In vivo Imagem de fluorescência confocal da atividade neural induzida por estimulação sensorial em peixes-zebra larvais parcialmente contidos

[Instrutor] Para começar, prepare 3% de agros de baixo ponto de fusão em meio embrionário, aqueça os agros a uma temperatura segura para manipular o peixe-zebra sem causar danos. Antes que o agros esfrie e solidifique, posicione as larvas de dois a sete dias após a fertilização com o lado dorsal para cima em uma placa de Petri com fundo de vidro. Assim que o agros solidificar com as larvas no lugar, adicione cinco mililitros de meio embrionário ao prato. Usando um bisturi, corte os agros conforme necessário ao redor das larvas. Transfira a placa de Petri com o peixe-zebra para o estágio do microscópio confocal. Após a aclimatação por 20 minutos, use imagens de campo claro para centralizar os peixes sob a objetiva de imersão em água de 40 vezes à temperatura ambiente. Defina os parâmetros de aquisição do microscópio confocal com base nas qualidades e níveis de expressão da molécula fluorescente, bem como na profundidade e nas propriedades ópticas do tecido. Ajuste as configurações de potência do laser e ganho mestre para capturar a luz fluorescente adequadamente na faixa ideal e evitar a perda desnecessária de fluorescência dependente do sucesso do campo G. Em seguida, centralize o campo de visão em um aglomerado neuronal localizado na porção rostral da medula espinhal. Execute uma varredura de série temporal com um campo de visão de 79,86 micrômetros quadrados a uma taxa de quadros de 1,20 quadros por segundo com uma resolução espacial de 0,119 micrômetros quadrados por pixel. Ajuste o campo de visão, o tamanho e a velocidade de aquisição com base nos objetivos do experimento. Dois minutos após o início da imagem, adicione 41,67 microlitros de solução estoque de isotiocianato de aloe ou meio embrionário ao prato e continue registrando por aproximadamente 30 segundos para observar mudanças na atividade do G Camp 6 na região de interesse por meio de imagens de lapso de tempo. Se a saída gravada não estiver no formato de arquivo TIF de pontos, exporte os arquivos de imagem como arquivos TIF de pontos do pacote de software do microscópio para análise Fiji a jusante. Depois de baixar o software Fiji para análise de rastreamento neural, abra Fiji, importe os arquivos CZI de pontos para o programa. Use as ferramentas de círculo ou à mão livre em Fiji para destacar uma área ou neurônio de interesse clicando nos respectivos ícones. Depois de selecionar a região de interesse ou ROI, clique em analisar, ferramentas e gerenciador de ROI na barra de ferramentas Fiji. Clique em adicionar T para adicionar o ROI selecionado à janela do gerenciador de ROI. No gerenciador de ROI, clique em mais e em várias medidas para analisar o ROI. Deixe as configurações padrão e clique em OK para gerar dados brutos. Em seguida, salve a saída como um arquivo CSV para manipulação adicional usando Python ou planilhas. Agora normalize os dados brutos para representá-los como um traço neural, calculando a média dos últimos 30 segundos do pré-estímulo de dois minutos e gere a intensidade de fluorescência normalizada usando a fórmula fornecida e plote os dados normalizados como traços neurais. A administração de isotiocianato de aloe causou um aumento na fluorescência de G CAMP 6S dentro de uma região cerebral localizada de larvas de peixe-zebra, indicando atividade neural aumentada. A uma velocidade de captura lenta de 0,10 quadros por segundo, os neurônios no cérebro posterior e na medula espinhal eram claramente visíveis com alta resolução. Aumentar a velocidade de captura para 0,79 quadros por segundo resultou em uma ligeira perda de resolução espacial, mas melhorou a resolução temporal. A 3,16 quadros por segundo, os neurônios pareciam menos distintos enquanto capturavam mais dinâmica temporal.