Name: Estabelecendo um modelo de inflamação grave da córnea em ratos com base na curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo de inflamação corneana grave em ratos Sprague-Dawley usando curetagem do epitélio combinada com sutura. Este método permite estudar os efeitos da inflamação nas células-tronco limbais sem danificá-las diretamente.

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<table><tbody><tr><td>Linha de sutura 10-0</td><td>Alcon, Inc., EUA</td><td>8065698001</td><td></td></tr><tr><td>trefina corneana de 2 mm</td><td>Suzhou XVI Vision Company, China</td><td>http://www.66vision.com/</td><td></td></tr> <tr><td>20 &mu; L, 100 &mu; L, cabeças de pistola de pipeta de 1 mL, placas de cultura de placas de cultura de células, tubos de centrífuga</td><td>Guangzhou Jiete Biological Co., Ltd., China</td><td>https://www.jetbiofil.com/index.html-20</td><td></td></tr> <tr><td>/ -80 &deg; Frigorífico C</td><td>Qingdao Haier Company, China</td><td>https://www.haier.com/cn/</td><td></td></tr> <tr><td>Uma seringa de 10 mL</td><td>&nbsp; Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., China</td><td>https://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html</td><td></td></tr><tr><td>Aderir ao slide</td><td>ShiTai Company</td><td>188105</td><td></td></tr><tr><td>álcool amileno</td><td>Xangai. Macklin Biochemical, China</td><td>http://www.macklin.cn/products/</td><td></td></tr> <tr><td>Anti-Citoquertina</td><td>Abcam, Reino Unido</td><td>ab76318</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-queratina 12 EPR17882</td><td>Abcam, Reino Unido</td><td>ab185627</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-PAX6</td><td>Abcam, Reino Unido</td><td>ab195045</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas anti-decapagem, lamínulas</td><td>Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. , China</td><td>https://cn.citotest.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Autoclave</td><td>Hirayama, Japão</td><td>https://hirayama.com.cn/about/</td><td></td></tr> <tr><td>Avertin</td><td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology, China</td><td>https://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., China</td><td>https://www.siobp.com/web</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de forno de CO2, triturador ultrassônico, centrífuga</td><td>Thermo Fisher Technologies Inc., EUA</td><td>https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., China</td><td>https://www.clinx.cn/about</td><td></td></tr><tr><td>pinça epitelial da córnea</td><td>Suzhou XVI Vision Company, China</td><td>53418D</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector. Inc., EUA</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DEPC água</td><td>&nbsp; Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., China</td><td>https://www.siobp.com/web</td><td></td></tr><tr><td>creme para os olhos Dicuro (creme para os olhos com ofloxacina)</td> <td>Santian Pharmaceutical Corporation, Japão</td><td>https://www.santen.com/asia</td><td></td></tr><tr><td>D-KSFM, meio de cultura, anticorpo duplo e PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., EUA</td><td>https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html</td><td></td></tr><tr><td>ED1</td><td>AbD Serote c, Reino Unido</td><td>&nbsp; </td><td></td>MCA341GA</tr><tr><td>Balança eletrônica</td><td>Shanghai Ohaus Biotechnology Company, China</td><td>http://shbio.com/company</td><td></td></tr><tr><td>Invólucro da membrana</td><td>Parafilm, Inc., EUA</td><td>https://www.sigmaaldrich.cn</td><td></td></tr><tr><td>A tira de teste de sódio fluoresceína foi usada em oftalmologia</td><td>Tianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., China</td><td>https://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/</td><td></td></tr><tr><td>Sistema micrográfico de contraste de fase invertido fluorescente</td><td>TE-2000U, Nikon, Japão</td><td>https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa congelada</td><td>Eppendorf, Alemanha</td><td>https://www.eppendorf.sh.cn&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Moldura de folha de vidro</td><td>Xiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., China</td><td>http://www.tagene.net/</td><td></td></tr> <tr><td>H-1200 com agente selante DAPI</td><td>Xiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., China</td><td>Kit</td> de coloração https://www.bosonbio.com.cn/ <td></td></tr><tr><td>HE</td><td>Auragene, China</td><td>Kit http://jushengwu.com/a048/ de solução de</td> corante de <td></td></tr><tr><td>hematoxilina-eosina</td><td>AURAGEN, Estados Unidos</td><td>P032IH</td><td></td></tr><tr><td>Balança eletrônica de alta e baixa precisão</td><td>Sdolis, Alemanha</td><td>https://www.solisinverters.com/global</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Shanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., China</td><td>https://en.reagent.com.cn/</td><td></td></tr> <tr><td>Ki-67 anticorpo</td><td>Abcam, Reino Unido</td><td>ab16667</td><td></td></tr><tr><td>nitrogênio líquido</td><td>Xiamen Yidong Gas Co., Ltd., China</td><td>https://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/</td><td></td></tr> <tr><td>Microhand holder</td><td>Suzhou XVI Vision Company, China</td><td>http://www.66vision.com/</td><td></td></tr> <tr>Pó <td>de multiformaldeído</td><td>Sigm, América</td><td>https://www.sigmaaldrich.cn</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de temperatura normal 46</td><td>Eppendorf, Alemanha</td><td>https://www.thermofisher.cn</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Xangai Maokang Biotechnology Co., Ltd., China</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Sistema micrográfico biológico comum</td><td>Eclipse 50i, Nikon, Japão</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Shanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, China</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>PCR, e o aparelho do reator</td><td>Biometra Thermocycler, Alemanha</td><td>https://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/</td><td></td></tr> <tr><td>Pipetas de várias especificações</td><td>Eppendorf Company, Alemanha</td><td>https://www.eppendorf.com/cn-zh/</td><td></td></tr> <tr><td>Primers para Rt-PCR</td><td>Shanghai Bio-Tech Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colírio de cloridrato de promeaína 0,5%</td><td>Alcon, Inc., EUA</td><td>https://www.alcon.com/about-us</td><td></td></tr><tr><td>Rat PMN antibody</td><td>Fitzgerald, Estados Unidos</td><td>20R-PR020</td><td></td></tr><tr><td>PCR quantitativo de fluorescência em tempo real Applied</td><td>Biosystems,&nbsp; Estados Unidos</td><td>https://www.thermofisher.cn</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcrição reversa</td><td>TAKARA, Japão</td><td>https://www.takarabiomed.com.cn/</td><td></td></tr> <tr><td>Lâmpada de fenda</td><td>TOPCON, Japão</td><td>https://topconchina.cn/</td><td></td></tr> <tr><td>Pinça lisa</td><td>Suzhou XVI Vision Company, China</td><td>http://www.66vision.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Caixa de amostras</td><td>Lambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., China</td><td>http://chuangdianbio.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Bancada Superclean</td><td>New Plus Pi Art High Technology Company Limited, Cingapura</td><td>https://www.hi-p.com/</td><td></td></tr> <tr><td>pinça dentada</td><td>Suzhou XVI Vision Company, China</td><td>http://www.66vision.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Colírio de toppicamida (Medol)</td><td>Alcon, Inc., EUA</td><td>https://www.alcon.com/about-us</td><td></td></tr><tr><td>Trace proteína de ácido nucleico testador de concentração</td><td>Thermo Fisher Technologies Inc., EUA</td><td>https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen Os Estados Unidos</td><td>https://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss, com um microscópio cirúrgico</td><td>Carl ZEIS, Alemanha</td><td>https://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html</td><td></td></tr></tbody></table>

