a biogênese do ribossomo12,13. Reconstruir o ribossomo com AltRPs é um programa comprometido e intensivo em energia. Embora esses AltRPs centrais possam servir para liberar Zn2+ do ribossomo, também é possível que alguns AltRPs tenham evoluído uma função adicional no ambiente limitado por Zn2+. Isso é apoiado pela observação de que os AltRPs são divergentes de seus PrimRPs parálogos; a homologia da sequência dos genes AltRP é frequentemente maior entre homólogos em diferentes espécies do que a sequência do gene PrimRP de ligação a Zn2+ dentro da mesma espécie7,10. Como os genes que codificam AltRPs altamente divergentes estão sob controle transcricional dependente de Zn2+, eles são removidos da pressão seletiva exercida sobre os superoperons ribossômicos fortemente regulados e altamente conservados14. A pressão seletiva dissociada sobre a informação genética que codifica a maquinaria ribossômica e os AltRPs expõe esses RPs a trajetórias evolutivas diferentes das PrimRPs homólogas e pode permitir a evolução específica da linhagem do mesmo AltRP em diferentes bactérias10,15. A existência generalizada de AltRPs em bactérias e a regulação genética dissociada desses RPs únicos levanta uma questão interessante sobre se a incorporação de AltRPs em ribossomos bacterianos confere uma propriedade especial aos ribossomos contendo AltRP (ribossomos Alt).
As micobactérias são um grupo ideal de bactérias para investigar as propriedades mecanicistas dos ribossomos Alt. Primeiro, as micobactérias possuem um operon altRP altamente conservado contendo quatro genes que codificam AltRPs: S14-2, S18-2, L28-2 e L33-28,9. Os AltRPs micobacterianos são significativamente diferentes de seus parálogos PrimRP; em todos os quatro pares PrimRP / AltRP, um determinado gene AltRP é mais semelhante em todas as espécies de micobactérias do que ao gene PrimRP na mesma espécie10. A evolução específica da linhagem de AltRPs também é aparente dentro de micobactérias, como evidenciado por AltRPs S18-2 e L28-2 em Mycobacterium tuberculosis e M. bovis, que contêm sequências únicas no terminal C que não estão presentes em outras micobactérias10. Em segundo lugar, este grupo de bactérias altamente relacionadas contém membros não patogênicos e patogênicos que residem em diversos ambientes, desde o solo (por exemplo, M. smegmatis) até uma miríade de hospedeiros: humanos (por exemplo, M. tuberculosis), bovinos (por exemplo, M. bovis), aquáticos (por exemplo, M. marinum) e aviários (por exemplo, M. avium), para citar alguns. A natureza altamente conservada do operon altRP em micobactérias, a evolução específica da linhagem de genes AltRP específicos e os ambientes muito diferentes nos quais os membros desse grupo existem fornecem uma oportunidade única para analisar a evolução conservada e específica da linhagem da função AltRP e propriedades mecanicistas dos ribossomos Alt. Apesar da abundância de AltRPs em genomas procarióticos, o papel de AltRPs e Alt-ribossomos foi investigado em apenas algumas bactérias9,10,11,12,13,16,17,18,19. O estabelecimento de um sistema padronizado com métricas específicas para validar as condições de crescimento limitantes de Zn2+ em micobactérias melhoraria os resultados experimentais e avançaria a compreensão dos ribossomos Alt no campo da pesquisa de ribossomos.
Zn2+ é um micronutriente; portanto, traços de contaminação do Zn2+ em produtos químicos e água contribuem para a biodisponibilidade do Zn2+, mesmo quando omitidos da preparação do meio. Os vestígios de Zn2+ presentes na água ou produtos químicos podem variar drasticamente entre os laboratórios, afetando assim o resultado do crescimento limitante do Zn2+. Quantificar empiricamente o [Zn2+] em cada preparação independente de meio é excessivamente oneroso para a maioria dos laboratórios que realizam ensaios de crescimento de rotina, mas um mecanismo para eliminar a possibilidade de contaminação por Zn2+ em meios de crescimento seria intrinsecamente valioso. Para este fim, é apresentado aqui um método detalhado para preparar um meio limitado por Zn2+ quimicamente definido (ZLM), vasos de crescimento e culturas de sementes para crescimento limitante de Zn2+ e produção de ribossomo Alt em M. smegmatis e M. tuberculosis. As principais características morfogênicas (densidade celular medida por OD600, comprimento celular e fluorescência da coenzima F420) após o crescimento em ZLM são usadas para verificar se a limitação de Zn2+ foi alcançada. A coenzima F420 é um cofator de deazaflavina que tem papéis importantes no catabolismo e na defesa contra o estresse oxidativo em metanógenos e micobactérias20,21. É importante ressaltar que as micobactérias são autofluorescentes quando excitadas a 420 nm devido à abundância desse cofator22. A ligação molecular entre a fluorescência [Zn2+] e F420 permanece sem solução, mas seguir a fluorescência F420 em culturas é um bioindicador tratável e confiável.
Em M. smegmatis, os fenótipos bioindicadores ocorrem nas bactérias do tipo selvagem, mas um mutante de deleção sem o operon altRP não passa pelo mesmo programa morfogênico e pode ser usado como um bioindicador diferencial10. Embora M. tuberculosis não siga o mesmo programa morfogênico que M. smegmatis durante a limitação de Zn2+, M. tuberculosis tem uma resposta robusta e global ao Zn2+ limitação e um fenótipo bioindicador chave seguindo este método23. Assim, o sistema definido aqui permite que os ribossomos Prim e Alt- sejam gerados sob as mesmas condições de crescimento (ou seja, limitação de Zn2+), facilitando a dissecação mecanicista da função do ribossomo Alt e seu papel na formação da fisiologia bacteriana. Este método de crescimento foi usado para resolver a estrutura dos ribossomos Alt ativos e demonstrar sua atividade translacional em M. smegmatis24. Além disso, apoiando que este método de crescimento e fenótipo bioindicador destaca a funcionalidade biológica dos AltRPs durante a limitação do Zn2+, a expressão de AltRP é necessária para a morfogênese dependente de Zn2+ e tem um efeito profundo no transcriptoma e proteoma de M. smegmatis10,25. O mesmo método, com pequenas modificações na quantidade de inóculo e no tempo de incubação, é usado para gerar culturas limitadas a Zn2+ de M. tuberculosis9,23. Aqui, são detalhados protocolos e fenótipos bioindicadores para alcançar o crescimento limitante de Zn2+ em M. smegmatis e M. tuberculosis, com foco em M. smegmatis, uma vez que essa bactéria é mais sensível à contaminação por Zn2+ no meio e é mais amplamente acessível do que o patógeno de crescimento lento.

