Name: Montagem e quantificação de coculturas combinando levedura heterotrófica com cianobactérias fototróficas secretoras de açúcar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Aprenda a montar e quantificar coculturas de cianobactérias fototróficas secretoras de açúcar com leveduras heterotróficas. Este protocolo utiliza marcação fluorescente e citometria de fluxo para monitorar interações microbianas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo para co-cultivo de cianobactérias secretoras de sacarose com parceiros fúngicos

<table><tbody><tr><td>Objetiva Ph1 10x</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>46 04 01-9904</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda 525/40 nm</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0051</td><td>Filtro FITC (em laser de 488 nm)</td></tr> <tr><td>Filtro passa-banda de 660/10 nm</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0055</td><td>Canal APC (em laser de 638 nm)</td></tr> <tr><td>Filtro passa-banda de 710/50 nm</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B71092</td><td>Canal PC5.5 (em laser de 561 nm)</td></tr> <tr><td>Accuvettes para Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A35473</td><td>Copos de amostra com tampas</td></tr><tr><td>Tubo de abertura 30 &mu; M para Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C92760</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td> Capilar <td>Lab Associates</td><td>EQM-ARBP</td><td>para esterilização de material</td></tr><tr><td>Frascos defletores ROTILABO&reg;, Gargalo reto, 250 ml</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>LY95.1</td><td></td></tr><tr><td>BG11 / CoYBG11 componentes</td><td>diferentes fornecedores</td><td></td><td>ver Tabela 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtro estéril de topo de garrafa</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Z222593</td><td>a meios estéreis se você não quiser usar autoclave</td></tr><tr><td>Capilar 45 &micro; m</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651738</td><td></td></tr><tr><td>CASY Contador de Células Modelo TTC</td><td>Schaerfe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASY copos</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651794</td><td></td></tr><tr><td>CASYclean</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651786</td><td>Solução</td></tr><tr><td>de limpeza CASYton</td><td>Solução Omni Life Science</td><td>OLS 5651808</td><td>Solução isotônica&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga (50 mL)</td> <td>Sigmaaldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>BOC</td><td>270182-L</td><td>para fornecer culturas axênicas e co-culturas de cianobactérias</td></tr><tr><td>CONTRAD&reg; 70</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>81911</td><td>Solução de limpeza profunda</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura 20 &vezes; 26 x 0,4 mm</td><td>VWR International GmbH</td><td>631-1190</td><td>Vidro de cobertura para câmara de contagem</td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>Cianobactérias BG-11 Solução de água doce</td><td>Merck KGaA</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>CytExpert Software v. 2.6</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Software de aplicação de citômetro</td></tr><tr><td>CytoFLEX Sheath Fluid</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B51503</td><td>Citômetro de fluido de bomba</td></tr><tr><td>CytoFLEX S</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>BE51180</tr><tr><td>DxH Cleaner para Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>628022</td><td>Solução de limpeza</td></tr><tr><td>Centrífuga tubular Eppendorf (pequena)</td><td>Labstac</td><td>CEN16-15</td><td>para centrifugar menos de 2mL de cultura</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K928.1</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FACS</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>2523749</td><td>tubos para o modo semiautomático</td></tr><tr><td>FlowClean Cleaning Agent, 500ml</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C48093</td><td>Solução de limpeza diária</td></tr><tr><td>Cilindros graduados</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Z131121</td><td>para preparação de meios</td></tr><tr><td>HEPPSO</td><td>Merck KGaA</td><td>R426725</td><td></td></tr><tr><td>Infors MultiTron photoincubator</td><td>Infors AG</td><td></td><td>luz LED branca</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Merck KGaA</td><td>I6758</td><td>Prepare alíquotas, armazene a -20&deg; C, descongele e mantenha no gelo&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoton II para Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>8448011</td><td>Solução isotônica&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaluza v. 2.2</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B16406</td><td>Software de análise de dados de citometria</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>VWR International GmbH</td><td>115-2221</td><td>Tecidos sem fiapos</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>KPO3</td><td>Noah Chemicals</td><td>7790-53-6</td><td></td></tr><tr><td>Copos de medição</td><td>VWR</td><td>213-3747</td><td></td></tr><tr><td>Placa de teste micro, 96 poços, tampa de encaixe, fundo plano, PS, transparente</td><td>SARSTEDT AG & Co. KG</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Base do microscópio</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 09 18-9902/16</td><td></td></tr><tr><td>Cabeça de microsope</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 30 14</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de purificação de água Milli-Q</td><td>Merck Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Mulitisizer 4e contador de partículas</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B23005</td><td>Alternativa ao contador de células CASY</td></tr><tr><td>Neubauer melhorado, profundidade 0,02 mm</td><td>Assistente Alemanha</td><td></td><td>Câmara de contagem</td></tr><tr><td>Neubauer melhorada, profundidade 0,1 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>640010</td><td>Câmara de contagem</td></tr><tr><td>pronta a usar diariamente QC Fluorospheres</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C65719</td><td>Referência para</td></tr><tr><td>garrafas QC SCHOTT</td><td>Dutscher</td><td>90347</td><td>para armazenamento</td></tr><tr><td>Specord&reg; 200 Plus Espectrofotômetro</td><td>Analítico Jena GmbH</td><td></td><td>OD600 / 750</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Merck KGaA</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa (grande)</td> <td>Labstac</td><td>CEN18-06R</td><td>coletar cultura biomassa</td></tr><tr><td>Levedura Base de nitrogênio, sem aminoácidos, sem sulfato de amônio</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>11743014</tr></tbody></table>

