Montagem e quantificação de coculturas combinando levedura heterotrófica com cianobactérias fototróficas secretoras de açúcar

Nossa pesquisa visa entender a rede microbiana em consórcios sintéticos envolvendo cianobactérias secretoras de sacarose e fungos heterotróficos. No passado, os microbiologistas geralmente estudavam culturas puras de microrganismos individuais. Na natureza, no entanto, os micróbios geralmente ocorrem em consórcios e, portanto, é essencial também entender a rede microbiana em culturas mistas.

Um grande desafio é encontrar condições de crescimento adequadas, incluindo um meio que permita o crescimento de todos os membros do consórcio. Aqui, nos concentramos principalmente na otimização da maior produção e secreção de sacarose pelo membro fototrófico, que fornece a base para o crescimento dos membros heterotróficos. Para rastrear o crescimento em culturas axênicas, técnicas comuns como densidade óptica ou medições de retroespalhamento podem ser usadas.

No entanto, essas técnicas não se aplicam a co-culturas onde precisamos da contagem de células das espécies individuais. Em nosso protocolo, aplicamos uma combinação de marcação fluorescente e contagem de células para distinguir entre diferentes parceiros de co-cultura. Além disso, pudemos mostrar que resultados semelhantes podem ser alcançados por diferentes métodos, desde métodos simples e de baixo custo até caros e de alto rendimento.

Para começar, faça a pelota das células cianobacterianas depois de cultivar a cultura por três dias. Ressuspenda o pellet em 25 mililitros de meio estéril CoYBG-11. Centrifugue a amostra a 4.000g por 20 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, rejeitar o sobrenadante por decantação. Uma vez determinada a densidade óptica, adicione a quantidade calculada de CoYBG-11 em um frasco defletor de 250 mililitros em condições estéreis. Em seguida, adicionar os volumes calculados das suspensões de células cianobacterianas e heterotróficas para obter um volume final de cultura de 50 mililitros.

Use 50 microlitros do estoque IPTG de um molar para uma cultura de 50 mililitros. Em seguida, coloque o frasco na fotoincubadora a aproximadamente 200 micromoles fótons por metro quadrado por segundo. Complemente o ambiente com 2% de dióxido de carbono a 30 graus Celsius, agitação orbital a 150 RPM e 75% de umidade.

Para a amostragem, retirar o balão da incubadora e colher uma amostra de um mililitro da cultura em condições estéreis. Para se preparar para a quantificação microscópica, certifique-se de que a câmara de contagem e a lamínula estejam livres de poeira e células. Posicione a lamínula corretamente deslizando-a sobre as duas barras de suporte com um pouco de pressão, evitando quebras.

Uma vez que a lamínula esteja posicionada corretamente, observe os anéis de Newton entre as duas superfícies de vidro, garantindo que a lamínula não escorregue. Agora misture bem a suspensão celular e aplique alguns microlitros na borda da câmara. Deixe a câmara encher completamente por força capilar.

Em seguida, use uma objetiva apropriada de um microscópio óptico e concentre-se nas linhas de grade da câmara de contagem. Conte as células nos quadrados apropriados para o tamanho de célula fornecido. Para quantificação por contagem de partículas, ajuste a densidade óptica da amostra para 0,1.

Em seguida, adicione 10 microlitros da amostra a 10 mililitros de tampão de medição isotônico. Feche a tampa do copo de amostra e misture a amostra suavemente, inclinando levemente o copo. Depois de colocar o copo de amostra no contador de partículas, insira um capilar com o tamanho de poro apropriado para as células utilizadas no copo de amostra e feche a porta da máquina.

Inicie a medição e registre em um intervalo apropriado. Células com diferentes tamanhos de células podem ser discriminadas nesta fase. Para quantificação por citometria de fluxo de célula única, ajuste a densidade óptica das amostras para organizar adequadamente a medição por citometria

Aplique a fórmula fornecida para garantir que a contagem de células permaneça dentro de uma faixa de 1.000 a 10.000 células por segundo a uma taxa de fluxo de 10 microlitros por minuto. Transfira 300 microlitros de cada suspensão de célula de amostra para um poço individual em uma placa de 96 poços. Em seguida, transfira a placa de 96 poços para a amostra automática do citômetro.

Gráficos de pontos abertos e histogramas para os canais de fluorescência e dispersão relevantes para as amostras. Para determinar a concentração da célula, registre um volume de amostra definido usando a função de registro. Separe os sinais para organismos fototróficos e heterotróficos com base na autofluorescência vermelha do organismo fototrófico usando o histograma do canal APC-H.

Em seguida, use o histograma do canal FITC-H exibindo apenas a população heterotrófica para identificar as células heterotróficas contendo proteína fluorescente verde. Use o histograma do canal PC5.5-H para distinguir entre células heterotróficas contendo proteína fluorescente vermelha e aquelas sem ela.