Name: Estabelecimento de um modelo de camundongo de olho seco por deficiência aquosa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo de camundongo de olho seco por deficiência aquosa através da excisão das glândulas lacrimais extraorbitária e infraorbitária. Este método simplificado replica estados patológicos semelhantes à síndrome de Sjögren.

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Este estudo foi apoiado em parte pelos Projetos Provinciais de Ciência e Tecnologia de Guizhou (QKHJC-ZK[2024]ZD043), Fundo Científico da Província de Fujian para Jovens Acadêmicos Distintos (2023J06053 [para S.O.]), a Fundação de Ciências Naturais da China (No.82101084 [para S.O.] e o Conselho de Bolsas de Estudo da China (CSC, 202306310049 [para Y.W.]).

Camundongos C57BL/6 (C57) fêmeas, com idades entre 7 e 8 semanas, foram usados neste estudo. Todos os procedimentos seguiram as diretrizes da ARVO para o uso de animais em pesquisas oftalmológicas e visuais e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Médica de Guizhou (Aprovação nº 2305193). Não foram observadas lesões na superfície ocular ao exame com lâmpada de fenda.
1. Etapas pré-operatórias
<ol>
	<li>Esterilize os instrumentos usando um esterilizador rápido: porta-agulhas, agulha de sutura 5-0 com linha, tesoura cirúrgica oftálmica e pinça.</li>
	<li>Anestesiar o camundongo com Avertin a 1,25% por injeção intraperitoneal na dose de 0,3 mL / 100 g.</li>
	<li>Após a conclusão da anestesia, coloque o mouse em decúbito lateral e remova os pelos da área cirúrgica. Administrar meloxicam 20 mg/kg por via intraperitoneal 30 min no pré-operatório, com doses subsequentes a cada 8 h no pós-operatório.</li>
	<li>Desinfetar o campo cirúrgico com três aplicações alternadas de iodóforo e álcool.</li>
	<li>Estabelecimento do modelo de olho seco
	<ol>
		<li>Coloque o mouse na posição de decúbito lateral. Exponha a área cirúrgica sob um microscópio cirúrgico.</li>
		<li>Confirme a profundidade da anestesia por meio de uma pinça no dedo do pé antes de fazer a incisão. Prenda a pele do lado direito do rosto do camundongo com uma pinça dentada e faça uma incisão no ponto médio da linha que cruza a aurícula externa e a linha mandibular até o canto interno do olho. Exponha o tecido muscular; remova o ELG localizado no músculo com cuidado.</li>
		<li>Estenda a incisão na pele até o canto interno do olho, separe o músculo sem rodeios e localize a glândula vermelha clara abaixo do músculo. Retire e remova o ILG.</li>
		<li>Suturar a incisão com fio de náilon 5-0 pré-esterilizado com agulha acoplada com auxílio de porta-agulha, tesoura cirúrgica oftálmica e pinça.</li>
		<li>Aplique pomada de ofloxacina no final da operação para prevenir a infecção.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Após remover o ELG e ILG unilaterais, coloque os camundongos em um ambiente com um ciclo rítmico de 12:12 h claro-escuro com livre acesso a comida e água. Isso cria um modelo de olho seco unilateral, enquanto o olho contralateral com glândulas lacrimais internas e externas serve como o grupo de controle normal.</li>
</ol>
2. Medição da produção de lágrimas
<ol>
	<li>Anestesiar o camundongo com 1,25% de Avertin por via intraperitoneal na dose de 0,3 mL / 100 g.</li>
	<li>Realize a medição da secreção lacrimal usando fios vermelhos de fenol bem embalados e esterilizados comercialmente sob anestesia geral.</li>
	<li>Puxe suavemente a pálpebra inferior para baixo a ser medida. Posicione a parte superior do fio vermelho de fenol nos terços interno e externo da pálpebra inferior, iniciando o cronômetro imediatamente.</li>
	<li>Realize o teste em um olho de cada vez por um período de 15 s.</li>
	<li>Após o tempo previsto, retraia cuidadosamente a pálpebra inferior e remova o fio vermelho de fenol para baixo com cuidado.</li>
	<li>Utilize a escala fornecida no saco externo do fio vermelho de fenol para medir do topo do fio até a totalidade da porção vermelha.</li>
	<li>Empregue um cronômetro eletrônico para registrar com precisão a duração do teste.</li>
</ol>
3. Preparação de fatias de tecido congeladas
<ol>
	<li>Realize luxação cervical rápida nos camundongos após asfixia com CO2.</li>
	<li>Utilize tesouras e pinças para extrair cuidadosamente os globos oculares.</li>
	<li>Incorpore os globos oculares em um composto de temperatura de corte ideal e utilize um micrótomo congelado para obter fatias de tecido congelante de 5-7 μm de espessura28.</li>
	<li>Armazene todas as lâminas em uma caixa de amostras em temperatura ambiente por aproximadamente 30 min. Em seguida, transfira-os para um freezer de temperatura ultrabaixa a -80 °C.</li>
</ol>
4. Coloração de hematoxilina e eosina (H&E)
<ol>
	<li>Remova as fatias de tecido congeladas do freezer de temperatura ultrabaixa, coloque-as em uma caixa de lenços de papel e seque-as em uma capela de exaustão.</li>