montagem e quantificação de coculturas combinando levedura heterotrófica com cianobactérias fototróficas secretoras de açúcar

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

Estabelecimento de co-culturas de S. elongatus fototróficas e leveduras heterotróficas Anteriormente, relatamos resultados detalhados do co-cultivo de Synechococcus elongatus PCC 7942 com uma variedade de subcepas de S. cerevisiae. Para uma descrição abrangente dos resultados da co-cultura com este par de cianobactérias / leveduras, consulte8. Por uma questão de brevidade e precisão, esses resultados não são reproduzidos aqui. Resumidamente, os resultados anteriores indicam uma série de considerações que são importantes para o estabelecimento de co-culturas de cianobactéria-levedura a longo prazo. A principal preocupação é que a capacidade da levedura de sobreviver em condições em que as cianobactérias fornecem as únicas formas de carbono fixo depende fortemente da eficiência com que a cepa de levedura pode utilizar a sacarose. As cepas de S. cerevisiae que evoluíram ou foram projetadas para metabolizar a sacarose de forma mais eficiente27,28 tiveram maior probabilidade de sobreviver à transição para o modo de crescimento de co-cultura, alcançaram densidades celulares mais altas e exibiram maior robustez em experimentos de co-cultura de cianobactérias de longo prazo (dias a semanas)8. A fase inicial de inoculação de uma co-cultura foi especialmente importante para a viabilidade da levedura, provavelmente devido a tensões de diluição da cultura, troca de composição do meio e/ou retirada de uma fonte de carbono mais concentrada. Portanto, os esforços para facilitar a transição de um meio de crescimento mais rico para uma disponibilidade mínima de carbono no início da cocultura podem melhorar o desempenho e a consistência experimental (ver etapa 1.2.1.1). Além disso, S. cerevisiae exibiu respostas ao estresse consistentes com hiperóxia quando inoculado em culturas densas de S. elongatus, consistentes com a formação de O2 como subproduto primário da fotossíntese oxigenada. Portanto, os esforços para evitar o crescimento excessivo do parceiro de cianobactérias e / ou ciclos de luz alternados "dia / noite" podem estender substancialmente a viabilidade de S. cerevisiae em co-culturas de longo prazo. Consulte a seção Discussão para obter um resumo adicional dos fenômenos comuns em coculturas em relação às amostras de controle axênico.
Monitoramento do crescimento de co-culturas usando diferentes metodologias Na seção seguinte, é descrita a quantificação exemplar de um consórcio tripartido artificialmente misturado de Synechocystis e as duas leveduras S. cerevisiae e U. maydis usando três métodos diferentes. Para a mistura, OD750 (para cianobactérias) e OD600 (para os heterótrofos) de culturas individuais foram determinados e ajustados para OD 0,1. Culturas únicas foram misturadas em uma proporção de 1:1:1 usando densidade óptica (que é distinta da contagem de células, veja acima). Para facilitar a discriminação das leveduras no citômetro, cepas repórteres de S. cerevisiae geneticamente modificadas FY1679-O1B29 produzindo constitutivamente mKate2 citoplasmático (genótipo: URA3Δ / pTDH3 :: mKate2; cepa: S. cerevisiae mKate230) e U. maydis cepa AB3331 produzindo constitutivamente eGFP (genótipo: pep4Δ / pRpl40 :: egfp; cepa: U. maydis eGFP32) foram utilizados. É importante notar que a cepa de cianobactérias foi equipada com um plasmídeo replicativo promovendo a expressão constitutiva e forte da versão da proteína fluorescente amarela mVenus (Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus, cepa Synechocystis mVenus, semelhante a33) e, além disso, exibe a forte autofluorescência típica devido à presença da maquinaria fotossintética.