estabelecendo um modelo de inflamação grave da córnea em ratos com base na curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea

Establishing a Severe Corneal Inflammation Model in Rats Based on Corneal Epithelium Curettage Combined with Corneal Sutures

Conforme mostrado na Figura 1A, por meio da observação com uma lâmpada de fenda, verificamos que a cicatrização do epitélio da córnea estava prejudicada. Em circunstâncias normais, o epitélio central da córnea cicatrizaria completamente dentro de 24-48 horas após a remoção, mas na excisão do epitélio central da córnea combinada com um modelo de sutura, novos vasos sanguíneos continuaram a existir. No terceiro dia após o estabelecimento do modelo, foram observados edema límbico corneano significativo e neovascularização, com sinais típicos de deficiência de células-tronco límbicas da córnea aparecendo localmente. Com o tempo, no7º dia, a cura ainda não estava completa. O índice de inflamação da córnea foi avaliado por meio de congestão ciliar, edema paracentral da córnea e edema central da córnea. O edema da córnea piorou gradualmente e a inflamação da córnea (Figura 1A) continuou a piorar. Além disso, a neovascularização da córnea é um indicador de inflamação. Com a progressão da inflamação, a neovascularização da córnea (Figura 1B) e o índice de inflamação (Figura 1C) apresentaram aumento contínuo.
Realizamos crioembedding nos tecidos oculares 7 dias após a criação do modelo. A coloração de hematoxilina e eosina (Figura 2A) mostrou espessamento do epitélio no limbo e córnea central, com o arranjo epitelial perdendo sua morfologia normal, indicando hiperplasia atípica. O estroma corneano apresentava-se edemaciado, com infiltração significativa de células inflamatórias. Usando a coloração de imunofluorescência PMN e ED1 (Figura 2B), foi observado um aumento acentuado na infiltração de neutrófilos e macrófagos. O estudo avaliou fatores inflamatórios usando IL-1β (Figura 2C) e MIP-1α (Figura 2D), descobrindo que a IL-1β atingiu o pico no dia 3 e diminuiu gradualmente a partir de então, enquanto a MIP-1α aumentou continuamente ao longo do tempo.
A inflamação crônica geralmente leva a uma série de deficiências de células-tronco límbicas, como regulação negativa de Pax6, expressão reduzida de Krt12 e metaplasia escamosa do epitélio da córnea. Para verificar se o modelo desenvolvido neste estudo poderia induzir essas alterações no fenótipo epitelial da córnea, foi realizada a coloração por imunofluorescência para Krt12 (Figura 3A) e Pax6 (Figura 3B) no epitélio da córnea. A expressão de Krt12 diminuiu com a inflamação prolongada, com apenas células positivas para Krt12 observadas no dia 7, e a expressão de Pax6 foi significativamente reduzida no epitélio da córnea. No nível de mRNA, os níveis de expressão dos marcadores epiteliais normais da córnea Krt12 ( Figura 3C ) e Pax6 ( Figura 3D ) foram significativamente reduzidos no dia 7. No entanto, os níveis de expressão dos marcadores de metaplasia escamosa Krt10 ( Figura 3E ) e Sprr1b ( Figura 3F ) foram significativamente aumentados no dia 7.
Usamos o marcador de proliferação Ki67 para corar o epitélio da córnea, e os resultados mostraram uma diminuição significativa no número de células epiteliais da córnea positivas para Ki67 no dia 7 (Figura 4A). O status das células-tronco epiteliais da córnea foi avaliado usando o marcador específico de células-tronco límbicas da córnea ABCG2 (Figura 4B) e o marcador de células progenitoras epiteliais P63 (Figura 4C). Os níveis de ABCG2 e P63 foram significativamente menores do que os do grupo normal. Além disso, empregamos o padrão-ouro para células-tronco, o método de cultura clonal, para avaliar as alterações nas células-tronco límbicas da córnea durante esse processo. Observamos que a taxa de formação clonal de células-tronco límbicas da córnea (Figura 4D) diminuiu no dia 3 e diminuiu significativamente no dia 7, com a área média dos clones se tornando menor e apenas alguns holoclones visíveis no dia 7. A eficiência de formação de colônias (CFE) foi obtida pela contagem dos clones celulares visíveis no campo microscópico da placa de cultura. O CFE (Figura 4E) indicou uma redução gradual no número de células-tronco límbicas da córnea sob condições inflamatórias. Isso sugere que a inflamação grave neste modelo leva ao esgotamento das células-tronco epiteliais límbicas da córnea, e esse processo não induz uma transformação fenotípica das células-tronco límbicas da córnea, mas apresenta problemas de diferenciação ou auto-renovação.
O modelo de inflamação usado neste estudo resultou em alterações corneanas características do LSCD, incluindo infiltração extensa de células inflamatórias na córnea, displasia do epitélio da córnea e expressão interrompida ou reduzida de Pax6 e Krt12 no fenótipo epitelial normal da córnea. Além disso, houve um aumento significativo na expressão de mRNA de Krt10. Em resumo, este modelo experimental é adequado para estudar a diferenciação anormal de células-tronco epiteliais da córnea induzida por inflamação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67305/67305fig1v2.jpg"> 
