Name: Extração em uma etapa e análise zimográfica de gelatinases bacterianas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Aprenda a extrair e caracterizar gelatinases ativas de Leptospira usando zimografia e LC-MS/MS. Este protocolo simplificado facilita a identificação de biomarcadores para leptospirose e candidatos a vacinas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Yue, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">Biology of the extracellular matrix.</a> J Glaucoma. 23 (8 Suppl 1), S20-S23 (2014).</li>
<li>Cabral-Pacheco, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The roles of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human diseases.</a> Int J Mol Sci. 21 (24), 1-53 (2020).</li>
<li>Ambili, M., Jayasree, K., Sudhakaran, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((60K+gelatinase+involved+in+mammary+gland+involution+is+regulated+by+%CE%B2-oestradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">60K gelatinase involved in mammary gland involution is regulated by β-oestradiol.</a> Biochim Biophys Acta. 1403 (3), 219-231 (1998).</li>
<li>Zhang, Y. -Z., Ran, L. -Y., Li, C. -Y., Chen, X. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+structures%2C+and+collagen-degrading+mechanisms+of+bacterial+collagenolytic+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diversity, structures, and collagen-degrading mechanisms of bacterial collagenolytic proteases.</a> Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li>
<li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+collagenases+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial collagenases - A review.</a> Crit Rev Microbiol. 42 (1), 106-126 (2016).</li>
<li>Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+46+kDa+gelatinase+on+the+outer+membrane+of+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira.</a> Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).</li>
<li>Kramer, R. A., Zandwijken, D., Egmond, M. R., Dekker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+folding%2C+purification+and+characterization+of+Escherichia+coli+outer+membrane+protease+OmpT%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">In vitro folding, purification and characterization of Escherichia coli outer membrane protease OmpT.</a> Eur J Biochem. 267 (3), 885-893 (2000).</li>
<li>Kum, S. L., Ho, J. C. S., Parikh, A. N., Liedberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+membrane+environments+regulate+enzymatic+behaviors+of+Salmonella+outer+membrane+protease%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Bio+Med+Chem+Au%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic membrane environments regulate enzymatic behaviors of Salmonella outer membrane protease.</a> ACS Bio Med Chem Au. 2 (1), 73-83 (2022).</li>
<li>Sarma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+proteome+analysis+shows+the+abundance+of+histidine+kinase+sensor+protein%2C+DNA+helicase%2C+putative+lipoprotein+containing+peptidase+M75+domain+and+peptidase+C39+domain+protein+in+Leptospira+interrogans+grown+in+EMJH+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Extracellular proteome analysis shows the abundance of histidine kinase sensor protein, DNA helicase, putative lipoprotein containing peptidase M75 domain and peptidase C39 domain protein in Leptospira interrogans grown in EMJH medium.</a> Pathogens. 10 (7), 852(2021).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Levy, D., Gulik, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+vesicle+solubilization+and+reconstitution+by+detergents.+Symmetrical+analysis+of+the+two+processes+using+octaethylene+glycol+mono-n-dodecyl+ether%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid vesicle solubilization and reconstitution by detergents. Symmetrical analysis of the two processes using octaethylene glycol mono-n-dodecyl ether.</a> Biochemistry. 29 (40), 9480-9488 (1990).</li>
<li>Lichtenberg, D., Ahyayauch, H., Alonso, A., Goñi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+solubilization+of+lipid+bilayers%3A+a+balance+of+driving+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Detergent solubilization of lipid bilayers: a balance of driving forces.</a> Trends Biochem Sci. 38 (2), 85-93 (2013).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Zeug, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+microscopic+methods+for+the+neural+ECM+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Current microscopic methods for the neural ECM analysis.</a> Prog Brain Res. 214, 287-312 (2014).</li>
<li>Madathiparambil, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zymography+analysis+of+proteinase+activity+present+in+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A zymography analysis of proteinase activity present in Leptospira.</a> Curr Microbiol. 62 (3), 917-922 (2011).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ácido 6-aminocapróico</td><td>Merck</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; 695092</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; 32201</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; A-3553</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; A-3678</td><td></td></tr><tr><td>Bis Acrilamida</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; M7279</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino albumina fração V (BSA)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; A-8022</td><td></td></tr><tr><td>Azul de Bromofenol</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; B-8026</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie azul brilhante</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>1.12553</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Ellinghausen&ndash; McCullough&ndash; Johnson&ndash; Harris (EMJH) médio, Difco</td><td>&nbsp; Difco</td><td>&nbsp; 279410</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Merck</td><td>G9382</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glicina G8790</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; G-8898</td><td></td></tr><tr><td>Leptospira interrogans sorovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198)&nbsp;, mantida no biorrepositório do ICMR-RMRC Portblair</td><td>Mantido no biorrepositório do ICMR-RMRC Port Blair</td><td></td><td>Temperatura ideal de crescimento 30 > C</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio M8266</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; M8266</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; 17995-7</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>Pág. 4417&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta de separação de placas</td><td>Maravilha Wedgle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Termocientífico</td><td>FIBERLite F15 8x50 cy</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; L-4396</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; T-9281</td><td></td></tr><tr><td>Tritão X-100</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma (TRIS)&nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; T6066</td><td></td></tr></tbody></table>

extração em uma etapa e análise zimográfica de gelatinases bacterianas

One-step Extraction and Zymographic Analysis of Bacterial Gelatinases

O resultado mostra o zimograma da proteína leptospira e gelatinases do soro humano. Os resultados, mostrados na Figura 1, representam proteases como faixas brancas claras contra um fundo azul. As bandas representam áreas onde a gelatina copolimerizada é degradada e, portanto, não corada, enquanto outras áreas de todo o gel são coradas de azul devido à presença de gelatina. Além disso, mostra que, embora a gelatina também seja uma proteína, ela não é eluída na eletroforese devido à copolimeri...