Quantificação microscópica usando câmaras de contagem: Todos os tipos de células na mistura artificial usada de três microrganismos podem ser facilmente discriminados microscopicamente (Figura 2A): Synechocystis e S. cerevisiae são representados por células esféricas que, no entanto, diferem muito em seu diâmetro (Synechocystis: aprox. diâmetro de 1,5-3 μm, S. cerevisiae: aprox. diâmetro de 3-6 μm), enquanto as células de U. maydis têm uma morfologia alongada em forma de charuto e um comprimento de pelo menos 10 μm (Figura 2A). Essas características morfológicas claras permitem a quantificação exata de cada parceiro na mistura. Como exemplo ilustrativo, 37, 18, 36 e 21 células de S. cerevisiae são contadas nos quatro grandes quadrados, respectivamente (Figura 2B). O valor médio é de 28 células. Como um grande quadrado do hemocitômetro utilizado tem uma área de 1 mm2 e a profundidade da câmara foi de 0,02 mm, isso resulta em 28 células por 0,02 μL. Isso corresponde a 1.400 células/μL, o que equivale a 1,4 x 106 células/mL. Os outros tipos de células foram contados e as concentrações foram determinadas de acordo (Figura 2C, Tabela 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig02.jpg"> 
Figura 2: Quantificação microscópica de um consórcio tripartido composto por Synechocystis e as leveduras S. cerevisiae e U. maydis. (A) Imagem de contraste diferencial microscópico (DIC) de uma mistura artificialmente combinada dos microrganismos indicados. Todas as espécies podem ser facilmente distinguidas por sua morfologia. Barra de escala: 10 μm. (B) Resultados de contagem exemplares para uma mistura montada artificialmente das cepas indicadas com base em culturas axênicas com um OD de 0,1. Os quatro grandes quadrados nas bordas da grade foram analisados (marca vermelha na Figura 1D). (C) O valor médio das diferentes células contadas nos quatro quadrados foi usado para calcular a concentração de células na suspensão usando a seguinte equação: Valor médio/(profundidade da câmara [0,02 mm] x tamanho do quadrado contado [1 mm2] x 1.000). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Quantificação usando contadores de partículas: Os contadores de partículas determinam o número de partículas em uma suspensão, dependendo de seu tamanho. No conjunto de dados de exemplo, foi usado um contador de partículas com um capilar de 45 μm. Como as células de S. cerevisiae e U. maydis apresentam dimensões semelhantes, elas não podem ser distinguidas no contador de partículas, enquanto as células menores de Synechocystis podem ser claramente separadas. A análise de culturas individuais, portanto, mostra picos em posições idênticas referentes a 3 a 6 μm para as duas leveduras (Figura 3A). Durante a medição, é aplicada uma pressão negativa, o que faz com que as células entrem no capilar. Isso altera brevemente a resistência elétrica para que o dispositivo possa determinar o tamanho da partícula com base na alteração. Na cultura mista, dois picos distintos podem ser detectados, um associado às células cianobacterianas menores e o outro representando uma fração conjunta das duas espécies de leveduras (Figura 3B). É importante ressaltar que, além dos picos refletindo as células vivas, picos adicionais foram detectados em cerca de 1 μm (Figura 3), correspondendo a detritos celulares e partículas menores. Sinais que apareceriam em diâmetros maiores do que o esperado podem ser causados por agregações celulares. É importante notar que a forma dos picos reflete a homogeneidade das células: um pico acentuado mostra células muito homogêneas, o que é improvável para uma co-cultura. Em uma co-cultura, espera-se ver um pico muito amplo ou mesmo dois picos se os parceiros da co-cultura forem claramente diferentes em tamanho. Para as culturas axênicas de fungos heterotróficos, o pico pode ser um pico médio largo.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2.jpg"> 