<table><tbody><tr><td>Sistemas de filtração a vácuo de 1000 mL, linha padrão</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td></td></tr><tr><td>Frascos agitadores Erlenmeyer de 125 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>679501</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultura de 14 mL, plástico, com tampas de posição dupla</td><td>VWR</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>Frascos agitadores Erlenmeyer de 250 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>679502</td><td></td></tr><tr><td>40X-1000X Composto Biológico Binocular de Laboratório Microscópio</td><td>Omax</td><td>M82EZ</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Bio-Reação de 50 mL, Estéril</td><td>VWR</td><td>76211-286</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga de Alto Desempenho de 50 mL com Tampas de Bandeira</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Alcojet Detergente em Pó de Baixa Formação de Espuma</td><td>Alconox</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de Ferro Amônio (III), marrom</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAA1119930&nbsp;</td><td>MW: 265 g/mol, para solução 1M adicione 1,325 g a 5 mL de água ultrapura; armazene protegido da luz a 4 C</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Thermo Scientific</td><td>J10857-A1</td><td></td></tr><tr><td>D-pantotenato de cálcio</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC243300050</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1345-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico anidro, cristalino</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP339-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose anidra</td><td>Fisher Scientific</td><td>D14-500</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 Caldo</td><td>BD Diagnostics</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Dilufotômetro OD600 para a Determinação da Densidade Celular e Ensaios de Bradford</td><td>Implen</td><td>OD600-10</td><td></td></tr><tr><td>GENios FL Leitor de Microplacas</td><td>Tecan</td><td></td><td>Descontinuado</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200 PRO Leitor de Microplacas Multimodo</td><td>Tecan</td><td>LGE140213-20BL</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagine</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAB2147336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1231122</td><td></td></tr><tr><td>Macrofire SP CCD câmera</td><td>Optrônica</td><td></td><td>Para uso com microscópio Olympus</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de purificação de água Milli-Q Direct 8</td><td>Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Moticam X3</td><td>Motic</td><td></td><td>Descontinuado, substituído pelo Moticam X5 Plus; para uso com microscópio composto</td></tr><tr><td>Ácido oleico</td><td>Thermo Scientific</td><td>031997-14</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio vertical Olympus BX51</td><td>Olympus</td><td></td><td>Descontinuado, substituído por BX53M</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio, monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Semi-Micro Cubetas de plástico descartáveis de dois lados</td><td>VWR</td><td>97000-590</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio, cristal</td><td>VWR</td><td>VW1494-01</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>MP Biomedicals</td><td>103170</td><td></td></tr><tr><td>Sulfeto de zinco heptahidratado, cristalino/</td><td>ACS MP Biomedicals</td><td>219145290</td><td></td></tr></tbody></table>

