Isolamento e registro de patch-clamp de células inteiras da microglia hipocampal de camundongos adultos

Nossa pesquisa se concentra no isolamento agudo da microglia para gravações de células inteiras, incluindo correntes de potássio para entender a atividade do canal iônico. O protocolo também é adaptável para isolar a microglia para várias regiões do cérebro, fornecendo informações sobre zero em diferentes condições neurológicas.

Os desenvolvimentos mais recentes em nosso campo de pesquisa incluem o uso da digestão tradicional da enzima pancreatite, combinada com a purificação da microglia por meio da classificação de células ativas de fluorescência. Esses avanços aumentaram a precisão e a eficiência do isolamento de populações específicas de micróglias para estudos posteriores.

Nosso protocolo investiga as propriedades eletrofisiológicas da microglia diretamente do hipocampo de camundongos adultos, em vez de depender de CS cultivado primário. Essa abordagem permite uma análise mais precisa das funções da microglia em seu ambiente nativo.

Nossos resultados abriram caminho para novas questões científicas sobre a propriedade bioquímica e funcional da microglia em condições fisiológicas e patológicas, oferecendo aos pesquisadores orientações valiosas para explorar ainda mais esses aspectos.

[Apresentador] Para começar, coloque o animal anestesiado em decúbito dorsal em uma mesa de dissecação e prenda seus membros. Exponha o tórax e perfunda o coração com PBS estéril e gelado para remover as células sanguíneas circulantes intravasculares. Em seguida, segure a cabeça e corte a pele ao longo da linha média do cérebro com uma tesoura para expor o crânio. Em seguida, corte a parte posterior do crânio bilateralmente e entre as órbitas oculares com uma tesoura pequena. Corte o crânio ao longo da sutura sagital e remova o crânio com uma pinça. Depois disso, extraia o tecido cerebral rapidamente. Agora, coloque o tecido cerebral em placas de cultura de 10 centímetros contendo PBS gelado. Dissecar o córtex cerebral bilateralmente com uma pinça. Isole o tecido do hipocampo e corte-o em pedaços menores. Transfira as peças para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, ressuspenda os pequenos pedaços de tecido do hipocampo em dois mililitros de solução salina balanceada de Hanks gelada ou HBSS. E centrifugue a 300 G por três minutos em temperatura ambiente. Depois de descartar o sobrenadante, adicione 1.950 microlitros de mistura enzimática um ao tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo os pedaços de tecido do hipocampo. Agite o tubo da centrífuga continuamente em banho-maria a 37 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione 30 microlitros de mistura enzimática recém-preparada dois ao tubo de centrífuga de 15 mililitros. Pipete os fragmentos de tecido para cima e para baixo 20 vezes com uma ponta de pipeta de um mililitro e incube em banho-maria por cinco minutos com agitação contínua a 37 graus Celsius. Depois de remover o tubo da centrífuga, pipete a suspensão para cima e para baixo várias vezes com uma pipeta de um mililitro até que não restem pedaços grandes de tecido. Em seguida, filtre a suspensão celular através de um filtro de triagem de células de 70 micrômetros e colete o filtrado em um tubo de centrífuga limpo de 50 mililitros. Transferir o filtrado para um novo tubo de centrifugação de 15 mililitros e centrifugar a 300 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o sobrenadante com uma pipeta de um mililitro. Agora, pipete a suspensão da célula para cima e para baixo 20 vezes com 15 mililitros de HBSS para lavá-la e centrifugue a 300 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão de classificação de células ativado magneticamente. Para começar, transfira um mililitro da suspensão unicelular preparada para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros e centrifugue a 300 G por três minutos a quatro graus Celsius. Uma vez removido o sobrenadante, ressuspenda o pellet de célula única em 90 microlitros de classificação de células ativadas por magnetismo ou tampão máximo. Adicione 10 microlitros de microesferas CD11b ou c e incube a suspensão a quatro graus Celsius por 15 minutos em um agitador horizontal. Em seguida, adicione um mililitro de tampão máximo diretamente ao tubo para lavar a suspensão de célula única. Após a centrifugação, ressuspenda o pellet celular em 500 microlitros de tampão máximo. Com uma pipeta de um mililitro, transferir a suspensão de células ressuspensas para a coluna de classificação no campo magnético. Enquanto permanecer no campo magnético, lave a coluna três vezes com 500 microlitros de tampão máximo. Em seguida, remova a coluna de classificação do campo magnético. Adicione um mililitro de buffer máximo à coluna e empurre-o lentamente com o pistão. Colete o fluxo. Agora, semeie as células selecionadas em uma placa de 24 poços contendo uma lamínula revestida com poli-L-lisina. Adicione 200 microlitros de meio de cultura e incube por 20 minutos em uma incubadora de 37 graus Celsius com 95% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono e 60 a 80% de umidade. Para começar, pegue a microglia cultivada isolada do tecido cerebral de camundongos. Localize a microglia esférica sob um microscópio aquático usando a objetiva de 40x. Em seguida, encha o eletrodo com solução intracelular e conecte-o ao estágio da cabeça do amplificador da configuração de eletrofisiologia. Aplique pressão positiva. Mude para a objetiva 4x e localize o eletrodo. Em seguida, abaixe o eletrodo na solução do banho. Defina o amplificador para voltage clamp modo para realizar o teste de membrana no modo de banho. Depois disso, volte para a objetiva 40x e mova a ponta do eletrodo para mais perto da microglia. Em seguida, aplique uma pequena pressão negativa para segurar a célula. Quando a resistência atingir 100 megaohms, mude do modo banho para o modo de remendo no teste de membrana. Quando a resistência atingir 300 megaohms, libere a pressão negativa. Quando a resistência indica a formação de uma vedação de giga-ohm entre o eletrodo e a membrana microglial. Mude do modo de patch para o modo de célula no teste de membrana. Em seguida, aplique uma pequena quantidade de sucção e inicie um choque elétrico para romper a membrana. Depois disso, mude para o modo de grampo de tensão, abra o programa de gravação e registre as correntes de potássio por 200 milissegundos.