Figura 3: Quantificação de um consórcio tripartido composto por Synechocystis mVenus e as leveduras S. cerevisiae mKate2 e U. maydis eGFP usando um contador de partículas. (A) Saída visual das análises de culturas axênicas das três cepas, conforme indicado nos gráficos (contador de células com capilar de 45 μm). (B) Arquivo de saída visual exemplar para a análise do consórcio tripartido artificial usando condições idênticas. O contador de partículas não suporta a discriminação das duas espécies de leveduras, ambas representadas pelo segundo pico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Quantificação por citometria de célula única: Usando o citômetro de fluxo de célula única, as diferentes populações de células podem ser facilmente distinguidas com base em suas propriedades de (auto) fluorescência e dispersão de luz. As células fototróficas (Synechocystis) podem ser diferenciadas das células heterotróficas (U. maydis e S. cerevisiae) com base na autofluorescência vermelha dos pigmentos fotossintéticos que é medida no canal APC-H (Figura 4A). Com base nessa separação inicial de células fototróficas e heterotróficas, as duas populações heterotróficas podem ser distinguidas com base em seus marcadores fluorescentes eGFP no canal FITC-H e mKate2 no canal PC5.5 ( Figura 4B , C ). Em um gráfico de pontos mostrando as propriedades de espalhamento de todas as três populações (FSC-H e FSC-Width), as populações também podem ser distinguidas com apenas algumas pequenas sobreposições das populações (Figura 4D).
Com este método, 10 μL das amostras diluídas foram analisadas com uma taxa de fluxo de 10 μL/min, permitindo uma quantificação de aproximadamente 70.000 células em 1 min. Aproximadamente 60% dessas células poderiam ser atribuídas a Synechocystis (4,23 x 106 células/mL), enquanto os 40% restantes estavam igualmente distribuídos entre U. maydis (1,35 x 106 células/mL) e S. cerevisiae (1,36 x 106 células/mL, Figura 4E, Tabela 2).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig04.jpg"> 
Figura 4: Quantificação de um consórcio tripartido composto pela cianobactéria Synechocystis mVenus e as leveduras U. maydis eGFP e S. cerevisiae mKate2 usando citometria de fluxo de célula única. Gráficos de exemplo obtidos após a medição de uma cultura mista de Synechocystis mVenus (verde escuro), U. maydis eGFP (verde claro) e S. cerevisiae mKate2 (vermelho) na proporção de 1/3 OD750 / 1/3 OD600 / 1/3 OD600 em um citômetro (A) mostrando um histograma da contagem de eventos e fluorescência no canal APC-H (ex.: 638 nm, em.: 660/10 nm) de todas as células usadas para diferenciar células fototróficas e heterotróficas com base em sua autofluorescência. (B) Um histograma da contagem de eventos e fluorescência no canal FITC-H (ex.: 488 nm, em.: 525/40 nm) de todas as células heterotróficas usadas para diferenciar células U. maydis eGFP e S. cerevisiae mKate2 com base em suas propriedades de fluorescência verde. (C) Um histograma da contagem de eventos e fluorescência no canal PC5.5-H (ex.: 561 nm, em.: 710/50 nm) de todas as células heterotróficas usadas para diferenciar células