Name: Deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em condições livres de alimentador (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: Aprenda a realizar deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas H9 usando sistema lentiviral. Este método mantém a pluripotência e capacidade de diferenciação em três camadas germinativas.

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<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>2-MERCAPTOETANOL&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>38,5 mL, Estéril + Livre Certificado Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14292</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Tecnologias de células-tronco</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>bFGF Invitrogen humano recombinante</td><td></td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury Rabbit mAb</td><td>Abclonal</td><td>A5078</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI-v2</td><td>NEB</td><td>R0739S</td><td></td></tr><tr><td>chir99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, tecnologias de</td> células-tronco <td>de ciclopamina 354234</td><td></td><td></td>Corning livre de LDEV</tr><tr><td></td><td></td><td>72074</td><td></td></tr><tr><td>Mídia DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM NUTRIENT MIX F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sem O: Ca e Mg</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FoxA2/HNF3&beta; &nbsp;</td><td>CST</td><td>8186</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Anticorpo mAb de coelho</td><td>CST</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de dissociação celular suave</td><td>Tecnologias de células-tronco</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>Solução de aminoácidos não essenciais (NEAA) 100x</td><td>Solução GE healthcare</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 (D3B5) Substituição</td> de soro <td></td><td></td> de nocaute de coelho mAb CST 9129 <td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L GLUTAMINE, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>2924190090</td><td></td></tr><tr><td>L2H-BMSBSP-F1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH Anticorpo policlonal</td><td>Proteintech</td><td>15707-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-R</td><td>Macrogen</td><td></td><td>AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-R</td><td>Macrogen</td><td></td><td>AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC</td></tr><tr><td>L2H-SeqF1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG</td></tr><tr><td>L2H-SeqR1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>L2H-UMSBSP-R1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>LentiCRISPRv2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1 meio completo</td><td>Tecnologias de células-tronco</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nanog Anticorpo</td><td>CST</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>MEIO NEUROBASAL 1x CTS</td><td>Invitrogen</td><td>A1371201</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 2 Suplemento 100x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-11050</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 27 Suplemento 50x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-07200</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 Anticorpo</td><td>CST</td><td>2750</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb</td><td>CST</td><td>60433</td><td></td></tr><tr><td>PENICILINA ESTREPTOMICINA SOL</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de infecção por polibreno</td><td>Sigma</td><td>TR1003- G</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina, ramificado</td><td>Sigma</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2.0</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Kit de título de lentivírus</td><td>Abm</td><td>LV900</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de rocha Y-27632 dicloridrato&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614/10</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 Anticorpo</td><td>CST</td><td>2748</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>TRYPSIN .05% EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>U6-459F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GAGGGCCTATT TCCCATGATTC</td></tr><tr><td>Kit de Purificação de DNA Genômico Wizard&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>Tocris</td><td>3748/10</td><td></td></tr></tbody></table>

deleção gênica mediada por crispr-cas9 em células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em condições livres de alimentador

CRISPR-Cas9 Mediated Gene Deletion in Human Pluripotent Stem Cells Cultured Under Feeder-Free Conditions