usando mycobacterium smegmatis como um bioindicador para condições de crescimento limitado por zinco em micobactérias

Using Mycobacterium smegmatis as a Bioindicator for Zinc-Limited Growth Conditions in Mycobacteria

Muitas bactérias constroem ribossomos alternativos em condições de crescimento limitantes de Zn2+, substituindo proteínas ribossômicas de ligação a Zn2+ por parálogos independentes de Zn2+. A definição de um sistema para estudar esses ribossomos alternativos tem se mostrado difícil porque a contaminação por Zn2+ em laboratório é comum. Para resolver esse problema, agentes quelantes às vezes são adicionados aos meios de crescimento, mas essa abordagem complica a resposta biológica à limitação gradual do Zn2+ e está associada à hibernação do ribossomo. Aqui, instruções detalhadas são descritas para preparar meios e culturas de semeadura para crescimento limitado de Zn2+ sem adição de quelantes. Seguindo este método, a bactéria modelo, Mycobacterium smegmatis, sofre morfogênese, que depende de ribossomos alternativos. Como a morfogênese é tratável e ocorre apenas em condições limitantes de Zn2+, M. smegmatis pode ser usado como um bioindicador para verificar condições de crescimento biologicamente relevantes. Três fenótipos de bioindicadores (densidade celular, comprimento celular e fluorescência da coenzima F420) que indicam limitação de Zn2+ no tipo selvagem são descritos, e mudanças nesses bioindicadores para um mutante de deleção que não pode construir ribossomos alternativos são descritos. Como a contaminação por traços de Zn2+ é difícil de controlar para cada lote de meio, e a quantificação precisa de Zn2+ em cada preparação de meio é excessivamente onerosa, seguir esse fenótipo bioindicador é uma maneira acessível de validar a preparação de meios de crescimento limitados por Zn2+. Para ajudar a identificar as condições adequadas para o crescimento limitante do Zn2+ e a produção alternativa de ribossomos, as mudanças nos fenótipos dos bioindicadores também foram perfiladas para preparações contaminadas com Zn2+ ou severamente depletadas de Zn2+ de meios limitados por Zn2+. Mais detalhes para alcançar o crescimento limitante de Zn2+ e a produção alternativa de ribossomos em M. tuberculosis são apresentados, juntamente com o fenótipo bioindicador associado. No geral, as instruções detalhadas e os fenótipos de bioindicadores descritos aqui ajudarão a padronizar a produção de ribossomos alternativos translacionalmente ativos em micobactérias.