Extração em uma etapa e análise zimográfica de gelatinases bacterianas

Proteinases of pathogenic bacteria contribute to invasion and pathogenesis by actively degrading the host's extracellular matrix (ECM) components and ...

one-step-extraction-and-zymographic-analysis-of-bacterial-gelatinases

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Nós apresentamos um procedimento pelo qual duas dimensões de análise agarose-gel pode ser usado para identificar a estrutura de intermediários de replicação que ocorrer após a irradiação UV.

Visualização dos Intermediários UV-induzida replicação em E. coli Usando bidimensional Análise Agarose-gel

Este protocolo descreve um ensaio baseado em atividades para a detecção de metaloproteinases de matriz em sobrenadante de cultura ou fluidos corporais.

Detecção de Metaloproteinases da Matriz Funcional por zimografia

Um conjunto simples e direta de métodos para isolar e determinar a identidade das proteínas mais abundantes expressa no músculo esquelético. Cerca de 800 spots são discernidos em um gel de duas dimensões de 10 mg do músculo, o que permite a determinação de gênero específico expressão da proteína. Esses métodos produzem resultados equivalentes na maioria dos tecidos.

Dimorfismo Sexo músculo esquelético de Proteomics

Recentemente, relatou uma nova abordagem para a geração de sondas DNAzyme fluorogênicos que podem ser aplicadas para criar um simples, "mistura-e-ler" teste de fluorescência para a detecção bacteriana. Estas sondas de DNA especiais catalisar a clivagem de um cromóforo-modificado substrato DNA-RNA quimérico, na presença de mistura extracelular em bruto (CEM) produzida por uma bactéria específica, assim, traduzindo a detecção de bactérias em geração do sinal de fluorescência. Neste relatório, irá...

Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

Descreve-se o método para a produção de prototípico lamelas de microscópio revestidas com gelatina de fluorescência para visualização invadopodia mediada por degradação da matriz. Técnicas computacionais utilizando software disponível são apresentados para quantificar os níveis resultantes de proteólise da matriz por células individuais dentro de uma população mista e para os grupos que abrangem todo multicelulares campos microscópicos.

Medição quantitativa de invadopodia mediada proteólise da matriz extracelular em Contextos individuais e multicelulares

Neste vídeo, realizamos zimografia, uma técnica eletroforética, para analisar a atividade proteolítica em amostras biológicas.

Zimografia de peptídeos fluorescentes: uma técnica modificada para detectar a atividade da protease usando substratos fluorogênicos em géis de zimograma

Este vídeo demonstra a técnica de eletroforese em gel de zimografia para avaliar a atividade das metaloproteinases da matriz (MMPs) presentes no sobrenadante da cultura de células. As MMPs ativas degradam o substrato específico da MMP incorporado em um gel de poliacrilamida, que aparece como faixas transparentes contra um fundo manchado escuro após a coloração.

Eletroforese em gel com zimografia: uma técnica eletroforética para detectar metaloproteinases da matriz avaliando a atividade enzimática

Membros do género Burkholderia são patógenos de importância clínica. Nós descrevemos um método para extração de proteínas bacterianas, usando ruptura mecânica, e eletroforese em gel 2-D para a análise proteômica subseqüente.

Extração de proteínas e 2-D métodos Eletroforese em Gel de<em&gt; Burkholderia</em&gt; Espécies

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para uma técnica modificada de zymographic na qual fluorescentes peptídeos são usados como substrato degradável no lugar de proteínas nativas. Eletroforese de amostras biológicas em Zimogramas peptídeo fluorescente permite a detecção de uma gama maior de proteases que as técnicas de zymographic anterior.

Deteção da atividade de Protease por zimografia peptídeo fluorescente

Os análogos da trealose estão emergindo como moléculas importantes para aplicações bio(tecnológicas)lógicas e biomédicas. Descrevemos um protocolo otimizado para sintetizar e purificar enzimaticamente análogos da trealose que é simples, eficiente, rápido e ecologicamente correto. Sua aplicação à rápida produção e administração de uma sonda para a detecção de micobactérias é demonstrada.

Rápida em uma etapa enzimática Síntese e All-aquosa Purificação da trealose Análogos

Aprenda a extrair e caracterizar gelatinases ativas de Leptospira usando zimografia e LC-MS/MS. Este protocolo simplificado facilita a identificação de biomarcadores para leptospirose e candidatos a vacinas.

Extração em uma etapa e análise zimográfica de gelatinases bacterianas

Explorar mais vídeos