Name: Um ensaio toxicológico e ecotoxicológico baseado na motilidade dos hemócitos do mexilhão (Mytilus galloprovincialis) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprenda um ensaio inovador de toxicidade baseado na motilidade dos hemócitos de Mytilus galloprovincialis. Este método oferece uma alternativa ética aos testes em vertebrados para biomonitoramento ambiental e avaliação de riscos ecológicos.

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<ol><li>Di Paolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioassay+battery+interlaboratory+investigation+of+emerging+contaminants+in+spiked+water+extracts+-+Towards+the+implementation+of+bioanalytical+monitoring+tools+in+water+quality+assessment+and+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Bioassay battery interlaboratory investigation of emerging contaminants in spiked water extracts - Towards the implementation of bioanalytical monitoring tools in water quality assessment and monitoring.</a> Water Res. 104, 473-484 (2016).</li>
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<li>Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect-based+tools+for+monitoring+and+predicting+the+ecotoxicological+effects+of+chemicals+in+the+aquatic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment.</a> Sensors. 12 (9), 12741-12771 (2012).</li>
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<li>Pruzzo, C., Gallo, G., Canesi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+vibrios+in+marine+bivalves%3A+The+role+of+interactions+with+hemolymph+components%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persistence of vibrios in marine bivalves: The role of interactions with hemolymph components.</a> Environ Microbiol. 7 (5), 761-772 (2005).</li>
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<li>Furukawa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemocyte+migration+and+expression+of+four+Sox+genes+during+wound+healing+in+Pacific+abalone%2C+Haliotis+discus+hannai%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hemocyte migration and expression of four Sox genes during wound healing in Pacific abalone, Haliotis discus hannai.</a> Fish Shellfish Immunol. 117, 24-35 (2021).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,2 &micro; m (diâmetro 25 mm)</td><td>ABLUO&nbsp;</td><td></td><td>agulha</td></tr> de <tr><td>seringa hipodérmica de 2,5 ml 22G</td><td>Rays</td><td>2522CM32</td><td></td></tr> material <tr><td>de laboratório de 96 poços de poliestireno de fundo plano tratado com TC microplaca</td><td>Corning</td><td>3916</td><td>de laboratório</td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>C3881-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Química Quimiotaxia e Ferramenta de Migração software&nbsp;</td><td>(Ibidi GmbH)</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>Cytation 5&nbsp;</td><td>Equipamento Agilent BioTeck</td><td>Cytation 5</td><td>: Leitor multimodo de imagem celular</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)&nbsp;</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>472301</td><td>Solvente</td></tr><tr><td>Falcon Tubo de 15 mL Fundo Cônico</td><td>Corning</td><td>352196</td><td>Labware</td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>B0394</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro Químico de leitura rápida 102</td><td>Biosigma</td><td>BVS100</td><td>labware</td></tr><tr><td>HEPES (4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-ácido etanossulfônico)</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Software Chemical ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>KBr</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>P9881</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merk&nbsp;</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>química Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>G7513</td><td>Aminoácido essencial para o meio de cultura celular</td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td>Microscópio <td>Químico</td> <td>M7506</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E600</td><td>Equipamento Nikon</td><td></td><td>: Imagem celular&nbsp;</td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Riedel-de Haen</td><td>31481</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>31434-1KG-R</td><td>Químico</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fluka</td><td>71519 500g</td><td>Químico</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Químico Neutro Vermelho</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>N4638-1G</td><td>Corante celular vital</td></tr><tr><td>Penicilina/Streptomycin</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>P0781-100ML</td><td>Antibióticos para cultura celular</td></tr><tr><td>SrCl2&middot; 6H2O</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>255521</td><td>Trypan</td></tr><tr><td>Químico azul&nbsp;</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>T8154</td><td>Corante celular</td></tr></tbody></table>

um ensaio toxicológico e ecotoxicológico baseado na motilidade dos hemócitos do mexilhão (mytilus galloprovincialis)

A Toxicological and Ecotoxicological Assay Based on Mussel (Mytilus galloprovincialis) Hemocytes Motility

