Name: Raízes adventícias de álamo induzidas por patógenos do cancro do caule: um sistema experimental para estudar a biologia das raízes e os processos relacionados à resposta à luz (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprenda a induzir raízes adventícias em álamo usando inoculação de patógenos fúngicos via girdling do floema. Este método permite investigar biologia radicular e respostas fisiológicas à luz em plantas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Estudando o impacto de patógenos fúngicos no cancro do caule do choupo e no transporte vascular

<ol><li>Xing, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+pathogens+of+canker+disease+trigger+canopy+dieback+in+poplar+saplings+by+inducing+functional+failure+of+the+phloem+and+cambium+and+carbon+starvation+in+the+xylem%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Fungal pathogens of canker disease trigger canopy dieback in poplar saplings by inducing functional failure of the phloem and cambium and carbon starvation in the xylem.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 101523, 112(2020).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Ágar</td><td>Solarbio</td><td>A8190&nbsp; &nbsp;</td><td>Fornece nutrição para o crescimento de fungos</td></tr><tr><td>Folha de alumínio</td><td>Biosharp</td><td>BS-QT-027B</td><td>Para fornecer sombreamento para a área infectada</td></tr><tr><td>Faca de anelamento</td><td>Empresas de ferramentas de hardware MoGong</td><td></td><td>Circunferência da epiderme dos caules/ramos do choupo</td></tr><tr><td>Fita de enxerto</td><td>CAPI</td><td>5cm</td><td>Para fixar fungos nas plantas</td></tr><tr><td>PD (Extração de batata, Dextrose)&nbsp;</td><td>Solarbio</td><td>Pág. 7360</td><td>Fornece nutrição para o crescimento de fungos</td></tr><tr><td>Filme plástico PE</td><td>MiaoJie</td><td>413703</td><td>Para fixar fungos nas plantas</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Bkman biological Co., Ltd&nbsp;</td><td>90 milímetros</td><td>Prepare o meio PDA</td></tr><tr><td>Incubadora termostática</td><td>Instrumento Co. do laboratório de Shanghai Kuntian, Ltd</td><td>KTD-6000</td><td>Fornecer um ambiente para o crescimento de fungos</td></tr></tbody></table>

raízes adventícias de álamo induzidas por patógenos do cancro do caule: um sistema experimental para estudar a biologia das raízes e os processos relacionados à resposta à luz

Poplar Adventitious Roots Induced by Stem Canker Pathogens: An Experimental System for Studying Roots Biology and Light Response-Related Processes