Fenótipos bioindicadores de M. smegmatis 
Tipo selvagem M. smegmatis culturas cultivadas em ZLM que atingem Zn2+-limitação de crescimento apresentam três fenótipos bioindicadores principais quando comparados a células cultivadas sob Zn2+-condições de repleção: [1] diminuição da DO600, [2] células alongadas e [3] diminuição da fluorescência máxima em 420 nm. O mutante que lack AltRPs (ΔaltRP) não possui o mesmo Zn2+dependente de morfogênese como o tipo selvagem10, e seu fenótipo único em Zn2+-mídia limitante pode ser usada como um bioindicador diferencial. Portanto, as três métricas de bioindicadores devem ser inicialmente avaliadas em selvagem cultivado em ZRM e ZLM. Se o Zn esperado2+-um fenótipo selvagem limitado é observado, o ΔaltRP a linhagem com deleção deve então ser avaliada. O crescimento em ZLM nem sempre alcança Zn2+-condições limitadas, que é exatamente a razão pela qual são necessários bioindicadores. Selvagem único e ΔaltRP fenótipos bioindicadores verificam que o Zn biologicamente relevante2+-condições limitantes foram alcançadas. Quando culturas cultivadas em ZLM não atingem Zn2+crescimento limitado devido ao Zn2+ contaminação no meio ou nos recipientes de cultura (ZLM-C), esses fenótipos bioindicadores serão menos acentuados, conforme mostrado em Figura 1 e Figura 2. Inversamente, se a concentração de Zn2+ em ZLM é muito baixo, o crescimento é prejudicado pelo Zn2+ esgotamento (ZLM-D), que é evidente pela baixa turbidez da cultura e fenótipos alterados dos bioindicadores, também detalhado em Figura 1 e Figura 2.
A densidade celular é uma métrica robusta de limitação por Zn2+. Culturas cultivadas em ZRM atingem consistentemente alta turbidez (acima de OD600 de 5) após 72 h, possivelmente agregando-se, e são visivelmente mais amarelas (dados não mostrados) do que culturas cultivadas em ZLM (Figura 1A). A limitação por Zn2+ restringe o crescimento (marcado pela diminuição da OD600) de todas as linhagens quando comparadas à condição com Zn2+ suficiente, e a linhagem ΔaltRP apresenta menor densidade celular do que a selvagem (Figura 1A). O crescimento limitado por Zn2+ em ZLM resulta consistentemente em uma OD600 acima de 3,5 e abaixo de 5 na linhagem selvagem e abaixo de 3 na linhagem ΔaltRP (Figura 1A). Culturas cultivadas em ZLM que apresentaram contaminação por Zn2+ (ZLM-C) atingem uma densidade celular semelhante (OD600 acima de 5) à das culturas com Zn2+ suficiente cultivadas em ZRM (Figura 1A). Se a [Zn2+] em ZLM for muito baixa, as culturas ficarão severamente deficientes em Zn2+ (ZLM-D), e o crescimento será prejudicado, como evidenciado pela redução da densidade celular em culturas selvagens (OD600 inferior a 3; Figura 1A). A densidade celular da linhagem selvagem (3,5 &lt; OD600 &lt; 5) deve ser o primeiro ponto de verificação fenotípico do bioindicador para confirmar condições limitantes de Zn2+. Apenas culturas selvagens que atingirem a densidade celular esperada devem ser consideradas, e a análise da linhagem ΔaltRP deve ser realizada somente após a verificação do fenótipo bioindicador limitado por Zn2+ na linhagem selvagem.