Figura 1: Estabelecimento do modelo de inflamação. Para estudar os efeitos da inflamação grave nas células-tronco epiteliais da córnea, foi estabelecido um modelo de inflamação grave. (A) Após a indução do modelo, a córnea foi observada usando fotografia com lâmpada de fenda. Três dias após a modelagem, o limbo corneano do rato estava severamente edemaciado, com neovascularização óbvia e hiperplasia localizada, que são sinais típicos de deficiência de células-tronco límbicas da córnea. No sétimo dia, o edema da córnea piorou gradualmente e a neovascularização continuou a crescer. Com a progressão da inflamação, (B) neovascularização da córnea e (C) índice de inflamação apresentaram aumento contínuo. *p &lt; 0,05, ****P &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67305/67305fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67305/67305fig02.jpg"> 
Figura 2: A resposta inflamatória após a modelagem. A resposta inflamatória induzida pelo modelo na córnea foi avaliada. (A) A coloração de hematoxilina e eosina do globo ocular mostrou que, durante o processo inflamatório, tanto o epitélio límbico quanto o central da córnea espessaram, e o arranjo epitelial da córnea perdeu sua morfologia normal, exibindo sinais de hiperplasia atípica. (B) O marcador de macrófagos ED1 (verde) e o marcador de neutrófilos PMN (vermelho) foram significativamente aumentados. A RT-qPCR mostrou uma elevação significativa dos fatores inflamatórios epiteliais da córnea (C) IL-1β e (D) MIP-1α. Azul representa coloração nuclear com DAPI, barra de escala = 50 μm; p &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67305/67305fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67305/67305fig03v2.jpg"> 
Figura 3: Alterações fenotípicas das células sob condições inflamatórias. Imunomarcação para (A, vermelho) KRT12 no epitélio límbico e (B) PAX6. (C) Os níveis de expressão de mRNA de KRT12 mostram uma redução significativa à medida que a inflamação progride. (D) A expressão do mRNA de PAX6 revela uma distribuição anormal e uma diminuição acentuada do epitélio límbico sob condições inflamatórias. Por outro lado, a expressão de mRNA de (E) Krt10 e o marcador epitelial da córnea anormalmente diferenciado (F) Sprr1b aumentam significativamente durante a inflamação. Azul representa coloração nuclear com DAPI, barra de escala = 50 μm; **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001, ****p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67305/67305fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67305/67305fig04.jpg"> 
Figura 4: Alterações das células-tronco límbicas sob um estado inflamatório. Imagens de imunofluorescência de (A, vermelho) Ki67 ilustram alterações nas células em proliferação após a indução da inflamação. A expressão de mRNA do marcador de células-tronco (B) ABCG2 é significativamente reduzida. O marcador de células progenitoras (C) p63 também é expresso. (D) Imagens de coloração violeta cristalina e (E) CFE mostram uma diminuição no número de células-tronco límbicas em condições inflamatórias. Azul indica núcleos corados com DAPI; a barra de escala é de 50 μm; *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***P &lt; 0,001, ****P &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67305/67305fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Nome do primer</td>
			<td colspan="3">Sequência de primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">TNF-a</td>
			<td>Encaminhar</td>
			<td colspan="3">5'-TCAGTTCCATGGCCCAGAC-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverter</td>
			<td colspan="3">5'-GTTGTCTTTGAGATCCATGCCATT-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">IL-1β</td>
			<td>Encaminhar</td>
			<td colspan="3">5'-CCTCGTCCTAAGTCACTCGC-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverter</td>
			<td colspan="3">5'-GGCTGGTTCCACTAGGCTTT-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Pax6</td>
			<td>Encaminhar</td>
			<td colspan="3">5'-GTGTTCAGTGCAGAGCCTTC-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverter</td>
			<td colspan="3">5'-TTCACCGTTGCTGTTCACTG-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Trt 12</td>
			<td>Encaminhar</td>
			<td colspan="3">5'-AGCTAACGCGGAACTGGAAA-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverter</td>
			<td colspan="3">5'-CTCTCCGCTCTTGGTGAGGT-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Krt10</td>
			<td>Encaminhar</td>
			<td colspan="3">5'-TCCGGGATCTGGAAGAGTCAA-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverter</td>
			<td colspan="3">5'-TTGGGTAAGCTTTGCTAAGTGGAA-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Sprr1b</td>
			<td>Encaminhar</td>
			<td colspan="3">5'-CCATCCCAAGGCACCTGAG-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverter</td>
			<td colspan="3">5'-TGCTGGTATGGTGATGGAGT-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Actina</td>
			<td>Encaminhar</td>
			<td colspan="3">5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverter</td>
			<td colspan="3">5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Sequência dos primers usados para RT-PCR quantitativo.