O fluxo de trabalho dos patógenos do cancro do caule que induzem raízes adventícias por meio da inoculação do anelamento é mostrado na Figura 1. Os experimentos aqui conduzidos mostraram que ambos os patógenos do cancro do caule, V. sordida, B. dothidea, e seus isolados (de diferentes hospedeiros, regiões ou patogenicidade) podem induzir a formação de ARs em espécies de choupo. Neste protocolo, usamos isolados de V. sordida CZC, CFCC86775 e B. dothidea SD50 e SD81 para produzir ARs em P. alba var. V sodida O CZC é um patógeno típico usado e foi depositado no Centro Geral de Coleta de Culturas Microbiológicas da China (CGMCC 40575); Isolado de V. sordida CFCC86775 foi comprado do Centro de Coleta de Cultura Florestal da China, enquanto dois isolados de SD foram coletados do choupo da doença do cancro na província de Shandong e depositados em nosso laboratório. Conforme mostrado na Figura 2, calos formados na região de anelamento (Figura 2A, painel 1) e poucos ARs formados no tratamento de douramento e remoção do câmbio (Figura 2A, painel 2), enquanto raízes fibrosas vermelhas e abundantes foram produzidas após o tratamento de inoculação do floema (Figura 2A, painéis 3-6). Observamos também que os ARs foram induzidos em diferentes espécies ou clones de choupo, como P. alba var. pyramidalis, Populus × beijingensis, P. alba × P. tremula var. glandulosa clone 84K, P. euramericana cv. 'Bofeng 3', ou outros choupos híbridos). No entanto, neste protocolo, os ARs são produzidos apenas nos caules de P. alba var. pyramidalis de 1 ano de idade. Finalmente, como mostrado na Figura 2 , painel 7, estruturas de ARs também foram induzidas nos troncos de P. alba var. pyramidalis de 6 anos de idade após inoculação do floema pelo patógeno V. sordida. Os diâmetros do tronco do choupo são de cerca de 6-7 cm e o comprimento das raízes fibrosas mais longas foi superior a 7,0 cm.
Conforme mostrado na Figura 2, os segmentos vermelhos foram produzidos nos ARs de choupo de sombreamento após serem expostos à condição de luz solar, de ARs brancos leitosos ou vermelhos claros produzidos nos choupos embrulhados em papel alumínio (Figura 2B, painel 1) para os ARs vermelhos 3 dias depois (Figura 2B, painel 4). Além disso, também notamos que os pigmentos vermelhos foram produzidos em um curto período após a exposição à luz, e a análise da expressão gênica ilustrou que a biossíntese de pigmentos (principalmente cianidina-3-O-glicosídeo) foi transformada diretamente de seus substratos antocianidina, não a biossíntese inovadora desde o início da via metabólica do fenilpropano6.
Neste protocolo, ambos os dois métodos de anelamento (anelamento do floema e da epiderme) podem induzir a formação de ARs nos caules do choupo após a inoculação do patógeno. Ocorreram menos quebra-ventos e menor influência na fisiologia (como transporte de água e carboidratos) em choupos inoculados com anelamento de epiderme; no entanto, parece que a produção de ARs é um pouco rápida e eficiente no anelamento do floema. Portanto, o método de inoculação de anelamento de floema é recomendado na pesquisa de ARs de choupo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67304/67304fig01.jpg"> 
Figura 1: O fluxo de trabalho esquemático da formação de raízes adventícias (ARs) induzida pelo patógeno do cancro do caule por meio de métodos de inoculação de anelamento em choupos. Em primeiro lugar, o patógeno do cancro do caule (cultivado a 28 ° C no escuro por 7 a 10 dias) foi cortado em tiras de micélio (1,2 cm de largura). Mudas de choupo de um ano de idade ou ramos de um ano de idade foram cingidos nas hastes (a ~ 30 cm acima do solo ou da base dos ramos, indicado pelas setas azuis) por meio de dois métodos: anelamento do floema (anelamento e descarte dos anéis cingidos que incluem epiderme, floema e tecidos parciais do câmbio nas hastes) ou anelamento da epiderme (anelamento e descarte dos anéis cingidos que incluem apenas a epiderme das hastes). A largura do floema circunçado ou anéis do floema é de 1,0 cm. Em seguida, as regiões cingidas foram cobertas inteiramente com tiras de micélio e envoltas com fita plástica PE imediatamente; os lados do micélio da cinta estavam voltados para a região cingida. Para a pesquisa da biologia radicular, como rizogênese e desenvolvimento radicular, as mudas/ramos de choupo inoculados foram cultivadas por 14-30 dias sob manejo regular (Via I, destacada em setas amarelas). Para a pesquisa de biossíntese de segmentos, fotomorfogênese ou regulação da expressão dos genes relacionados à luz, foi adotado um invólucro adicional de papel alumínio e, em seguida, as mudas/galhos inoculados foram cultivados ~ 20 dias para produzir os ARs. Quando os ARs foram produzidos, a folha de alumínio foi removida dos caules/galhos e os ARs de choupo foram expostos à luz solar ou outra condição de luz (variada no espectro de luz, intensidade, período ou suas combinações) (Caminho II, destacado em setas vermelhas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67304/67304fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67304/67304fig02.jpg"> 
Figura 2: Os patógenos do cancro do caule induziram a formação de raízes adventícias (ARs) e a biossíntese de segmentos nas condições de luz dos ARs em choupo. (A) Diferentes patógenos do cancro do caule induzem a formação de AR em caules de choupo. A1: controle de anel; A2: anelamento e remoção do câmbio (GR); A3-6: Diferentes patógenos do cancro do caule (V. sordida e B. dothidea) induzem a formação de AR em mudas de P. alba var. pyramidalis de 1 ano de idade; A7: ARs produzidos no ramo de P. alba var. pyramidalis de 6 anos. (B) A exposição à luz induz a biossíntese de segmentos em ARs de choupo. B1-B4 representam ARs de choupo expostos em condições de luz em 0, 1, 2 e 3 dias após a exposição. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67304/67304fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Raízes adventícias de álamo induzidas por patógenos do cancro do caule: um sistema experimental para estudar a biologia das raízes e os processos relacionados à resposta à luz

Valsa sordida and Botryosphaeria dothidea are two crucial necrotrophic fungal pathogens that damage many plant hosts, particularly species in the genus ...