Culturas selvagens em fase estacionária cultivadas em ZLM limitado para Zn2+ são alongadas, com um comprimento celular médio de cerca de 9 µm, enquanto Zn2+-culturas completas cultivadas em ZRM são curtas, com um comprimento celular médio de cerca de 3 µm (Figura 1B). Culturas selvagens cultivadas em ZLM com Zn2+ contaminação (ZLM-C) não se alongam completamente, mas são ligeiramente mais longas que Zn2+-células repletas com um comprimento médio de célula de 5 µm. Bioindicação de Zn2+ contaminação em lotes inteiros de ZLM indica possível contaminação durante o preparo, enquanto em culturas individuais (ou seja, frascos) indica contaminação devido à lavagem inadequada dos frascos ou ao preparo da cultura. Culturas selvagens cultivadas em ZLM que estão severamente deficientes em Zn2+ (ZLM-D) apresentam alongamento menos acentuado, com um comprimento celular médio de cerca de 7 µm (Figura 1B). O fenótipo alongado do tipo selvagem não é observado no ΔaltRP estirpe, e ΔaltRP células limitadas em Zn2+ têm um comprimento celular médio de cerca de 5 µm (Figura 1B). Figura 2 mostra imagens representativas de células cultivadas em diferentes preparações de ZLM ou ZRM (após a etapa 2) e visualizadas com microscópio óptico composto. Após a etapa 4, células de diversos campos em imagens como as mostradas em Figura 2 são usados para calcular o comprimento médio das células das culturas mostradas em Figura 1B. O fenótipo alongado do tipo selvagem é específico para Zn2+-condições limitantes; a alongamento celular não é observado quando os cultivos são Zn2+-repleto ou gravemente com Zn2+-privado de (Figura 1B e Figura 2).
O fenótipo do bioindicador com fluorescência reduzida de F420 é melhor observado em varreduras de fluorescência (Figura 1C). A diminuição da fluorescência do cofator F420 é quantificada tomando-se a porcentagem da intensidade de fluorescência em 375 nm (fundamental) em relação a 420 nm (autofluorescência do cofator F420), conforme descrito na etapa 3.16.5, representada como F375/420. Para leitores de placas monocromáticos sem capacidade de varredura fluorescente, leituras pontuais em 375 nm e 420 nm (ambas com emissão em 475 nm) são adequadas para calcular F375/420. Culturas selvagens cultivadas em condições completas em Zn2+ (ou seja, em ZRM) apresentam F375/420 altamente reprodutível em torno de 17% (Figura 1D). A redução na fluorescência de F420 em culturas limitadas em Zn2+ cultivadas em ZLM é marcada por um aumento no F375/420 para cerca de 27% (Figura 1D). A fluorescência de F420 na cepa ΔaltRP limitada em Zn2+ é notavelmente menor do que a do tipo selvagem na mesma condição, e isso é visualmente evidente nas varreduras de fluorescência (Figura 1C). O valor de F375/420 é mais variável na cepa ΔaltRP limitada em Zn2+, com uma faixa de aproximadamente 50% a 80% (Figura 1D). Culturas cultivadas em ZLM, mas que apresentam bioindicação de contaminação por Zn2+ (ZLM-C), têm F375/420 reduzido para cerca de 21%, e culturas que estão esgotadas em Zn2+ (ZLM-D) apresentam F375/420 em torno de 35% (Figura 1D).
Em resumo, três fenótipos bioindicadores devem ser avaliados nas cepas selvagem e ΔaltRP para verificar o estado de limitação de Zn2+ em culturas cultivadas em ZLM. Os bioindicadores devem ser os seguintes para um crescimento biologicamente relevante limitado por Zn2+: [1] OD600 da cepa selvagem entre 3,5 e 5, e da cepa ΔaltRP inferior a 3, [2] as células selvagens com cerca de 10 µm de comprimento, e as células ΔaltRP com metade desse comprimento, e [3] a razão F375/420 da cepa ΔaltRP elevada, ou seja, acima de 50%.
Fenótipos bioindicadores de M. tuberculosis 