	<li>Lave as fatias com 1x PBS, cubra por 5 min e remova o PBS. Cubra a amostra com paraformaldeído a 4%, garantindo que a tampa esteja fechada para evitar a evaporação. Após 15 min em temperatura ambiente, enxágue as amostras por 3 x 5 min em 1x PBS.</li>
	<li>Coloque a amostra em um rack e mergulhe-a em corante de hematoxilina a 0,5% por 5 min.</li>
	<li>Enxágue a amostra em água da torneira por 5 min para remover o excesso de corante. Em seguida, mergulhe-o em álcool de ácido clorídrico a 0,1% por 1-2 s para facilitar a diferenciação.</li>
	<li>Coloque o porta-amostras em água da torneira por 15 min para remover a coloração inespecífica.</li>
	<li>Drene o excesso de água e mergulhe a amostra em solução de coloração de eosina a 0,05% por 3 min.</li>
	<li>Lave a amostra em água da torneira e mergulhe-a sequencialmente em álcool a 75%, 80%, 95% e duas rodadas de álcool a 100% por 2 min cada.</li>
	<li>Mergulhe o suporte da amostra em duas rodadas de xileno por 2 min cada.</li>
	<li>Coloque o suporte em uma hotte para secar e monte a amostra com meio de montagem, evitando danos e bolhas.</li>
	<li>Armazene os espécimes corados em uma caixa em temperatura ambiente e fotografe-os usando um sistema de biomicrografia.</li>
</ol>
5. Coloração por imunofluorescência
<ol>
	<li>Retire a amostra do freezer, coloque-a na caixa e seque-a no capô.</li>
	<li>Lave a amostra com 1x PBS, cubra por 5 min e aspire o excesso de líquido. Cubra a amostra com paraformaldeído a 4%, adicione água à caixa úmida imuno-histoquímica e feche a tampa para evitar a evaporação. Deixe descansar em temperatura ambiente por 15 min; em seguida, enxágue a amostra 3 x 5 min em 1x PBS. 
	NOTA: Manuseie a amostra com cuidado durante este processo.</li>
	<li>Remova o excesso de PBS da superfície da amostra e limpe suavemente o líquido residual ao redor da seção de tecido com papel de filtro. Cubra a superfície da amostra com solução de permeabilização celular (0,2% Triton X-100) e incube em temperatura ambiente por 20 min para permeabilizar a membrana.</li>
	<li>Remova a solução de permeabilização e enxágue a amostra 3 x 5 min com 1x PBS.</li>
	<li>Despeje o PBS da superfície da amostra e limpe suavemente o líquido residual ao redor da seção de tecido com papel de filtro. Cubra a amostra com solução de bloqueio pré-aquecida (2% BSA). Feche a tampa para evitar a evaporação e incube em temperatura ambiente por 1 h.</li>
	<li>Durante o processo de bloqueio, selecionar o anticorpo apropriado de acordo com as necessidades experimentais, preparar o anticorpo primário com diluente de imunofluorescência (1% BSA) de acordo com a proporção recomendada e centrifugar o anticorpo primário preparado em uma centrífuga a 4 °C a 2.000 × g, 10 min. 
	NOTA: Todos os itens acima são operados no gelo ou em baixas temperaturas. Recomenda-se o uso de cerca de 120 μL de anticorpo primário por amostra.</li>
	<li>Descarte ou despeje o anticorpo primário. Lave a amostra 3 x 10 min com 1x tampão PBS. Depois de despejar o PBS, enxágue a amostra com 1x PBS fresco. Certifique-se de que o PBS cubra a lâmina durante o primeiro enxágue.</li>
	<li>Enquanto o anticorpo primário está sendo enxaguado, selecione o anticorpo secundário adequado com base em sua categoria. Dilua-o com diluente BSA a 1% na proporção de 1:300. Centrifugar o anticorpo preparado numa centrifugadora a 4 °C, 2 000 × g durante 10 min. Realize todo o processo no gelo ou em baixa temperatura no escuro.</li>
	<li>Enxágue a lâmina com PBS, limpe suavemente o líquido ao redor da amostra com papel de filtro, use uma bomba de sucção para absorver qualquer líquido restante e adicione rapidamente o anticorpo secundário preparado à amostra. Cubra e incube em temperatura ambiente por 1 h. Certifique-se de que todos os processos sejam conduzidos no escuro.</li>
	<li>Descarte o anticorpo secundário, enxágue com 1x tampão PBS e lave 3 x 10 min. Certifique-se de que o PBS cubra completamente a lâmina. Manuseie a amostra com cuidado para evitar enxaguá-la.</li>
	<li>Despeje o 1x PBS, limpe o excesso de líquido com papel de filtro, use uma bomba de sucção para remover qualquer líquido restante e monte a amostra com um meio de montagem contendo DAPI. Coloque a tampa na placa deslizante e guarde-a em um freezer a 4° C, protegido da luz com papel alumínio. Tome cuidado para evitar danificar a amostra e criar bolhas de ar.</li>
	<li>Fotografe a amostra corada usando um sistema de microscópio de fluorescência confocal a laser ou vertical. Certifique-se de que a imagem seja feita dentro de uma semana para evitar a extinção da fluorescência.</li>
</ol>
6. Extração de mRNA da córnea
<ol>
	<li>Realize luxação cervical rápida nos camundongos após asfixia com CO2. Em seguida, utilize tesouras e pinças para extrair cuidadosamente os globos oculares, lave-os 3x em 1x PBS e coloque o globo ocular em uma placa de Petri contendo 1x PBS.</li>
	<li>Sob o microscópio, utilize tesouras e pinças para cortar o globo ocular do pólo posterior do globo ocular para separar a lente. Limpe o excesso de esclera e íris, mas deixe a esclera branca de 0,5 mm e toda a córnea. Extraia o mRNA dos globos oculares do camundongo usando um kit de extração de RNA de acordo com as instruções.</li>