O estudo apresenta um novo método in vitro para avaliar de forma rápida e sensível a toxicidade e ecotoxicidade de poluentes, utilizando a motilidade dos hemócitos de Mytilus galloprovincialis. A Figura 1A-C mostra imagens representativas de lapso de tempo de hemócitos após 30 min de fixação ao fundo do poço. As células da figura foram coradas com Vermelho Neutro pouco antes da avaliação da motilidade. Os movimentos celulares foram monitorados por microscopia óptica a uma taxa de uma imagem a cada minuto por 10 min, sob aumento de 20x, com um leitor multimodo. A Figura 1A-C exibe três dos 11 quadros capturados da mesma região de interesse (ROI) em 0 min, 5 min e 10 min. As mesmas células são numeradas em todas as três figuras para destacar seu movimento, e a numeração permanece consistente em todas as figuras para ilustrar claramente suas trajetórias.
As células mostram movimentos unicelulares com base na atividade dos lamelipódios e mudanças rápidas de forma. As células foram marcadas com o corante vital vermelho neutro para melhorar sua visualização durante o rastreamento. O vermelho neutro é um corante catiônico anfifílico e fraco que pode permear facilmente a membrana celular. Uma vez dentro das células, o corante fica preso nos lisossomos devido à protonação. Os hemócitos de mexilhão, particularmente os granulócitos, apresentam um sistema lisossômico bem desenvolvido; portanto, eles são bem visualizados pela coloração Vermelho Neutro, com o citoplasma rico em vários lisossomos marcados com vermelho e o núcleo (não marcado pelo corante) aparecendo como um buraco translúcido.
Por meio da aplicação do protocolo, dois morfotipos principais de hemócitos podem ser observados de acordo com Udayan et al.23: (1) células disseminadas com formato de feijão bipolar e, às vezes, contorno amebóide, e células menores em forma de estrela redonda (células n = 3 e 10). Em ambos os tipos de células, o movimento foi caracterizado por mudanças contínuas de forma, com extensão e retração contínuas de pseudópodes e filopódios.
A aplicação do protocolo permite a avaliação bem-sucedida da motilidade dos hemócitos por meio da construção de gráficos de trajetória, conforme relatado na Figura 2, e do cálculo dos principais parâmetros velocimétricos, como velocidade média e franqueza. Estes corresponderam respectivamente a 6,46 ± 0,2 μm/min e 0,56 ± 0,02 (média ± MEV) para células espalhadas e 5,18 ± 0,34 μm/min e 0,37 ± 0,03 para células pequenas, respectivamente em condições fisiológicas basais após 30 min de fixação ao fundo do poço. Portanto, o protocolo permite a classificação de diferentes populações de hemócitos com base em parâmetros velocimétricos.
Através da aplicação do protocolo, alterações no parâmetro velocimétrico da motilidade dos hemócitos podem ser detectadas após a exposição a drogas ou poluentes. A Figura 3A-D mostra resultados representativos da exposição in vitro de hemócitos de mexilhão ao paracetamol, que é um dos fármacos liberados no ambiente (PiE) com maior concentração e maiores frequências de detecção em rios de todo o mundo31.
De acordo com Udayan et al.23, em células controle, foi observado um aumento significativo na velocidade com o tempo em ambos os morfotipos celulares, sugerindo ativação de hemócitos durante a cultura de 24 horas, presumivelmente evocativa da resposta inflamatória induzida experimentalmente por retirada e plaqueamento no ambiente de cultura. Quando as células foram expostas à droga, a ativação da motilidade dos hemócitos foi significativamente reduzida nas células espalhadas (Figura 3A) após 24 h, mas não nas pequenas células redondas (Figura 3C), caracterizada por uma velocidade basal média mais baixa (avaliada no tempo 0). Além disso, o protocolo permitiu a detecção de alterações na trajetória celular após a exposição ao fármaco, conforme indicado pelo aumento significativo da franqueza de pequenas células após 24 h e pela diminuição da franqueza após 1 h de exposição em células espalhadas (Figura 3C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig01.jpg"> 
Figura 1: Imagem representativa de lapso de tempo de hemócitos neutros corados de vermelho após 30 min de fixação ao fundo do poço. As células foram coradas com o corante vital Vermelho Neutro pouco antes da avaliação da motilidade. Os movimentos celulares foram monitorados por microscopia óptica a uma taxa de uma imagem a cada minuto por 10 min sob aumento de 20x. Para resumir, os painéis A, B e C exibem três dos 11 quadros capturados da mesma região de interesse (ROI) em 0 min, 5 min e 10 min. As mesmas células são numeradas em todas as três figuras para ilustrar seu movimento, e as setas indicam os intervalos de tempo. As barras de escala representam 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig02.jpg"> 
Figura 2: Gráfico de trajetória representativa de hemócitos de M. galloprovincialis . As trajetórias mostradas vêm de um único poço. As trajetórias de 25 células são mostradas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig03v2.jpg"> 
Figura 3: Efeito da exposição ao paracetamol (24 h) na velocidade e franqueza das células espalhadas (A, B) e pequenas células redondas em forma de estrela (C, D). Os dados são expressos como média ± EPM. A significância estatística dos dados foi avaliada por ANOVA one-way e pós-teste de Tukey. *p &lt; 0,05 vs. controle (p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig03largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Um ensaio toxicológico e ecotoxicológico baseado na motilidade dos hemócitos do mexilhão (Mytilus galloprovincialis)

Hemocytes are the circulating immune-competent cells in bivalve mollusks and play a key role in several important functions of cell-mediated innate ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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