Name: Identificação e quantificação de metabólitos perturbados em pacientes críticos usando metabolômica baseada em RMN (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Aprenda a identificar metabólitos perturbados em pacientes críticos com ARDS usando metabolômica baseada em RMN. Este método permite analizar assinaturas metabólicas distintas para diagnóstico precoce e medicina personalizada.

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A aprovação ética (código IEC: 2022-71-PhD-126) foi obtida do IEC do Instituto de Pós-Graduação em Ciências Médicas Sanjay Gandhi (SGPGIMS), Lucknow. Foram obtidos consentimentos por escrito e informados dos pacientes ou de seus familiares para a realização do estudo e publicação dos dados para fins de pesquisa. Além disso, a pesquisa foi conduzida seguindo as diretrizes institucionais.
1. Desenho do estudo e liberação ética
<ol>
	<li>Determine o tamanho da amostra para cada grupo. Revise cuidadosamente e estabeleça os critérios de seleção para os participantes. Além disso, se o desenho do estudo exigir a inclusão de amostras humanas ou animais, obtenha autorização ética do comitê de ética institucional (IEC) apropriado antes de iniciar a coleta da amostra.</li>
	<li>Selecione pacientes com SDRA categorizados como leves, moderados e graves, com base nos critérios diagnósticos da definição de Berlim 2012 com base na pressão parcial de oxigênio no sangue arterial (PaO2) para a fração inspirada de oxigênio (FiO2) (P/F). Os pacientes com SDRA com uma faixa de P/F de 300-200 são considerados leves, 200-100 como moderados e abaixo de 100 como graves38. Aqui, nos concentramos em dois grupos: pacientes com SDRA leve e moderada (ver Tabela 1). NOTA: O estudo envolve o uso de soro obtido de amostras de sangue para realizar metabolômica baseada em RMN. Neste estudo, os participantes incluídos para referência tinham idade média de 42 anos (± 10,9 anos), com distribuição por sexo de 2 homens e 6 mulheres.</li>
</ol>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Categoria</td>
			<td>Relação P/F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moderada</td>
			<td>300-200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moderado</td>
			<td>200-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grave</td>
			<td>100-0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Categorização dos pacientes com SDRA.
2. Seleção, coleta e processamento de amostras
<ol>
	<li>Realize o isolamento do soro seguindo as etapas descritas abaixo.<ol>
		<li>Para experimentar, colete 2 mL de amostras de sangue das artérias usando uma agulha estéril em um frasco simples (sem aditivos) e estéril. Deixe a amostra coagular por 30 min em temperatura ambiente. Para este estudo, foram selecionados 4 pacientes com diagnóstico de SDRA leve e 4 pacientes com SDRA moderada.</li>
		<li>Centrifugue a amostra a 3100 x g por 15 min para separar o soro25. Transfira o soro para tubos de microcentrífuga estéreis, fazendo alíquotas de menor volume (ou seja, 400-500 μL), rotule-as adequadamente (nome do paciente, número CR, ponto do dia, etc.) e armazene-as a -80 ° C para análise futura. NOTA: Neste ponto, o experimento pode ser pausado e retomado em um momento conveniente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Processe a amostra de soro antes dos experimentos de RMN usando as etapas a seguir.<ol>
		<li>Descongele a amostra antes de realizar os experimentos de RMN. Misture 250 μL de alíquota do soro com 250 μL de solução tampão fosfato salino (contendo 100% D2O, 0,9% NaCl, 50 mM tampão fosfato de sódio, pH 7,4) para minimizar a variação do pH.</li>
		<li>Vortex a mistura por alguns segundos (~ 15 s) para garantir que esteja homogeneamente misturada. Por fim, transferir a amostra preparada para um tubo de RMN limpo com inserto coaxial contendo propionato de trimetilsilil (TSP) na concentração de 0,05 mM, que serve como padrão externo para calibração e quantificação41. NOTA: Para referência, é utilizado um composto inerte e não reativo que não interage com os analitos. Outros compostos de referência comumente usados incluem tetrametilsilano (TMS) e trimetilsililpropanossulfonato de sódio (DSS).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Experimentação de RMN
NOTA: O foco está na identificação de pequenas moléculas nas amostras de soro, portanto, usamos a sequência de pulso Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG), que suprime os sinais das macromoléculas. Todas as amostras de soro neste estudo foram registradas usando um espectrômetro de RMN de 800 MHz equipado com uma cabeça de sonda inversa de banda larga TCI de ressonância tripla de 5 mm resfriada criogenicamente e gradiente z blindado.