</ol>
7. PCR de transcrição reversa
<ol>
	<li>Antes de realizar a transcrição reversa, determine a concentração de RNA com um espectrofotômetro UV.</li>
	<li>Tome 1 mg de RNA com base na concentração de RNA medida. Execute a reação de transcrição reversa usando um kit de transcrição reversa.</li>
	<li>Depois de adicionar os componentes de reação, adicione a mistura a um tubo de centrífuga de 200 μL, misture com agitação suave, centrifugue em baixa velocidade para evitar bolhas de ar e coloque-o imediatamente em um termociclador normal para reação.</li>
	<li>Analise o cDNA do processo de transcrição reversa diretamente por PCR em tempo real ou armazene-o em um freezer a -20 °C.</li>
</ol>
8. Reações de PCR quantitativas em tempo real (qRT-PCR)
<ol>
	<li>Configure um sistema de reação de 10 μL de acordo com as instruções fornecidas com o kit de PCR em tempo real29: 3,6 μL de água tratada com DEPC, primer de detecção 0,2 μM, primer anti-sentido 0,2 μM, 1 μL de cDNA, 5 μL de Mix. Consulte a Tabela 1 para obter detalhes sobre os primers.</li>
	<li>Dependendo do agrupamento de experimentos, adicione o sistema de reação a uma placa de 96 poços ou tubo de oito tiras dedicado ao qRT-PCR. Uma vez que o sistema qRT-PCR esteja configurado, certifique-se de que a mistura esteja bem misturada e use uma centrífuga de mesa para uma breve centrifugação para sacudir o líquido da parede do tubo. Sempre verifique se há bolhas de ar no tubo antes de qRT-PCR.</li>
	<li>Realizar a reação em triplicado e calcular o Ct médio (limiar do ciclo).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Estabelecemos com sucesso um modelo de camundongo de doença do olho seco por deficiência aquosa excisando cirurgicamente o ELG e o ILG, com o objetivo de investigar alterações na superfície ocular sob condições de doença do olho seco por deficiência aquosa. Documentamos meticulosamente as alterações morfológicas e fisiológicas observadas neste modelo de olho seco em camundongos resultantes da dupla excisão do ELG e ILG. Duas semanas após a modelagem, observamos e amostramos o modelo de olho seco de camundongo estabelecido. 
Considerando que fatores como temperatura, velocidade do fluxo de ar, umidade relativa, sazonalidade e poluentes podem influenciar as taxas de evaporação do filme lacrimal e exacerbar ou aliviar os sintomas da doença do olho seco, mantivemos meticulosamente o ambiente do camundongo antes e depois do tratamento. Garantimos um ciclo rítmico de 12:12 h claro-escuro para os camundongos, fornecemos acesso gratuito a comida e água e minimizamos possíveis fatores de confusão no estudo. Antes da cirurgia, foi administrada anestesia adequada para garantir que o camundongo permanecesse imóvel durante todo o procedimento, reduzindo assim o estresse e os efeitos fisiológicos. Além disso, mantivemos os instrumentos cirúrgicos em condições limpas e estéreis para evitar infecções. Durante o procedimento, foi dada especial atenção à posição anatômica do ELG e ILG do camundongo, dada sua localização orbital profunda. Técnicas cirúrgicas delicadas foram empregadas para identificar e evitar vasos sanguíneos e nervos circundantes, minimizando assim danos desnecessários ao camundongo. O tamanho, a forma e a localização da incisão cirúrgica foram cuidadosamente considerados, pois impactaram significativamente os resultados cirúrgicos. Nosso princípio principal era minimizar o trauma no camundongo durante a cirurgia para evitar danos à pele e às membranas mucosas, o que poderia facilitar a invasão bacteriana e induzir o estresse. Além disso, a redução do trauma facilitou a recuperação pós-operatória no camundongo. Detalhes práticos, como manuseio suave do tecido durante o corte e sutura, foram observados para evitar o alongamento excessivo ou rasgo do tecido. A recuperação pós-operatória do camundongo foi monitorada de perto e quaisquer complicações potenciais foram prontamente tratadas.
Em comparação com a excisão do ELG isoladamente, a excisão do ELG e do ILG foi mais desafiadora e invasiva devido à localização orbital profunda do ILG, necessitando de procedimentos cirúrgicos extremamente delicados. No entanto, a observação pós-operatória não revelou efeitos colaterais significativos, como sangramento, paralisia facial ou disfunção palpebral. No futuro, pretendemos explorar ainda mais o potencial de aplicação deste modelo e nos esforçar para otimizar as técnicas cirúrgicas para reduzir a invasividade e a dor em camundongos.