Zn2+-limitado M. tuberculosis não apresenta o mesmo programa morfogênico que M. smegmatis. Especificamente, não há diferença na DO600 entre Zn2+-repleto e Zn2+-culturas limitadas e Zn2+culturas limitadas não demonstram nenhum fenótipo morfológico evidente, ou seja, não se alongam23Da mesma forma, não há um Zn2+fenótipo bioindicador deficiente (ou seja, densidade celular reduzida) em M. tuberculosis como é observado em M. smegmatis. Zn2+- culturas limitadas apresentam aglomeração mais aparente em comparação com Zn2+- culturas completas, embora ambas as condições apresentem considerável agregação no dia 10 (observado tanto em Mtb-H37Rv quanto em Mtb-Aux). O fenótipo bioindicador chave para Zn2+ limitação em M. tuberculosis é o pico reduzido de F420 fluorescência, conforme relatado anteriormente23. Os resultados para culturas cultivadas por 8 dias são apresentados aqui em vez de 10 dias para minimizar a agregação. Diminuição de F420 a fluorescência é evidente em Zn2+- culturas limitadas com monocromáticas (Figura 3) e leitores de placas baseados em filtros. Para leitores de placas baseados em filtros, utilizando Mtb-H37Rv, Zn2+culturas limitadas (ou seja, cultivadas em ZLM) apresentam cerca de 50% dos valores brutos de fluorescência em comparação com Zn2+-culturas completas (ou seja, cultivadas em ZRM; dados não mostrados). Utilizando um leitor de placas monocromático, modo de leitura inferior e Mtb-Aux, Zn2+-culturas repletas têm F375/420 cerca de 75%, e Zn2+- culturas ZLM contaminadas apresentam valores semelhantes. Diminuição de F420 fluorescência em Zn2+-culturas limitadas cultivadas em ZLM são refletidas por F375/420 superior a 100%. O Zn2+-limitedo ΔaltRP a linhagem apresenta crescimento e F semelhantes420 fluorescência observada no Zn2+-selvagem limitado (Figura 3) e não é útil como bioindicador em M. tuberculosis como é em M. smegmatis (Figura 1). Portanto, é aconselhável testar os meios que serão utilizados para cultivar M. tuberculosis com o rápido crescimento M. smegmatis
<img alt="Curvas de crescimento, distribuição de comprimento e análise de fluorescência em estudo bacteriano; gráficos e diagramas de caixa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1: Fenótipos bioindicadores de M. smegmatis cultivados sob limitação de Zn2+ e o efeito da contaminação por Zn2+ e do esgotamento de Zn2+ sobre os fenótipos. Exemplos representativos dos fenótipos bioindicadores mostrados em cada painel são provenientes das mesmas culturas após 72 h. Exemplos de resultados de crescimento em condições de contaminação por Zn2+ (ZLM-C), limitação de Zn2+ (ZLM-L) e esgotamento de Zn2+ (ZLM-D) são provenientes de preparações independentes de meio, todas seguindo o mesmo método de preparação descrito aqui (passo 2). Os fenótipos representativos das cepas selvagem e ΔaltRP limitadas em Zn2+ são provenientes do mesmo lote de ZLM. Todas as cepas e condições possuem três réplicas biológicas (n=3). (A) Curvas de crescimento mostrando a densidade óptica detectada a 600 nm (OD600) e a diminuição da densidade celular com a limitação e o esgotamento de Zn2+. As barras de erro representam o desvio padrão entre as réplicas. (B) Comprimentos celulares das cepas selvagem e ΔaltRP, demonstrando o fenótipo alongado da cepa selvagem limitada em Zn2+. O diagrama de caixa e bigodes mostra a distância interquartil, os comprimentos celulares mínimo, máximo e mediano em µm. (C) Escaneamentos representativos de fluorescência de culturas mostrando pico de fluorescência F420 reduzido com a limitação de Zn2+ e fluorescência F420 diminuída na cepa ΔaltRP limitada em Zn2+. Apenas uma cultura representativa das triplicatas biológicas de cada preparação de meio diferente é mostrada. Os escaneamentos de fluorescência utilizam uma faixa de comprimento de onda de excitação de 230 nm a 440 nm com incrementos de 5 nm e um comprimento