Estabelecendo um modelo de inflamação grave da córnea em ratos com base na curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea

Corneal inflammation, especially severe corneal inflammation, plays a significant role in the development of corneal limbal stem cell dysfunction. ...

establishing-severe-corneal-inflammation-model-rats-based-on-corneal

Research

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Medicine

Medicina

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Modelo de Córnea Ex vivo de Ceratite Bacteriana em Suínos: Uma Técnica para Estabelecer Infecção Bacteriana em Células Epiteliais da Córnea

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In vitro e in vivo em modelos para o Estudo de Transição da córnea endotelial-mesenquimal

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Cicatrização de feridas abrasão epitelial da córnea com Burr Ocular como um modelo para córnea

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Um modelo de Glaucoma induzido por sutura Circumlimbal em ratos e camundongos

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Estabelecimento de um modelo severo do olho seco usando dacryoadenectomy completo nos coelhos

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Um modelo de abrasão epitelial para estudar a cicatrização da ferida córnea

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Modelos Animais Ex Vivo e In Vivo para Lesões Mecânicas e Químicas do Epitélio da Córnea

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Indução de lesão de córnea e límplice alcalino pela técnica punch-trephine em modelo murino

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Três estratégias para induzir ceratite neurotrófica e regeneração nervosa na córnea murina

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Fabricação e Aplicação Cirúrgica de Hidrogéis Enriquecidos de Gelatina–Riboflavina com Foto-Cruzamento para Reparo de Feridas Corneanas em Coelhos

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Estabelecendo um modelo de inflamação grave da córnea em ratos com base na curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea (Vídeo) | JoVE Journal

Estabelecendo um modelo de inflamação grave da córnea em ratos com base na curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea

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