No entanto, ao realizar a cirurgia para remover ELG e ILG de camundongos, a cirurgia é mais invasiva porque ambas as glândulas devem ser removidas ao mesmo tempo. Essa agressividade pode resultar em respostas significativas de trauma e estresse em camundongos, bem como um maior risco de infecção durante e após a cirurgia. Além disso, o ILG está localizado profundamente na órbita e os vasos sanguíneos circundantes são densos, o que aumenta o risco de sangramento intraoperatório. Dada a complexidade da cirurgia, o período de recuperação dos camundongos provavelmente será relativamente longo. Embora o modelo possa simular a síndrome do olho seco deficiente em água, se sua aplicabilidade é ampla o suficiente para cobrir todos os tipos de estudos de olho seco ainda precisa de validação adicional.
Portanto, os seguintes pontos devem ser atendidos durante o procedimento. Todos os instrumentos devem ser esterilizados antes da operação. O colírio antibiótico deve ser aplicado no dia anterior e no dia da cirurgia para reduzir o risco de infecção. A anestesia tópica é administrada com medicamentos analgésicos apropriados, como lidocaína, após a cirurgia, para reduzir a resposta ao estresse e a dor em camundongos. Cuidados pós-operatórios mais detalhados devem ser fornecidos, incluindo check-ups regulares, tratamento imediato de complicações e fornecimento de alimentos nutritivos e um ambiente limpo. Por meio de estudos comparativos com outros modelos de síndrome do olho seco, verifica-se a universalidade e aplicabilidade do modelo, e garante-se sua confiabilidade em diferentes estudos.
Este método oferece várias vantagens em relação aos modelos tradicionais de olho seco, como a injeção sistêmica de escopolamina, que pode induzir múltiplos efeitos sistêmicos. Além disso, os efeitos da injeção local são menos duráveis e é um desafio para os animais transgênicos replicar totalmente o desenvolvimento da lesão do olho seco em doenças como a síndrome de Sjögren. Muitos modelos experimentais de doença do olho seco relatados anteriormente exibem desvantagens, como sintomas instáveis, requisitos frequentes de tratamento, uso de substâncias tóxicas legalmente regulamentadas e/ou necessitam de ambientes especiais de reprodução22. Portanto, nos esforçamos para construir um modelo de olho seco que espelhe com mais precisão a redução da secreção de água, eliminando as glândulas secretoras. No entanto, a excisão convencional de modelos de glândulas lacrimais e harderianas extraorbitais não conseguiu atingir os baixos níveis de secreção lacrimal que prevíamos. Para resolver isso, empregamos um modelo de ressecção unilateral desenvolvido por Shinomiya22 para remover o ELG e o ILG de camundongos, usando o lado não afetado como controle. Em comparação com o modelo animal tradicional envolvendo a ressecção da glândula lacrimal extraorbital e da glândula de Harder, essa abordagem resultou em redução da secreção lacrimal, um procedimento relativamente simples e resultados consistentes.
Além disso, entre os vários modelos animais para olho seco, o modelo de coelho é considerado relativamente bem estabelecido. Os coelhos são particularmente adequados para exames oftalmológicos devido ao seu maior tamanho ocular, que oferece melhor acesso à superfície ocular32,33. Em modelos de coelhos, os métodos existentes incluem o uso de drogas tóxicas epiteliais, atropina, ressecção da glândula lacrimal e parassimpatectomia. Essas técnicas simulam efetivamente as condições de olho seco. No entanto, anatomicamente, as glândulas lacrimais do coelho estão amplamente distribuídas pela pálpebra, pálpebra anterior, órbita superior e regiões suborbital e pós-orbital. Coelhos adultos têm quatro ou cinco estruturas glandulares distintas na frente de suas órbitas, incluindo o lobo palpebral superior, o lobo orbital superior e as glândulas infraorbitais maiores, bem como a glândula de Harderiana34. Portanto, a remoção incompleta das glândulas lacrimais durante a ressecção pode resultar em um modelo de olho seco insatisfatório. Por outro lado, a remoção total de todas as glândulas secretoras causaria trauma significativo, potencialmente comprometendo a eficácia do modelo. Além disso, os estudos existentes muitas vezes não abordam especificamente a criação de modelos de coelhos para olho seco deficiente em água secundário a distúrbios cicatriciais da superfície ocular (por exemplo, síndrome de Stevens-Johnson, penfigóide da membrana mucosa). Em contraste, nosso modelo de camundongo imita de perto doenças graves do olho seco, como a síndrome de Sjögren e a síndrome de Stevens-Johnson. Ao remover apenas as glândulas lacrimais intraorbitais e extraorbitais, nosso modelo induz com sucesso o olho seco deficiente em água grave, minimizando os danos ao animal e simplificando o procedimento cirúrgico.
No geral, o modelo aqui descrito oferece vantagens em termos de manipulação e propriedades funcionais, tornando-o mais conveniente do que outros modelos de camundongos de olho seco, como aqueles com excisão ELG isolada. Nosso modelo induz prontamente deficiência aquosa grave, resultando em lesões graves de olho seco na superfície ocular, o que pode facilitar o desenvolvimento de novas terapêuticas. Em resumo, o modelo de excisão ELG mais ILG demonstra superioridade sobre os modelos animais existentes em termos de conveniência e estabilidade.