U. maydis eGFP e S. cerevisiae mKate2 com base em suas propriedades de fluorescência vermelha. (D) Um gráfico de pontos dos sinais de espalhamento na largura do FSC sobre o canal FSC-H usado para identificar as populações de células sem propriedades de fluorescência. (E) As estatísticas da população, incluindo as contagens de eventos, porcentagens e médias aritméticas e desvios padrão (DP) dos canais de fluorescência relevantes. A quantidade total de células, juntamente com seu tamanho e fluorescência, foi determinada em um volume de 10 μL com uma taxa de fluxo de 10 μL / min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para visualizar comparativamente a saída dos diferentes métodos de quantificação, os números de células determinados são apresentados nas duas tabelas a seguir (Tabela 2 e Tabela 3). As concentrações finais de células determinadas usando os três métodos descritos anteriormente estão em uma faixa semelhante para todos os métodos. O citômetro fornece o maior tamanho de amostra, seguido pelo contador de partículas e pela quantificação microscópica, com uma diminuição de aproximadamente uma ordem de grandeza entre os métodos.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Co-cultura 1:1:1</td>
			<td>Fotômetro</td>
			<td colspan="2">Citômetro</td>
			<td colspan="2">Contador de partículas</td>
			<td colspan="2">Câmara de contagem de microscopia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Organismo</td>
			<td>OD750/600</td>
			<td>contagem de células</td>
			<td>células/mL</td>
			<td>contagem de células</td>
			<td>células/mL</td>
			<td>contagem de células</td>
			<td>células/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,618</td>
			<td>1.36 x 106</td>
			<td rowspan="2">1,546*</td>
			<td rowspan="2">2,58 x 106*</td>
			<td>112</td>
			<td>1,40 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,541</td>
			<td>1.35 x 106</td>
			<td>89</td>
			<td>1.11 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Synechocystis sp. PCC 6803 mVênus</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>42,330</td>
			<td>4.23 x 106</td>
			<td>3,094</td>
			<td>5.16 x 106</td>
			<td>271</td>
			<td>3.39 x 106</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Comparação dos diferentes métodos de quantificação: Cultura artificial mista. Observe que U. maydis e S. cerevisiae não podem ser distinguidos usando um contador de partículas (*).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Cultura única</td>
			<td>Fotômetro</td>
			<td colspan="2">Citômetro</td>
			<td colspan="2">Contador de partículas</td>
			<td colspan="2">Câmara de contagem de microscopia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Organismo</td>
			<td>OD750/600</td>
			<td>contagem de células</td>
			<td>células/mL</td>
			<td>contagem de células</td>
			<td>células/mL</td>
			<td>contagem de células</td>
			<td>células/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.1</td>
			<td>38,936</td>
			<td>3.89 x 106</td>
			<td>1,928</td>
			<td>3.21 x 106</td>
			<td>403</td>
			<td>4.03 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.1</td>
			<td>36,927</td>
			<td>3.69 x 106</td>
			<td>2,465</td>
			<td>4.11 x 106</td>
			<td>307</td>
			<td>3.07 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Synechocystis sp. PCC 6803 mVênus</td>
			<td>0.1</td>
			<td>127,864</td>
			<td>1.28 x 107</td>
			<td>8,186</td>
			<td>1.36 x 107</td>
			<td>428</td>
			<td>1.07 x 107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Comparação dos diferentes métodos de quantificação: Calibração com culturas únicas/axênicas.

