Raízes adventícias de álamo induzidas por patógenos do cancro do caule: um sistema experimental para estudar a biologia das raízes e os processos relacionados à resposta à luz

O escopo deste protocolo de pesquisa é descrever um método para produzir raízes adventícias por meio de anelamento e inoculação de patógenos fúngicos nos caules de galhos de choupos. Propomos este método como um sistema experimental ideal para o estudo da biologia radicular e dos processos de resposta à luz nas interações choupo-patógeno.

Embora a promoção do crescimento de microrganismos benéficos nas raízes, como rizobactérias promotoras de crescimento de plantas, bactérias ecto-endofíticas ou fungos micorrízicos vasculares ou fungos ectomicorrízicos, tenha sido relatada em muitas espécies de plantas, a indução de crescimento adventício por patógenos não foi documentada. Este protocolo apresenta um fenômeno normal de desenvolvimento radicular em choupo.

O desenvolvimento e o comportamento das raízes do choupo têm sido estudados em vários ambientes e em interação com microrganismos benéficos. No entanto, nossa pesquisa introduz uma nova área da biologia do crescimento vegetal, a indução de raízes adventícias em choupo por patógenos fúngicos do caule. Acreditamos que essa descoberta avançará não apenas no estudo da biologia do crescimento, mas também na compreensão das interações planta-patógeno.

Este protocolo de pesquisa ilustrou que patógenos do caule induziram raízes adventícias em choupos. Podemos aceitar que os patógenos também podem alterar os padrões de expressão gênica em raízes adventícias nos níveis de transcrição, pós-transcrição e modificação epigenética. Portanto, os métodos propostos neste protocolo abriram caminho para pesquisas sobre raízes adventícias de choupo.

No futuro, vamos nos concentrar nos mecanismos fisiológicos e moleculares dos patógenos do cancro que induzem a formação de raízes adventícias no choupo. Também pesquisaremos o mecanismo de resistência e modificação epigenética de raízes adventícias de choupo após a inoculação do patógeno e tentaremos descobrir a aplicação de florestamento desse fenômeno.

[Narrador] Para preparar ágar dextrose de batata ou meio PDA, dissolva seis gramas de extrato de batata, 20 gramas de dextrose e 20 gramas de ágar em um litro de água. Esterilize o meio a 121,1 graus Celsius por 30 minutos. Despeje o meio em placas de Petri, cada uma contendo 20 mililitros de meio PDA. Inocule o cubo de micélio fúngico ativado de Valsa sordida ou Botryosphaeria dothidea no centro da placa de Petri. Incube o prato no escuro a 28 graus Celsius por sete a 10 dias. Após a incubação, corte o meio BDA com micélio fúngico em tiras. Em seguida, selecione uma muda de choupo de crescimento vigoroso de um a dois anos e escolha um caule maduro da muda. Esterilize a região de inoculação com etanol 75%. Circunde cuidadosamente a epiderme e o floema do caule do choupo esterilizado. Remova os anéis do floema cingidos, incluindo o câmbio parcial, para expor o câmbio interno ou os tecidos do xilema. Cubra completamente a região do anelamento com tiras de micélio fúngico como tratamento de inoculação do anelamento do floema. Enrole o caule inoculado com quatro camadas de fita adesiva elástica e transparente para reter a umidade. Usando uma faca esterilizada, raspe e danifique o tecido interno do câmbio da área exposta. Em seguida, inocule a cinta de PDA na região do anelamento como parte do tratamento de remoção do câmbio. Em seguida, inocular as regiões de anelamento diretamente com tiras médias de BDA não cultivadas como controle de anelamento. Enrole o caule inoculado com quatro camadas de fita adesiva elástica e transparente para reter a umidade. Amarre o caule inoculado com um pedaço de pau para protegê-lo do quebra-vento. Após 14 a 30 dias de inoculação, observar e registrar a formação de raízes adventícias de choupo. Circunde cuidadosamente a epiderme do caule do choupo para expor o tecido verde do floema. Em seguida, raspe verticalmente o tecido do floema e exponha a estrutura interna do floema. Inocule a região da epiderme circuncidada com micélio fúngico e cinta de PDA, conforme demonstrado anteriormente. Enrole as hastes inoculadas com quatro camadas de fita adesiva elástica e transparente. Após 14 a 30 dias de inoculação, observar e registrar a formação de raízes adventícias de choupo ou raízes adventícias. Os patógenos do cancro do caule V. sordida e B. dothidea induziram a formação de raízes adventícias em hastes de Populus alba var. pyramidalis após a inoculação do anelamento do floema. Raízes adventícias também foram induzidas nos troncos de P. alba var. pyramidalis de 6 anos de idade pelo patógeno V. sordida após o anelamento do floema, com comprimentos de raiz superiores a 7,0 centímetros. Depois de induzir raízes adventícias em choupo usando o método de inoculação de anelamento de floema ou anelamento de epiderme, envolva a região inoculada com patógeno com papel alumínio para tratamento de sombreamento. Amarre a haste com um pedaço de pau para protegê-la do quebra-vento. Após 20 dias, remova a folha de alumínio das hastes. Observe e fotografe as raízes adventícias de choupo sombreadas e não sombreadas com folha de alumínio. Cultive as raízes adventícias sombreadas do choupo à luz do sol ou sob fontes de luz artificial. Após um a cinco dias de exposição à luz, remova as fitas de enxerto e colha as raízes adventícias do choupo. Enrole as raízes adventícias com papel alumínio. Mergulhe as amostras de raízes adventícias em nitrogênio líquido e armazene-as a menos 80 graus Celsius. A exposição à luz transformou raízes adventícias brancas ou vermelho-claras em raízes adventícias vermelhas em P. alba var. pyramidalis em três dias, com biossíntese de pigmento ligada à formação de cianidina 3-O-glicosídeo.