O olho seco tornou-se a doença da superfície ocular mais comum em todo o mundo, com uma estimativa de 5% a 50% da população sofrendo da doença1. A secura ocular e o desconforto causados pelo olho seco, se persistentes, podem levar a distúrbios visuais e filmes lacrimais instáveis, levando ainda mais a danos na superfície ocular2. Alguns pacientes com olho seco podem até sofrer de dor crônica2.
De acordo com o Consenso de Olho Seco TFOS DEWS II de 2017, o olho seco é uma condição complexa que envolve vários fatores e é caracterizada pela interrupção do equilíbrio natural do filme lacrimal. Essa condição é acompanhada por uma série de sintomas oculares, instabilidade do filme lacrimal, aumento da osmolaridade das lágrimas, inflamação e danos à superfície ocular e dor neuropática, que são cruciais para entender a progressão da doença3. Nesse ciclo de feedback, o olho seco pode causar danos às células epiteliais da córnea, diminuir a espessura estromal da córnea e a densidade das células endoteliais, desencadear a ativação e agregação de células imunes na superfície da córnea, reduzir a secreção de mucina pelas células caliciformes e causar disfunção imunológica na glândula lacrimal, exacerbando ainda mais a condição4,5,6,7,8,9,10. O consenso delineia três formas primárias de síndrome do olho seco: olho seco por deficiência aquosa, olho seco evaporativo e uma combinação de ambos, conhecida como olho seco misto3. O olho seco por deficiência aquosa está associado a alterações estruturais e funcionais nas glândulas lacrimais11. Essas alterações incluem atrofia acinar, oclusão ductal que bloqueia o fluxo de lágrimas, infiltração de linfócitos indicando uma resposta imune e redução da secreção de proteínas essenciais para manter a saúde e a estabilidade do filme lacrimal12,13.
A glândula lacrimal é uma glândula tubular exócrina responsável pela produção de componentes aquáticos no filme lacrimal13,14, incluindo água, eletrólitos e proteínas, e contribui para a manutenção da estabilidade do microambiente da superfície ocular15,16. A saúde e a clareza visual do olho dependem da presença do filme lacrimal, que forma uma camada óptica crítica na superfície da córnea, garantindo uma lubrificação suave da córnea e da conjuntiva17. O filme lacrimal promove a atividade metabólica das células da superfície ocular e atua como um limpador, removendo efetivamente as impurezas e potenciais irritantes da superfície ocular, mantendo assim o equilíbrio fisiológico e o conforto do olho18,19.
Em roedores, como ratos e camundongos, as glândulas lacrimais consistem em dois lobos: os lobos orbitais interno e externo. O lobo orbital externo está localizado abaixo da orelha e sua parte funcional está conectada ao olho por um ducto estendido. Este ducto se envolve com o lobo da glândula lacrimal na órbita antes de atingir o olho e está envolvido na produção de lágrimas20. O lobo orbital interno, também conhecido como glândula lacrimal intraorbital, está localizado sob a conjuntiva bulbar do canto externo. O ILG é menor que o ELG. A função prejudicada da glândula lacrimal pode levar à deficiência aquosa do olho seco, que, se não tratada, pode progredir para úlceras de córnea e perda de visão21.
Modelos animais de olho seco por deficiência aquosa podem ser categorizados em três métodos de intervenção: modelos de indução cirúrgica, modelos induzidos por drogas e modelos transgênicos. O modelo de indução cirúrgica envolve a remoção do ELG. No entanto, esse modelo não é estável devido à presença de ILG22. A injeção sistêmica do bloqueador do receptor colinérgico escopolamina é comum no modelo induzido por drogas23. Aplicações tópicas de atropina24 e cloreto de benzalcônio25 também podem reduzir a mucina e a secreção lacrimal. A concanavalina A pode ser injetada localmente nas glândulas lacrimais de coelhos para causar adenite lacrimal imune, estabelecendo assim um modelo de deficiência aquosa olho seco26. Além disso, animais transgênicos, como NOD, Aly/aly, NFS/sld, IQI/Jic, Id3 KO e outras cepas de camundongos, podem imitar os sintomas e fenótipos da síndrome de Sjögren primária27 para replicar o olho seco por deficiência aquosa.
Neste estudo, o projeto experimental principal envolveu um procedimento cirúrgico para remover sem dor e com precisão o ELG e o ILG do camundongo. Essas glândulas lacrimais são essenciais para manter a umidade e a lubrificação dos olhos; Sua remoção resulta em uma redução significativa na secreção lacrimal, mimetizando a deficiência aquosa de olho seco em camundongos. Essa abordagem permite a observação e análise do comportamento do camundongo, respostas fisiológicas e alterações do tecido ocular no estado de olho seco, fornecendo uma base experimental fundamental para estudos de patologia e avaliação de opções de tratamento para a doença do olho seco.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 10 mL</td><td>Zhejiang KDL Medical Devices Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-0 Agulha</td> de <td>Sutura Suzhou 66 Vision Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Shanghai Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, burro anti-rato IgG</td><td>Invitrogen</td><td>811493</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594, burro anti-coelho IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-queratina 12 EPR17882</td><td>Abcam</td><td>ab185627</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-PAX6</td><td>Abcam</td><td>ab5790</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Hirayama. Japão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 mouse</td><td>Shanghai Slack Laboratory Animal Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga à temperatura ambiente</td><td>Eppendorf. Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>Shanghai Bioengineering Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balanças eletrônicas</td><td>Shanghai Auhaus Biotech Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de micrografia de contraste de fase invertida de fluorescência</td><td>TE-2000U, Nikon. Japão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Congele o</td><td>Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Congele a lâmina de corte</td><td>Xiamen Taijing Biotechnology Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H-1200 com meio de montagem DAPI</td><td>Xiamen Juin Biotechnology Co., Ltd. China</td><td></td><td>meio de montagem contendo DAPI</td></tr><tr><td>H-5000 Tablet</td><td>Mountant Vector. EUA</td><td></td><td>meio de montagem</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Shanghai Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloração de hematoxilina-eosina</td><td>Auragene. EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td></td></tr><tr><td>nitrogênio líquido</td><td>Xiamen Yidong Gas Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulha microscópica</td><td>Suzhou 66 Vision Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça dentada microscópica</td><td>Suzhou 66 Vision Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópica fórceps desdentado</td><td>Suzhou 66 Vision Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modelo 3050 fatiador congelado</td><td>Leica, Deerfield, IL. EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OUTUBRO</td><td>Xangai Maokang Biotechnology Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pomada</td><td></td><td></td><td></td>de ofloxacina</tr><tr><td>Tiras de teste de fluoresceína de sódio oftálmica</td><td>Tianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pó de paraformaldeído</td><td>Sigma. Esterilizador</td> rápido de fio de algodão vermelho PBS USA <td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Suzhou 66 Vision Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr> Proteína <tr><td></td> SPRR1b humana recombinante&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab167925</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa refrigerada</td><td>Eppendorf. Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suportes</td><td></td><td></td><td></td>de slides</tr><tr><td>Lâmpada de fenda</td><td>Topcon. Japão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caixa</td><td>de amostra Lambolide (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd. China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Álcool Terc-Amílico</td><td>Xangai. Macklin Biochemical, China</td><td>A800283</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>de Tribromoetanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma. Freezer de</td> temperatura ultrabaixa dos EUA <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific. Micrografia</td> de fluorescência vertical dos EUA <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica DM2500. EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de biomicrografia normal vertical</td><td>Eclipse 50i, Nikon. Reagente</td> químico Co. de Shanghai Sinopharm de Japão <td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>, Ltd.,</td> microscópio cirúrgico de China <td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss</td><td>VISU150, Carl ZEISS. Alemanha</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