Clonagem de sgRNAs de L2HGDH em lentiCRISPRv2 puro O vetor puro lentiCRISPRv2 foi obtido comercialmente (ver Tabela de Materiais) e digerido com BsmB1, o que resultou na liberação de um fragmento de enchimento de 1,8 Kb. Conforme mostrado na Figura 2A, foi observada uma digestão completa do vetor. Para cada construção, seis clones foram selecionados quanto à presença ou ausência de inserção usando a sequência de sgRNA reversa como primer e um primer direto (U6-459F) de dentro da sequência vetorial. Usando essa abordagem, apenas os clones com a inserção produziram um produto de PCR de 288 pb, e os clones negativos que não continham a sequência reversa de sgRNA resultaram em nenhum produto de PCR, conforme mostrado na Figura 2B.
Infecções por H9, seleções estáveis e Western blot As hESCs foram infectadas com partículas lentivirais expressando dois sgRNAs diferentes direcionados ao éxon 1 do gene L2HGDH e selecionadas com puromicina. A análise de Western blot foi realizada a partir de populações heterogêneas de células sgRNA e Cas9 co-expressando de forma estável para estabelecer qual dos dois sgRNAs usados foi mais eficiente na indução da deleção do gene. Conforme mostrado na Figura 3A, L2HGDH-sgRNA-1 foi mais eficiente do que a outra sequência na redução da expressão de L2HGDH em populações celulares heterogêneas.
Seleção clonal, expansão e análise de proteínas A seleção de células únicas e a expansão clonal foram feitas para células que expressam L2HGDH-sgRNA-1. Os poços que produziram clones únicos foram marcados e cultivados até que um tamanho suficiente fosse alcançado para que as colônias (geralmente 2 semanas) se expandissem ainda mais, criopreservassem e analisassem (Figura 3B). Um total de 22 clones foram analisados usando a análise de Western blot, que resultou em cinco nocautes homozigotos (23%) para L2HGDH. Este resultado mostra uma alta eficiência de nocaute gênico usando entrega de genes mediada por lentivírus para co-expressão estável de sgRNA e Cas9 a partir de um único. A Figura 4 mostra uma análise de Western blot dos cinco clones knockout homozigotos juntamente com as células controle, mostrando uma redução de 100% na expressão em comparação com o controle nos clones selecionados.
Análise no nível do DNA A fim de mapear o local de mutação CRISPR a montante da sequência de reconhecimento PAM de Cas9, a Reação em Cadeia da Polimerase de Primers Específicos Baseados em Locais de Mutação (MS-BSP PCR) foi realizada usando DNA genômico de células de controle e de cinco clones diferentes. Conforme mostrado na Figura 5, dois clones (A5 e B4) têm mutações imediatamente próximas à sequência de reconhecimento do PAM, enquanto os outros três clones (A1, A9 e B12) mostraram que a mutação pode não estar muito próxima do local do PAM e está mais a montante da sequência de sgRNA de 20bp dentro do éxon 1 do gene L2HGDH .
Para encontrar as mutações exatas no DNA, produtos de PCR purificados de células de controle (H9 infectado apenas por vetor), bem como três clones CRISPR diferentes, A5, A1 e B4, foram submetidos ao sequenciamento de Sanger, e os locais de mutação foram mapeados usando a ferramenta de alinhamentos múltiplos clustalw a montante do local PAM8. Os resultados revelaram mutação de deleção no clone A5 a montante do sítio PAM. Os outros dois clones, A1 e B4, apresentaram mutação insercional a montante do sítio PAM, conforme destacado na Figura 6.
Análise funcional de clones Após a geração de linhagens celulares nocaute CRISPR em hESCs, o próximo passo é confirmar sua pluripotência e potencial de diferenciação. Para isso, testamos diferentes marcadores de pluripotência para três clones diferentes, A1, A5 e B4, e comparamos os resultados com células controle (H9 infectadas apenas por vetor). Os resultados não mostraram alteração no potencial de pluripotência das linhagens celulares knockout, conforme determinado pela imunocoloração para os marcadores OCT4, NANOG e SOX2. Em seguida, as linhagens celulares controle e knockout também foram coradas para o marcador de proliferação celular, KI67, que também não apresentou alteração nas linhagens celulares knockout em comparação com o controle. Esses resultados mostram que o nocaute CRISPR não afetou as propriedades de auto-renovação dessas células. Além disso, a EB e a formação de colônias também não foram afetadas (Figura 7). Usando métodos in vitro estabelecidos em nosso laboratório, todos os clones foram diferenciados com sucesso em três células da camada germinativa, conforme confirmado por imunocoloração para PAX6 (marcador neuroectoderma), Brachyury (marcador mesoderma) e FOXA2 (marcador endoderme). Nenhuma alteração no potencial de diferenciação das linhagens celulares knockout foi observada em comparação com as células controle, o que mostrou que as células knockout mantiveram seu potencial de diferenciação (Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig01.jpg"> 