de onda de emissão de 475 nm. O painel inserido no canto superior esquerdo é um zoom das cepas selvagem e ΔaltRP limitadas em Zn2+, destacando o pico de fluorescência reduzido em 420 nm na cepa ΔaltRP limitada em Zn2+. As unidades dos eixos são as mesmas do gráfico principal. Todas as legendas são iguais às de (A). (D) Quantificação da fluorescência reduzida do cofator F420, calculada a partir da porcentagem de F375/420. As porcentagens são calculadas a partir dos valores obtidos nos escaneamentos de fluorescência em (C). O diagrama de caixa e bigodes mostra a distância interquartil, os valores mínimo, máximo e mediano das porcentagens. As abreviações que representam o estado relativo ao Zn2+ do meio, fornecidas entre parênteses após o tipo de meio, são: R = repleto de Zn2+, C = contaminado com Zn2+, L = limitado em Zn2+, D = esgotado de Zn2+; e outras abreviações são: WT = cepa selvagem, a.u. = unidades arbitrárias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Resultados da eletroforese de status de Zn²⁺, WT vs ΔaltRP, análise de separação proteica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Imagens representativas de microscopia de M. smegmatis após 72 h. As imagens são provenientes dos cultivos mostrados na Figura 1. As células foram visualizadas usando um microscópio óptico composto com aumento total de 1000x, utilizando uma objetiva de imersão em óleo de 100x. As barras de escala correspondem a 10 µm. As abreviações que indicam o status relativo ao Zn2+ do meio, fornecidas entre parênteses após o tipo de meio, são: R = repleto de Zn2+, C = contaminado com Zn2+, L = limitado em Zn2+, D = esgotado de Zn2+; outras abreviações são: WT = linhagem selvagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráfico do espectro de excitação de fluorescência; comprimento de onda versus fluorescência; análise de estudo proteico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 3"> 
Figura 3: Perda do fenótipo do bioindicador F420 em M. tuberculosis limitado por Zn2+, demonstrada por varreduras de fluorescência representativas de Mtb auxotrófico mc26206 (Mtb-Aux). Exemplos de resultados de crescimento contaminado por Zn2+ e limitado por Zn2+ são provenientes de preparações independentes de meio. As cepas selvagem limitada por Zn2+ e ΔaltRP são provenientes do mesmo lote de ZLM. Todas as cepas e condições possuem três réplicas biológicas (n=3). Apenas uma cultura representativa das réplicas biológicas em cada uma das diferentes preparações de meio e cepas é mostrada no gráfico. As varreduras de fluorescência foram realizadas no modo de leitura inferior após 8 dias de crescimento, utilizando uma faixa de comprimento de onda de excitação de 230 nm a 440 nm com incrementos de 5 nm e um comprimento de onda de emissão de 475 nm. As abreviações que representam o status relativo ao Zn2+ do meio, fornecidas entre parênteses após o tipo de meio, são: R = repleto de Zn2+, C = contaminado por Zn2+, L = limitado por Zn2+, D = esgotado de Zn2+; e outras abreviações são: WT = cepa selvagem, a.u. = unidades arbitrárias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo detalha a preparação de meios limitados por Zn2+, vasos de crescimento e culturas de sementes para produzir ribossomos limitados por Zn2+ em micobactérias. Traços de Zn2+ levam ao crescimento limitante de Zn2+ e descrevemos características morfogênicas usadas como bioindicadores para verificar a limitação de Zn2+ in vitro na bactéria modelo, Mycobacterium smegmatis, e no patógeno humano M. tuberculosis.