estabelecimento de um modelo de camundongo de olho seco por deficiência aquosa

Establishment of A Mouse Model of Aqueous Deficiency Dry Eye

A doença do olho seco é uma condição prevalente que afeta 5% a 50% da população global. As investigações em modelos animais desempenham um papel crucial na compreensão de seus mecanismos subjacentes. Portanto, desenvolvemos um modelo de camundongo de doença do olho seco removendo cirurgicamente as glândulas lacrimais extraorbitais (ELG) e as glândulas lacrimais intraorbitais (ILG) para investigar a patologia da superfície ocular no contexto do olho seco por deficiência aquosa. Duas semanas após a operação, os camundongos exibiram manifestações graves de olho seco, incluindo redução da secreção lacrimal, irregularidades epiteliais da córnea, coloração positiva de fluoresceína sódica e neovascularização. O exame histológico via coloração de hematoxilina e eosina revelou infiltração de células inflamatórias e displasia do epitélio da córnea. A coloração por imunofluorescência e a reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa revelaram diminuição da expressão dos biomarcadores epiteliais normais da córnea K12 e Pax6 e aumento da expressão de Sprr1b no epitélio da córnea. Essas manifestações oculares indicaram diferenciação epitelial anormal da córnea. Além disso, a coloração por imunofluorescência de Ki67 revelou o aumento da proliferação celular. Em conclusão, o modelo de excisão ELG mais ILG mostrou-se adequado para estudar alterações na superfície ocular e elucidar os mecanismos subjacentes à deficiência aquosa do olho seco.