O escopo deste protocolo de pesquisa é descrever um método para produzir raízes adventícias por meio de anelamento e inoculação de patógenos fúngicos nos caules de galhos de choupos. Propomos este método como um sistema experimental ideal para o estudo da biologia radicular e dos processos de resposta à luz nas interações choupo-patógeno.Embora a promoção do crescimento de microrganismos benéficos nas raízes, como rizobactérias promotoras de crescimento de plantas, bactérias ecto-endofíticas ou fungos micorrízicos vasculares ou fungos ectomicorrízicos, tenha sido relatada em muitas espécies de plantas, a indução de crescimento adventício por patógenos não foi documentada. Este protocolo apresenta um fenômeno normal de desenvolvimento radicular em choupo.O desenvolvimento e o comportamento das raízes do choupo têm sido estudados em vários ambientes e em interação com microrganismos benéficos. No entanto, nossa pesquisa introduz uma nova área da biologia do crescimento vegetal, a indução de raízes adventícias em choupo por patógenos fúngicos do caule. Acreditamos que essa descoberta avançará não apenas no estudo da biologia do crescimento, mas também na compreensão das interações planta-patógeno.Este protocolo de pesquisa ilustrou que patógenos do caule induziram raízes adventícias em choupos. Podemos aceitar que os patógenos também podem alterar os padrões de expressão gênica em raízes adventícias nos níveis de transcrição, pós-transcrição e modificação epigenética. Portanto, os métodos propostos neste protocolo abriram caminho para pesquisas sobre raízes adventícias de choupo.No futuro, vamos nos concentrar nos mecanismos fisiológicos e moleculares dos patógenos do cancro que induzem a formação de raízes adventícias no choupo. Também pesquisaremos o mecanismo de resistência e modificação epigenética de raízes adventícias de choupo após a inoculação do patógeno e tentaremos descobrir a aplicação de florestamento desse fenômeno.[Narrador] Para preparar ágar dextrose de batata ou meio PDA, dissolva seis gramas de extrato de batata, 20 gramas de dextrose e 20 gramas de ágar em um litro de água. Esterilize o meio a 121,1 graus Celsius por 30 minutos. Despeje o meio em placas de Petri, cada uma contendo 20 mililitros de meio PDA. Inocule o cubo de micélio fúngico ativado de Valsa sordida ou Botryosphaeria dothidea no centro da placa de Petri. Incube o prato no escuro a 28 graus Celsius por sete a 10 dias. Após a incubação, corte o meio BDA com micélio fúngico em tiras. Em seguida, selecione uma muda de choupo de crescimento vigoroso de um a dois anos e escolha um caule maduro da muda. Esterilize a região de inoculação com etanol 75%. Circunde cuidadosamente a epiderme e o floema do caule do choupo esterilizado. Remova os anéis do floema cingidos, incluindo o câmbio parcial, para expor o câmbio interno ou os tecidos do xilema. Cubra completamente a região do anelamento com tiras de micélio fúngico como tratamento de inoculação do anelamento do floema. Enrole o caule inoculado com quatro camadas de fita adesiva elástica e transparente para reter a umidade. Usando uma faca esterilizada, raspe e danifique o tecido interno do câmbio da área exposta. Em seguida, inocule a cinta de PDA na região do anelamento como parte do tratamento de remoção do câmbio. Em seguida, inocular as regiões de anelamento diretamente com tiras médias de BDA não cultivadas como controle de anelamento. Enrole o caule inoculado com quatro camadas de fita adesiva elástica e transparente para reter a umidade. Amarre o caule inoculado com um pedaço de pau para protegê-lo do quebra-vento. Após 14 a 30 dias de inoculação, observar e registrar a formação de raízes adventícias de choupo. Circunde cuidadosamente a epiderme do caule do choupo para expor o tecido verde do floema. Em seguida, raspe verticalmente o tecido do floema e exponha a estrutura interna do floema. Inocule a região da epiderme circuncidada com micélio fúngico e cinta de PDA, conforme demonstrado anteriormente. Enrole as hastes inoculadas com quatro camadas de fita adesiva elástica e transparente. Após 14 a 30 dias de inoculação, observar e registrar a formação de raízes adventícias de choupo ou raízes adventícias. Os patógenos do cancro do caule V. sordida e B. dothidea induziram a formação de raízes adventícias em hastes de Populus alba var. pyramidalis após a inoculação do anelamento do floema. Raízes adventícias também foram induzidas nos troncos de P. alba var. pyramidalis de 6 anos de idade pelo patógeno V. sordida após o anelamento do floema, com comprimentos de raiz superiores a 7,0 centímetros. Depois de induzir raízes adventícias em choupo usando o método de inoculação de anelamento de floema ou anelamento de epiderme, envolva a região inoculada com patógeno com papel alumínio para tratamento de sombreamento. Amarre a haste com um pedaço de pau para protegê-la do quebra-vento. Após 20 dias, remova a folha de alumínio das hastes. Observe e fotografe as raízes adventícias de choupo sombreadas e não sombreadas com folha de alumínio. Cultive as raízes adventícias sombreadas do choupo à luz do sol ou sob fontes de luz artificial. Após um a cinco dias de exposição à luz, remova as fitas de enxerto e colha as raízes adventícias do choupo. Enrole as raízes adventícias com papel alumínio. Mergulhe as amostras de raízes adventícias em nitrogênio líquido e armazene-as a menos 80 graus Celsius. A exposição à luz transformou raízes adventícias brancas ou vermelho-claras em raízes adventícias vermelhas em P. alba var. pyramidalis em três dias, com biossíntese de pigmento ligada à formação de cianidina 3-O-glicosídeo.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo fornece um protocolo para o cultivo de mudas de Arabidopsis no RootChip, uma plataforma microfluídica imagem que combina controle automatizado das condições de crescimento com acompanhamento raiz microscópica e FRET baseado em medição de níveis de metabólitos intracelulares.

