Projetos microfluídicos de laminação de tereftalato de polietileno de baixo custo para imagens multiplexadas de peixe-zebra

Nosso laboratório está interessado nos mecanismos que regulam a migração e ativação de neutrófilos na lesão tecidual, infecção e câncer, com foco nas características e no significado biológico da sinalização intracelular de cálcio na cicatrização de feridas.

[Cheio de conchas] Os métodos convencionais de design microfluídico são caros e complexos, retardando o progresso em campos como a biologia do desenvolvimento, que exigem ambientes diversos. Vimos uma abordagem mais rápida e eficiente para desenvolver e testar projetos individuais. Portanto, esse método de construção oferece maior flexibilidade de design e resolução espacial do que protocolos igualmente simples, permitindo uma iteração mais rápida e fácil do que os dispositivos PDMS padrão. Usando-o, desenvolvemos o RADISH para obter imagens simultâneas de vários embriões de peixe-zebra em um único campo de visão.

Com este dispositivo de aprisionamento que suporta imagens de vida de alta resolução, estamos prontos para entender como diversos sinais, incluindo estímulos químicos e mecânicos, se integram para coordenar a inflamação e a cicatrização de feridas.

[Instrutor] Para começar, projete o padrão para o dispositivo usando o software de sua escolha. Dependendo da idade e do tamanho do embrião, ajuste a largura do canal e o tamanho da câmara central de imagem para obter o melhor ajuste. Salve cada camada como um arquivo de imagem individual com dimensões idênticas. Agora, inicialize a máquina de corte de acordo com as instruções do fabricante. Na área de trabalho de design, selecione os designs recém-carregados. Agrupe padrões destinados à mesma espessura de chapa de PET no mesmo corte. Confirme o número e o tipo de padrões no corte e selecione o material cortado. Em seguida, prenda a folha de PET à esteira de corte na espessura desejada, pressionando firmemente para remover as bolhas de ar e carregue a esteira na máquina de corte. Siga as instruções na tela para solicitar que a máquina de corte inicie o corte. Em seguida, remova os cortes acabados da esteira de corte. Agora, alinhe as camadas em um vidro de cobertura, sem ajuda ou com marcas de registro pré-cortadas. Prenda as camadas com fita adesiva para evitar deslocamentos durante a laminação. Dependendo do tamanho do dispositivo e da capacidade do laminador, monte pequenos designs em um suporte maior com mais fita adesiva para evitar emperrar ou entupir a alimentação do laminador. Em seguida, ligue o laminador e o laminado de acordo com as instruções do fabricante. Remova a fita do escritório antes de alinhar a próxima camada. Usando cola de cianoacrilato, prenda o dispositivo a um prato de 35 milímetros perfurado com um orifício de três quartos de polegada. Em seguida, impermeabilize o laminado revestindo completamente as bordas externas do dispositivo com cola de cianoacrilato. Use cola suficiente para cobrir totalmente as bordas externas sem lacunas. Para começar, crie embriões de peixe-zebra até pelo menos dois dias após a fertilização em E3 ou outro meio de criação de embriões adequado. Em seguida, anestesiar os embriões usando 164 miligramas por litro de MS-222. Em seguida, encha o prato de retenção contendo o dispositivo montado com cinco mililitros de E3 ou outro meio embrionário contendo 164 miligramas por litro de MS-222. Usando uma pipeta de transferência, deposite um embrião anestesiado em cada câmara de retenção do dispositivo. Em seguida, usando uma alça de cabelo, oriente os embriões com a cauda de cada embrião projetando-se para a câmara de imagem central e a gema imobilizada no canal em forma de cunha. Se desejar, prenda a cabeça do embrião adicionando 1,5% de agarose de baixo derretimento na câmara de retenção usando uma micropipeta. Por fim, mova o dispositivo com embriões para o sistema de imagem de sua escolha para iniciar a imagem, selecione o sistema de imagem e o objetivo apropriados para o experimento. Ajuste o foco da amostra e os parâmetros de imagem para obter a relação sinal-ruído e a velocidade de aquisição ideais. Para enrolar o embrião por meio de transecção manual, aplique pressão com uma lâmina de bisturi no tecido da barbatana caudal na ponta da notocorda sob um microscópio estéreo. Em seguida, retorne o dispositivo ao palco. Para enrolar o embrião por meio de estimulação a laser, defina uma região de interesse perto da borda da dobra da barbatana caudal e estimule de acordo com a potência do laser disponível. Visualize o embrião à temperatura ambiente usando o canal GFP e RFP com um intervalo de quadros de um minuto por um total de uma hora. Se necessário, libere os embriões após a imagem, aspirando suavemente perto da cabeça usando uma pipeta de transferência ou girando o prato.