Para investigar os efeitos e os mecanismos subjacentes da síndrome do olho seco por deficiência lacrimal na superfície ocular, estabelecemos um modelo murino de olho seco por deficiência aquosa mediante remoção cirúrgica tanto da GLG quanto da GLI (Figura 1A). Após um período de 2 semanas seguinte à ressecção das glândulas lacrimais, a secreção lacrimal nos camundongos com olho seco (após remoção das glândulas lacrimais) diminuiu significativamente em comparação com o grupo normal (Figura 1B,C). A avaliação da córnea por meio de microscopia de fenda revelou acentuada xerose, e a coloração com fluoresceína sódica exibiu manchas puntiformes difusas ao longo da córnea, indicativas de defeitos no epitélio corneano. Além disso, observou-se neovascularização tanto nas camadas epiteliais superficiais quanto estromais da córnea, estendendo-se difusamente em direção à região central da córnea (Figura 1D).
A análise histológica por meio da coloração H&amp;E demonstrou metaplasia escamosa no epitélio corneano, acompanhada pelo acúmulo de células inflamatórias pequenas e arredondadas, com núcleos celulares azul-escuros a roxo-escuros, na camada estromal da córnea (Figura 2A). Além disso, alterações displásicas eram evidentes na camada basal do epitélio corneano do grupo experimental (Figura 2B).
A coloração por imunofluorescência e a qRT-PCR revelaram que os níveis de expressão da queratina 12 específica para córnea (Figura 3A,B) e do fator de transcrição Pax6 específico para células epiteliais da córnea (Figura 4A,B) nas células epiteliais da córnea no grupo com olho seco foram significativamente mais baixos do que no grupo normal. Em contrapartida, no grupo com olho seco, a imunofluorescência da marcação de diferenciação anormal das células epiteliais da córnea, Sprr1b, foi significativamente maior em comparação com o grupo normal (Figura 5A,B). Em seguida, na análise por imunofluorescência, as células Ki67 no grupo com olho seco mostraram atividade proliferativa mais elevada em comparação com o grupo de olho normal (Figura 6A,B). Esses fenótipos observados se assemelham estreitamente às apresentações clínicas observadas em pacientes com doenças graves de olho seco, como a síndrome de Sjögren e a síndrome de Stevens-Johnson30,31.
<img alt="Diagrama das glândulas lacrimais de camundongo, gráfico de secreção lacrimal, imagens oculares; análise normal versus olho seco." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67317/67317fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Estabelecimento do modelo de olho seco. (A) Construção de um modelo de doença de olho seco grave em ambiente de baixa umidade por meio da remoção cirúrgica das glândulas lacrimais extraorbitárias e intraorbitárias, seguida pela manutenção dos camundongos por 14 dias. Após a indução do modelo, nós (B,C) medimos a secreção lacrimal com fio de algodão fenolado e (D) observamos defeitos corneanos e neovascularização com lâmpada de fenda. (n = 6, ****P &lt; 0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67317/67317fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Comparação histológica entre tecido normal e tecido com olho seco, imagens de microscopia com ampliação de 20X e 40X." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67317/67317fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Coloração H&amp;E. Realizamos a coloração H&amp;E dos bulbos oculares para examinar a morfologia das células epiteliais da córnea. (A) Os resultados mostraram que o epitélio corneano normal apresentava metaplasia escamosa, a camada estromal da córnea reunia um grande número de células inflamatórias pequenas e redondas, cujo núcleo celular estava intensamente corado em azul-violeta escuro; (B) a base do epitélio corneano do grupo operado apresentava displasia de células displásicas. Barra de escala = 50 µm (20x), 20 µm (40x). Abreviação: H&amp;E = hematoxilina e eosina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67317/67317fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Coloração com DAPI K12 com gráfico de barras de expressão de mRNA; olho seco versus normal; comparação por microscopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67317/67317fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Alterações fenotípicas das células no estado de olho seco. (A) A intensidade da imunomarcação de K12 no epitélio corneano do grupo com olho seco indicou uma diminuição significativa na expressão de K12 em comparação com o grupo normal. (B) A expressão de K12 nas células epitéliais corneanas do grupo com olho seco em relação ao grupo controle também mostrou uma diminuição significativa. Barra de escala = 50 µm. n = 3, ****P &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67317/67317fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Expressão de Pax6 em olho seco versus normal; análise por imunofluorescência e gráfico de barras de mRNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67317/67317fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: A linhagem celular do epitélio corneano no estado de olho seco. (A) Imunomarcação e (B) nível de mRNA de Pax6 no epitélio corneano do grupo com olho seco foram significativamente reduzidos em comparação com o grupo normal. Barra de escala = 50 µm. n = 3, **P &lt; 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67317/67317fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Microscopia de fluorescência de Sprr1b e coloração com DAPI em olho normal versus olho seco, gráfico comparativo de níveis de mRNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67317/67317fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: A diferenciação anormal do epitélio corneano no estado de olho seco. (A) A intensidade da imunomarcação de Sprr1b nas células epiteliais corneanas no grupo de olho seco foi significativamente maior do que no grupo normal, o que também foi fortemente comprovado por (B) análise de qRT-PCR. Barra de escala = 50 µm. n = 3, **P &lt; 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67317/67317fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Coloração Ki67/DAPI em tecido normal versus olho seco, imagens de microscopia com gráfico de barras mostrando contagem celular." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67317/67317fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
Figura 6: Proliferação celular do epitélio corneano no estado de olho seco. (A, B) A imunomarcação de Ki67 no epitélio corneano no grupo de olho seco mostrou intensidade aumentada em comparação com o grupo normal. Barra de escala = 50 µm. n = 3, *P &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67317/67317fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gene</td>
			<td>Primer Sentido</td>
			<td>Primer Anti-Sentido</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-Pax6 
			Mouse-Krt12 
			Mouse-Sprr1b</td>
			<td>5’- ACTTCAGTACCAGGGCAACC -3’ 
			5’- TGACCCTGACTAGAGCCGAC -3’ 
			5’- GACCACAGTACCTGTCCTCC -3’</td>
			<td>5’- GCTTCATCCGAGTCTTCTCC -3’ 
			5’- ACATTGACCTCACCTGGACC -3’ 
			5’- CTGGCAAGGCTGTTTCACTT -3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse-Actb</td>
			<td>5’- CTGTCGAGTCGCGTCCA -3’</td>
			<td>5’- ACCCATTCCCACCATCACAC -3’</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Sequências dos primers utilizados para RT-PCR quantitativa.