Time-lapse imagens de fluorescência de crescimento de raiz Arabidopsis com Manipulação acelerada do meio root usando o RootChip

O Sistema Induzível de Raiz Lateral (LRIS) permite a indução síncrona de raízes laterais e é apresentado para Arabidopsis thaliana e milho.

Lateral Root Inducible sistema no<em&gt; Arabidopsis</em&gt; E Milho

Este protocolo mostra um método de preparação de amostras de plantas para microscopia de folha de luz. A configuração é caracterizada pela montagem da planta verticalmente na superfície de um gel e deixando-a crescer em condições de luz controlada. Isso permite a observação a longo prazo do desenvolvimento dos órgãos das plantas em condições padronizadas.

Microscopia de Luz Folha de fluorescência das raízes das plantas que crescem na superfície de um gel

Este protocolo apresenta um resumo detalhado das estratégias para inocular raízes vegetais com micróbios transportados pelo solo. Exemplificados para os fungos Verticillium longisporum e Verticillium dahliae, três diferentes sistemas de infecção radicular são descritos. Potenciais aplicações e possíveis análises a jusante são destacadas, e vantagens ou desvantagens são discutidas para cada sistema.

Estratégias de inoculação para infectar raízes vegetais com microrganismos transportados pelo solo

Usamos ferramentas laboratoriais simples para examinar a arquitetura do sistema radicular (RSA) de Arabidopsis e Medicago. As plântulas são cultivadas hidroponicamente sobre malha e espalhadas usando um pincel de arte para revelar a RSA. As imagens são tiradas usando digitalização ou uma câmera de alta resolução e, em seguida, analisadas com o ImageJ para mapear traços.

Um Protocolo Simples para Mapear as Características da Arquitetura do Sistema Radicular da Planta

Fornecemos um protocolo passo a passo para avaliar a resistência do choupo aos patógenos do cancro do caule usando um método de inoculação de folhas in vivo . Este método é especialmente adequado para avaliação em larga escala da resistência à doença do cancro de Cytospora chrysosperma e Botryosphaeria dothidea na progênie reprodutora de choupo na China.

Inoculação foliar in vivo: um método alternativo para avaliar a resistência a doenças de clones híbridos no melhoramento genético de choupo da doença do cancro do caule

O Stemgent induzível Dox Mouse Set Lentivirus TF pode reprogramar fibroblastos embrionárias de camundongos (MEFs) para pluripotentes induzidas da haste (iPS) células. Aqui demonstramos o protocolo para DOX induzível-expressão de fatores de reprogramação em ratos transcrição Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc para gerar colônias iPS que expressam marcadores comuns MES pluripotência.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos de rato embrionárias com um fator de transcrição Quatro, Doxiciclina induzível Sistema de Transdução Lentivirus

Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

A natureza das interações entre células tronco e progenitoras hematopoéticas (hspCs) e nichos de medula óssea é pouco compreendido. Modificações de hardware personalizado e um protocolo de aquisição multi-passo permite o uso de dois fótons e microscopia confocal a imagem ex vivo hspCs rotulados hospedados dentro de áreas da medula óssea, as interações de rastreamento e movimento.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

A celulose cristalina é um constituinte importante da parede celular da planta. No entanto, sua quantificação em uma resolução celular é tecnicamente desafiadora.  Aqui, relatamos o uso de tecnologia de luz polarizada e seções de choque radicular para obter informações da composição da parede celular em uma resolução espaço-temporal.

Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações

Aprenda a induzir raízes adventícias em álamo usando inoculação de patógenos fúngicos via girdling do floema. Este método permite investigar biologia radicular e respostas fisiológicas à luz em plantas.

Raízes adventícias de álamo induzidas por patógenos do cancro do caule: um sistema experimental para estudar a biologia das raízes e os processos relacionados à resposta à luz (Vídeo) | JoVE Journal

Raízes adventícias de álamo induzidas por patógenos do cancro do caule: um sistema experimental para estudar a biologia das raízes e os processos relacionados à resposta à luz

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