Montagem e quantificação de coculturas combinando levedura heterotrófica com cianobactérias fototróficas secretoras de açúcar

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being ...

Nossa pesquisa visa entender a rede microbiana em consórcios sintéticos envolvendo cianobactérias secretoras de sacarose e fungos heterotróficos. No passado, os microbiologistas geralmente estudavam culturas puras de microrganismos individuais. Na natureza, no entanto, os micróbios geralmente ocorrem em consórcios e, portanto, é essencial também entender a rede microbiana em culturas mistas.Um grande desafio é encontrar condições de crescimento adequadas, incluindo um meio que permita o crescimento de todos os membros do consórcio. Aqui, nos concentramos principalmente na otimização da maior produção e secreção de sacarose pelo membro fototrófico, que fornece a base para o crescimento dos membros heterotróficos. Para rastrear o crescimento em culturas axênicas, técnicas comuns como densidade óptica ou medições de retroespalhamento podem ser usadas.No entanto, essas técnicas não se aplicam a co-culturas onde precisamos da contagem de células das espécies individuais. Em nosso protocolo, aplicamos uma combinação de marcação fluorescente e contagem de células para distinguir entre diferentes parceiros de co-cultura. Além disso, pudemos mostrar que resultados semelhantes podem ser alcançados por diferentes métodos, desde métodos simples e de baixo custo até caros e de alto rendimento.Para começar, faça a pelota das células cianobacterianas depois de cultivar a cultura por três dias. Ressuspenda o pellet em 25 mililitros de meio estéril CoYBG-11. Centrifugue a amostra a 4.000g por 20 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, rejeitar o sobrenadante por decantação. Uma vez determinada a densidade óptica, adicione a quantidade calculada de CoYBG-11 em um frasco defletor de 250 mililitros em condições estéreis. Em seguida, adicionar os volumes calculados das suspensões de células cianobacterianas e heterotróficas para obter um volume final de cultura de 50 mililitros.Use 50 microlitros do estoque IPTG de um molar para uma cultura de 50 mililitros. Em seguida, coloque o frasco na fotoincubadora a aproximadamente 200 micromoles fótons por metro quadrado por segundo. Complemente o ambiente com 2% de dióxido de carbono a 30 graus Celsius, agitação orbital a 150 RPM e 75% de umidade.Para a amostragem, retirar o balão da incubadora e colher uma amostra de um mililitro da cultura em condições estéreis. Para se preparar para a quantificação microscópica, certifique-se de que a câmara de contagem e a lamínula estejam livres de poeira e células. Posicione a lamínula corretamente deslizando-a sobre as duas barras de suporte com um pouco de pressão, evitando quebras.Uma vez que a lamínula esteja posicionada corretamente, observe os anéis de Newton entre as duas superfícies de vidro, garantindo que a lamínula não escorregue. Agora misture bem a suspensão celular e aplique alguns microlitros na borda da câmara. Deixe a câmara encher completamente por força capilar.Em seguida, use uma objetiva apropriada de um microscópio óptico e concentre-se nas linhas de grade da câmara de contagem. Conte as células nos quadrados apropriados para o tamanho de célula fornecido. Para quantificação por contagem de partículas, ajuste a densidade óptica da amostra para 0,1.Em seguida, adicione 10 microlitros da amostra a 10 mililitros de tampão de medição isotônico. Feche a tampa do copo de amostra e misture a amostra suavemente, inclinando levemente o copo. Depois de colocar o copo de amostra no contador de partículas, insira um capilar com o tamanho de poro apropriado para as células utilizadas no copo de amostra e feche a porta da máquina.Inicie a medição e registre em um intervalo apropriado. Células com diferentes tamanhos de células podem ser discriminadas nesta fase. Para quantificação por citometria de fluxo de célula única, ajuste a densidade óptica das amostras para organizar adequadamente a medição por citometriaAplique a fórmula fornecida para garantir que a contagem de células permaneça dentro de uma faixa de 1.000 a 10.000 células por segundo a uma taxa de fluxo de 10 microlitros por minuto. Transfira 300 microlitros de cada suspensão de célula de amostra para um poço individual em uma placa de 96 poços. Em seguida, transfira a placa de 96 poços para a amostra automática do citômetro.Gráficos de pontos abertos e histogramas para os canais de fluorescência e dispersão relevantes para as amostras. Para determinar a concentração da célula, registre um volume de amostra definido usando a função de registro. Separe os sinais para organismos fototróficos e heterotróficos com base na autofluorescência vermelha do organismo fototrófico usando o histograma do canal APC-H.Em seguida, use o histograma do canal FITC-H exibindo apenas a população heterotrófica para identificar as células heterotróficas contendo proteína fluorescente verde. Use o histograma do canal PC5.5-H para distinguir entre células heterotróficas contendo proteína fluorescente vermelha e aquelas sem ela.