Aqui, apresentamos um método para estabelecer um modelo de camundongo de olho seco deficiente em aquos, excisando as glândulas lacrimais extraorbital e infraorbital e avaliar as alterações na superfície ocular no olho seco por deficiência aquosa.

Estabelecimento de um modelo de camundongo de olho seco por deficiência aquosa

Dry eye disease is a prevalent condition affecting 5%-50% of the global population. Animal model investigations play a crucial role in understanding its ...

establishment-of-a-mouse-model-of-aqueous-deficiency-dry-eye

Research

JoVE Journal

Medicine

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Este vídeo demonstra uma técnica para induzir doença autoimune autoimune crônica experimental em ratos. Ao injetar uma emulsão adjuvante de antígeno contendo autoantígenos e antígenos estranhos em um rato em intervalos predefinidos, a inflamação ocular crônica é induzida no rato imunizado, injetando os mesmos antígenos nos tecidos da superfície ocular.

Uma técnica para induzir olho seco autoimune experimental crônico em ratos

Sem usar anestesia, injete subcutaneamente a emulsão na base das caudas dos ratos. Então, no dia 14, de maneira semelhante, injete 200 microlitros do mesmo antígeno e adjuvante de Freund incompleto. No mesmo dia, injetar intraperitonealmente 300 nanogramas de toxina pertussis em 100 microlitros de PBS.

Este vídeo demonstra um método para avaliar a suavidade da córnea e a estabilidade do filme lacrimal em um modelo de rato autoimune. Ele destaca o impacto da disfunção da glândula na estabilidade do filme lacrimal, crucial para a compreensão da doença do olho seco.

Avaliação da Suavidade da Córnea e da Lágrima em um Modelo de Rato de Olho Seco Autoimune

O seguinte artigo fornece uma técnica fácil, reprodutível para efetivamente criar um modelo do rato sustentável da deficiência límbica (LSCD). Este modelo animal é útil em testar e comparar a eficácia dos tratamentos para as doenças de células estaminais do limbo.

Um procedimento mecânico simples de criar Limbal Deficiência Stem Cell no mouse

Este relatório descreve um método para induzir o olho seco autoimune experimental crônico em ratos Lewis através da imunização com uma emulsão de extrato da glândula lacrimal de rato, ovalbumina e adjuvante completo de Freund, seguido da injeção de extrato da glândula lacrimal e ovalbumina na subconjunctiva forniceal e glândulas lacrimais Seis semanas depois.

Um modelo crônico de Rato de olho seco autoimune com aumento de células de memória E Effect no tecido do globo ocular

Este artigo descreve o desenvolvimento de um método para induzir doenças agudas ou crônicas do olho seco em coelhos injetando concanavalina A a todas as porções do sistema de glândula lacrimal orbital. Esse método, superior aos já relatados, gera um modelo reprodutível e estável de olho seco adequado para o estudo de agentes farmacológicos.

Um modelo de coelho da doença aquosa-deficiente do olho seco induzida pela concanavalina Uma injeção nas glândulas lacrimal: aplicação a estudos de eficácia de drogas

Uma nova abordagem é apresentada para induzir doença ocular seca crônica em coelhos, removendo cirurgicamente todas as glândulas lacrimais orbitais. Este método, distinto daqueles relatados previamente, produz um modelo estável, reproduzível do olho seco deficiente aquoso bem serido para estudar a fisiologia do rasgo e a fisiopatologia e a terapêutica ocular.

Estabelecimento de um modelo severo do olho seco usando dacryoadenectomy completo nos coelhos

Aqui, estabelecemos um modelo de disfunção da glândula lacrimal em ratos para fornecer uma base para o estudo do olho seco aquoso-deficiente.

Modelo de Olho Seco de Rato com Disfunção da Glândula Lacrimal Induzida por Escopolamina

A córnea é o único que carece de tecidos vasculares. No entanto, o crescimento dos vasos sanguíneos e robusta sobrevivência pode ser induzida na córnea de potentes fatores angiogênicos. Portanto, a córnea pode fornecer-nos com uma ferramenta valiosa para estudos angiogênico. Este protocolo demonstra como executar o modelo do rato de ensaio de córnea bolso e como avaliar a angiogênese induzida por fatores angiogênicos usando este modelo.

Um modelo do rato do Ensaio de bolso Córnea para o Estudo da angiogênese

Aprenda a estabelecer um modelo de camundongo de olho seco por deficiência aquosa através da excisão das glândulas lacrimais extraorbitária e infraorbitária. Este método simplificado replica estados patológicos semelhantes à síndrome de Sjögren.

Estabelecimento de um modelo de camundongo de olho seco por deficiência aquosa

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