Usando Mycobacterium smegmatis como um bioindicador para condições de crescimento limitado por zinco em micobactérias

Many bacteria build alternative ribosomes in Zn2+-limiting growth conditions by replacing Zn2+-binding ribosomal proteins with Zn2+-independent paralogs. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mycobacterium tuberculosis forma biofilmes de drogas tolerantes quando cultivadas em certas condições. Aqui descrevemos métodos para cultura de M. biofilmes de tuberculose e que determinam a freqüência de persistentes drogas tolerantes. Estes protocolos serão úteis para estudos posteriores sobre os mecanismos de tolerância à droga em M. tuberculose.

Crescimento de Mycobacterium tuberculosis Biofilmes

Testes de susceptibilidade antimicrobiana Atualmente, o diagnóstico baseia-se no crescimento planctônico dos isolados em ricas em nutrientes, condições aeróbicas. Aqui, nós utilizamos um meio de escarro alternativa artificial para estudar susceptibilidade antimicrobiana de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa em ambas as condições de aerobiose e microaerofilia mais representativas do pulmão da fibrose cística.

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

Fonte: Gupta, S., et al. Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas ao ferro. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o procedimento de cultivo de Mycobacterium tuberculosis sob condições limitadas de ferro para induzir estresse de ferro e promover a secreção de sideróforos que suportam a sobrevivência bacteriana.

Cultivo de Mycobacterium tuberculosis em condições limitadas por ferro

Aqui, descrevemos um ensaio fenotípico aplicável às telas de alto rendimento/alto conteúdo de pequenas interfissões de RNA sintético (siRNA), composto químico e bibliotecas mutantes mycobacterium tuberculosis. Este método baseia-se na detecção de Mycobacterium tuberculosis rotulado fluorescentemente dentro de célula hospedeira fluorescente rotulada usando microscopia confocal automatizada.

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

O charcoal agar resazurin assay (CARA) é um método semiquantitativo de médio rendimento para avaliar a atividade de agentes de teste contra micobactérias que são replicantes, não replicantes ou ambas.  O CARA permite uma avaliação rápida da atividade dependente do tempo e da concentração e identifica os parâmetros a serem seguidos pelos ensaios de unidade formadora de colônias (UFC).

Visualização do carvão Agar resazurina Ensaio para a semi-quantitativa, médio rendimento enumeração de micobactérias

Mycobacterium tuberculosis mostra aumento da produção e liberação de vesículas extracelulares em resposta às condições de baixo ferro. Este trabalho detalha um protocolo para gerar condições e métodos baixos de ferro para a purificação e caracterização de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas em resposta à deficiência de ferro.

Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas por ferro

Este protocolo descreve um método robusto para o desenvolvimento de biofilme de película. O método é escalável para diferentes volumes de cultura, permitindo fácil adoção para vários objetivos experimentais. O desenho do método permite a avaliação qualitativa ou quantitativa do potencial de formação de biofilme de várias espécies de micobactérias.

Crescimento de biofilme micobacteriano como modelo para estudar a resistência antimicrobiana

Este estudo desenvolveu um ensaio para triagem de alto rendimento contra Mycobacterium abscessus com uma cepa repórter dupla recém-criada, usando fluorescência e luminescência para avaliar a viabilidade bacteriana rapidamente. Este protocolo será relevante para pesquisadores que pretendem rastrear novos medicamentos contra essa bactéria resistente a medicamentos.

Desenvolvimento de ensaio para triagem de medicamentos de alto rendimento contra micobactérias

CD4 + T-linfócitos Captura Usando um chip descartável microfluídicos para HIV

Estratégias de micobactérias patogênicas continuam a ser mal compreendido. A taxa de crescimento lento da maioria das espécies, a natureza impenetrável do da parede celular, e os perigos de trabalhar com agentes patogénicos fazer micobactérias difíceis de estudar e são em grande parte responsáveis ​​por nossa má compreensão destes organismos. Neste vídeo iremos demonstrar a técnica da eletroporação, que envolve as células sujeitando a um impulso de alta breve elétrico para permitir a entrada de...

Eletroporação de Micobactérias

Aprenda a usar Mycobacterium smegmatis como bioindicador para condições de crescimento limitado por zinco em micobactérias. Este método padronizado permite estudar adaptações bacterianas e proteínas ribossômicas alternativas.

Usando Mycobacterium smegmatis como um bioindicador para condições de crescimento limitado por zinco em micobactérias

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