Figura 1: Diagrama esquemático mostrando o desenho do estudo em 5 etapas. Etapa 1: Projetando e clonando sgRNAs no vetor V2 CRISPR digerido por Bsmb1. Etapa 2: Geração de partículas lentivirais usando vetor de entrada carregando sgRNA junto com plasmídeos de empacotamento por co-transfecção de células HEK293T usando polifecções e concentração viral usando ultracentrifugação. Etapa 3: Infecção de hESCs usando partículas lentivirais em MOI de 10-20 e seleção celular estável usando puromicina seguida de análise de populações de células heterogêneas para ver a eficiência dos sgRNAs. Etapa 4: Clonagem de célula única limitando o método de diluição das células que apresentaram knockdown máximo em populações heterogêneas e seleção de clones únicos. Etapa 5: Expansão de clones únicos e análise em nível de DNA, proteína e análise funcional de clones para stemness e potencial de diferenciação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig02.jpg"> 
Figura 2: Clonagem de sgRNAs no vetor lentiCRISPR V2.puro. (A) Digestão do vetor lentiCRISPR V2.puro com a enzima de restrição, BsmB1. A seta indica um fragmento de enchimento de 1,8 Kb liberado após a digestão do vetor. (B) Análise de PCR de colônias para diferentes clones de L2HGDH sgRNA construções 1 e 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig03.jpg"> 
Figura 3: Western blots e propagação clonal usando seleção de célula única. (A) Análise de Western blot de duas réplicas biológicas diferentes (S1 e S2) de populações heterogêneas de sgRNA co-expressando de forma estável (L2H-1 e L2H-2) e Cas9 junto com hESCs H9 de controle (C). (B) Seleção de célula única e expansão clonal de células H9 expressando de forma estável L2HGDH-sgRNA-1. As setas indicam poços de 96 placas de poços mostrando apenas clones únicos. Barra de escala = 100 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig04.jpg"> 
Figura 4: Análise de Western blot de diferentes clones de H9. (A-C) A análise de Western blot de lisados celulares totais de 22 clones produziu cinco nocautes homozigotos (23%) para L2HGDH. (D) Confirmação de nocautes de L2HGDH de um experimento de replicação biológica diferente usando Western blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig05.jpg"> 
Figura 5: Análise de PCR MSBSP de diferentes clones H9. (A) Análise de sequência do exon 1 de L2HGDH usado para análise de PCR MSBSP. (B) Otimização da temperatura de recozimento para análise de PCR MSBSP usando controle e H9 V2 L2HGDH KO Clone B4. Em 96,8, o controle mostra uma banda, mas B4 não mostra uma banda, como mostrado pelas setas. (C) A análise de todos os clones KO homozigotos resultou no mapeamento abaixo do local da mutação no éxon 1. A1 = In/Del não próximo ao local do PAM; A5 = In/Del Próximo ao local do PAM; A9 = In/Del Bastante próximo ao local do PAM; B4 = In/Del Muito perto do site do PAM B12 = In/Del não perto do site do PAM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig06.jpg"> 
Figura 6: Alinhamento dos produtos de PCR sequenciados de Sanger com a sequência do exon 1 de referência L2HGDH.Múltiplos alinhamentos de produtos de PCR sequenciados por Sanger de A1, A5 e B4 e células de controle foram feitos junto com uma sequência de referência dentro do primeiro exon de L2HGDH do banco de dados NCBI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig07.jpg"> 
Figura 7: Caracterização funcional de linhagens celulares knockout para CRISPR. (A) As células foram imunomarcadas para marcadores de pluripotência (OCT4, NANOG, SOX2), auto-renovação (KI67), EBs e formação de colônias em relação às hESCs H9 infectadas pelo controle. Barras de escala: 100 μM. (B) A porcentagem de células que expressam positivamente (+ve) foi calculada em relação à coloração DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig08.jpg"> 
Figura 8: Potencial de diferenciação de linhagens celulares nocaute CRISPR. Caracterização funcional de linhagens celulares nocaute CRISPR em termos de seu potencial de diferenciação usando marcadores para PAX6 (neuroectoderma), Brachyury (mesoderma) e FOXA2 (Endoderme) em relação às células H9 infectadas pelo controle. Barras de escala: 100 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Etapa do protocolo</td>
			<td>Tempo necessário</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clonagem de sgRNAs em LentiCRISPRv2</td>
			<td>4 dias</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Produção de lentivírus e determinação do título</td>
			<td>5 dias</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infecções por hESC, seleções celulares estáveis e expansão</td>
			<td>2 semanas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seleção e expansão clonal de célula única</td>
			<td>2 semanas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Análise funcional de clones</td>
			<td>2 semanas</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Cronograma para as etapas do protocolo e tempo estimado necessário.

Deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em condições livres de alimentador

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical ...

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A edição do genoma de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) pode ser feita de forma rápida e eficiente. Apresentado aqui é um procedimento experimental robusto para projetar geneticamente hPSCs, como exemplificado pela edição do locus de porto seguro AAVS1 para expressar EGFP e introduzir resistência a antibióticos.

Estabelecimento de Genoma-editados pluripotentes humanas Lines Stem Cell: A partir de Segmentação de Isolamento

Protocolos para gerar linhagens mutantes HPSC usando a plataforma iCRISPR e diferenciar hPSCs em células ß-like glicose-responsivos são descritos. Combinando tecnologia de edição de genoma com a diferenciação HPSC-dirigida fornece uma plataforma poderosa para a análise sistemática do papel das determinantes da linhagem no desenvolvimento humano e progressão da doença.

Genoma Edição e Directed Diferenciação de hPSCs para interrogar Determinantes Lineage no desenvolvimento pancreático humano

Este protocolo descreve detalhadamente a geração de células-tronco livre pegada pluripotentes induzidas (iPSCs) de células do pâncreas humanas em condições de livre de alimentador, seguido pela edição usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas e caracterização de modificado clones de célula única.

Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9

Um protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediada disrupção do gene no mouse e células hematopoiéticas primárias humanas é descrito neste artigo. Ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA são introduzidas através de eletroporação com sgRNAs gerados através da transcrição em vitro e Cas9 comercial. Alta eficiência de edição é obtida com tempo limitado e custo financeiro.

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Aqui descrito é um protocolo para marcação endogenamente expressas proteínas com etiquetas fluorescentes em células-tronco pluripotentes induzidas humana usando CRISPR/Cas9. Células presumidamente editadas são enriquecidas por fluorescência ativada celular classificação e linhas celulares clonal são geradas.

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

Este protocolo fornece um método para facilitar a geração de mudanças heterozygous ou homozygous definidas do nucleotide usando CRISPR-CAS9 em pilhas de haste pluripotentes humanas.

Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

Aqui, descrevemos um método detalhado para edição de genes sem costura em células-tronco pluripotentes humanas usando um plasmídeo doador baseado em piggyBac e o mutante Cas9 nickase. Duas mutações pontuais foram introduzidas no éxon 8 do locus do fator nuclear 4 alfa do hepatócito (HNF4α) em células-tronco embrionárias humanas (hESCs).

Introduzindo mutações pontuais em células-tronco pluripotentes humanas usando edição de genoma contínua

O protocolo a seguir fornece instruções para a adaptação humana tronco pluripotentes induzidas (iPS) células para alimentação livre de cultura usando completa KnockOut Feeder livre de substituição de soro médio (KSR-FF). Uma vez adaptado, instruções para a manutenção contínua também são fornecidos.

Alimentador livre adaptação, Cultura e Passaging de células iPS humanas usando Completa KnockOut Alimentador-Free substituição Serum Médio

Aprenda a realizar deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas H9 usando sistema lentiviral. Este método mantém a pluripotência e capacidade de diferenciação em três camadas germinativas.

Deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em condições livres de alimentador

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