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Fonte: Jiang, H., Ho, M. Isolamento e caracterização do ficobilissomo intacto em cianobactérias. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demonstra o procedimento de cultivo de cianobactérias para obter biomassa por meio do cultivo de células sob iluminação contínua com suprimento de dióxido de carbono e condições ricas em nutrientes, seguido de colheita por centrifugação.

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Concebemos um aparelho de cultura contínua para uso com sistemas de optogenetic para iluminar culturas de micróbios e regularmente células de imagem no efluente com um microscópio invertido. A cultura, a amostragem, de imagem e análise de imagem são totalmente automatizados para que as respostas dinâmicas a iluminação pode ser medida ao longo de vários dias.

Design e Implementação de um Automated Illuminating, A cultura e sistema de amostragem para Aplicações Microbial optogenética

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo como i) montar um vetor auto-replicante usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate, ii) introduzir o vetor em um hospedeiro cianobacteriano por conjugação, e iii) caracterizar cepas transgênicas de cianobactérias usando um leitor de placa ou citometria de fluxo.

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Apresentamos um protocolo para identificação e quantitação das principais classes de metabólitos solúveis em água no levedura Saccharomyces cerevisiae. O método descrito é versátil, robusto e sensível. Permite a separação de isômeros estruturais e formas estereogômicas de metabólitos solúveis em água uns dos outros.

Metabolômica Quantitativa de Saccharomyces Cerevisiae Usando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem

O controle optogenético do metabolismo microbiano oferece controle dinâmico flexível sobre os processos de fermentação. O protocolo aqui mostra como configurar fermentações reguladas por luz azul para produção química e proteica em diferentes escalas volumosas.

Fermentações controladas por luz para produção de produtos químicos e proteicos microbianos

O protocolo atual detalha o isolamento de ficobilísomees de cianobactérias por centrifugação através de um gradiente de densidade de sacarose descontínua. As frações de ficobilismos intactos são confirmadas pelo espectro de emissão fluorescente de 77K e pela análise de SDS-PAGE. As frações ficobilínicas resultantes são adequadas para coloração negativa da TEM e análise de espectrometria de massa.

Isolamento e Caracterização de Ficobilisome intacto em cianobactérias

Neste estudo, o objetivo principal foi monitorar a captação celular e eventual exocitose de nanotubos de carbono (NTCs). Nessa perspectiva, propusemos aqui um método único usando citometria de fluxo de imagem multiespectral permitindo uma quantificação e localização de CNTs em um número estatisticamente relevante de células.

Localização e quantificação relativa de nanotubos de carbono em células com citometria de fluxo de imagem multiespectral

Um método para obtenção de nanofibras e nanoestruturas de complexos de proteínas de matriz extracelular simples ou múltiplos é descrito. Este método utiliza as interações proteína de superfície para criar materiais à base de proteínas free-standing com composição sintonizável e arquitetura para o uso em uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos e biotecnologia.

Nanofibras ECM proteínas e Nanoestruturas Engineered Usando Assembléia iniciou-Surface

Bicamadas lipídicas suportadas e partículas de membranas naturais são sistemas convenientes que podem aproximar as propriedades das membranas celulares e ser incorporadas em uma variedade de estratégias de análise. Aqui demonstramos um método para a preparação de compostos de microarrays de suporte revestidas de lípidos em bicamada-SiO 2 grânulos, vesículas de fosfolípidos ou partículas de membranas naturais.

Formação de biomembrana Microarrays com um método de montagem baseada em Rodo

Este manuscrito apresenta um método de moldagem por injeção para engenheiro microvasos que recapitulam propriedades fisiológicas de endotélio. O processo baseado em microfluídico cria redes vasculares 3D patente com condições tailorable, tais como fluxo, composição celular, geometria e gradientes bioquímicos. O processo de fabricação e exemplos de aplicações potenciais são descritos.

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

Aprenda a montar e quantificar coculturas de cianobactérias fototróficas secretoras de açúcar com leveduras heterotróficas. Este protocolo utiliza marcação fluorescente e citometria de fluxo para monitorar interações microbianas.

Montagem e quantificação de coculturas combinando levedura heterotrófica com cianobactérias fototróficas secretoras de açúcar

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