<ol>
	<li>Coloque a amostra no ímã. Escreva o comando wrpa (mencione o número do experimento) e pressione enter para configurar um experimento de prótons com o programa de pulso cpmg. Mencione o nome do paciente e outros detalhes necessários clicando na opção Título.</li>
	<li>Bloqueie o campo magnético escrevendo o comando Bloquear, pressione enter e selecione a opção 90% H2O e 10% D2O mais. Ajuste e combine a sonda manualmente por ATMM para otimizar a eficiência dos pulsos de radiofrequência e maximizar a sensibilidade. Execute o calço de gradiente 1D clicando em topshim.</li>
	<li>Defina os seguintes parâmetros de aquisição, incluindo um atraso de relaxamento de 5 s, uma largura de varredura espectral de 12 partes por milhão (ppm) e um tempo de eco de 300 μs. Todos esses parâmetros podem ser facilmente modificados selecionando a opção Parâmetros de aquisição no painel superior.</li>
	<li>Aplique o alargamento de linha de 0,3 Hz usando uma função de janela exponencial, coletando dados em 64.000 pontos em 128 varreduras. Esses parâmetros podem ser modificados da mesma forma selecionando a opção Parâmetros de aquisição no painel superior. Ao clicar em Parâmetros de aquisição, uma lista de especificações aparecerá, e os atributos mencionados, juntamente com outros parâmetros, podem ser modificados durante a otimização.</li>
	<li>Adquira os espectros de RMN usando ferramentas de processamento e análise de RMN. Assim que os espectros finais forem obtidos, escreva o comando apk e absn e pressione enter para realizar a correção de fase e a correção da linha de base, respectivamente. Clique na opção Calibrar eixo presente no painel superior e, em seguida, calibre o pico do TSP para 0 ppm automática ou manualmente.</li>
	<li>Transfira os dados adquiridos do sistema para a estação de trabalho, onde são feitos processamento e análise adicionais. NOTA: A fase experimental está concluída e pode ser pausada. O pré-processamento, análise e interpretação de dados podem ser realizados convenientemente.</li>
</ol>
4. Pré-processamento de dados
<ol>
	<li>Realize o pré-processamento de dados usando ferramentas de processamento e análise de RMN e software de quantificação de metabólitos de RMN.<ol>
		<li>Às vezes, apenas a correção automática não é suficiente e, nesse caso, a correção manual também é necessária. Para realizar a correção de fase manualmente, clique na opção Processar na barra de menu superior das ferramentas de processamento e análise de RMN. Em seguida, clique em Ajustar fase, arraste o mouse e observe até que os espectros sejam corrigidos de fase. Feito isso, clique na opção Salvar e Devolver (presente em forma de ícone) disponível na mesma barra de menu.</li>
		<li>Para realizar a correção manual da linha de base (método Whittaker), abra o arquivo espectral no módulo processador do software de quantificação de metabólitos de RMN. Selecione a opção Correção de linha de base. Em seguida, selecione a opção Método Whittaker. Agora coloque os pontos na base dos picos em todo o espectro (0,0 a 10 ppm geralmente no caso do soro ou de acordo com a disponibilidade do metabólito nos espectros) para ajustar a base. Depois que todos os arquivos espectrais tiverem sido corrigidos na linha de base, salve-os em uma única pasta. O processamento posterior, usando o processador ou o módulo profiler do software de quantificação de metabólitos de RMN, pode ser realizado usando o mesmo arquivo salvo no formato específico.</li>
		<li>Execute o binning usando o módulo profiler do mesmo software. Selecione a opção Ferramentas, Processo em lote e, em seguida, Agrupamento espectral.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para gerar a planilha de compartimentalização final a ser usada para análise estatística, selecione a pasta que contém todos os arquivos espectrais corrigidos da linha de base após clicar em Compartimentalização espectral.</li>
	<li>Divida os espectros em um número definido de caixas de tamanhos iguais com uma largura espectral definida, variando de 0,01 a 0,04 ppm (pode ser otimizado de acordo com o estudo). Esse processo simplifica e organiza os dados espectrais, facilitando uma análise mais consistente. Especifique o tamanho do bucket junto com os valores de ppm inicial e final e designe a pasta onde as planilhas de compartimentalização de saída serão salvas.</li>
	<li>Exclua as regiões de deslocamento químico correspondentes à água e ao solvente TSP (4,8-5,2 e 0,0-0,7 ppm) para evitar interferência espectral 42,43,44.</li>
	<li>Esta planilha contém os nomes de amostra em uma linha e os diferentes valores de compartimento, juntamente com ppm nas outras linhas. Antes de usar esta planilha para análise estatística, modifique-a organizando as amostras em grupos para análise e salvando-as apenas no formato delimitado por vírgulas (CSV). NOTA: Por exemplo, ao comparar o grupo leve com o grupo moderado de pacientes com SDRA, organizamos os dados com rótulos leves e moderados, adicionamos um número de série e salvamos o arquivo no formato CSV.</li>
</ol>
5. Análise estatística
NOTA: A planilha de compartimentalização obtida na etapa anterior serve como arquivo de entrada para análise estatística. Neste estudo, foi utilizado o módulo de análise estatística (um fator) do software de análise estatística metabolômica.
<ol>
	<li>Antes da análise estatística, execute a etapa de normalização usando soma, log e Pareto, mas pode variar em diferentes estudos45.</li>
	<li>Realizar análises univariadas e multivariadas para distinguir os diferentes grupos e determinar a precisão dos metabólitos identificados.<ol>
		<li>Realize análise de componentes principais (PCA), análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA) e análise discriminante de mínimos quadrados parciais ortogonais (OPLS-DA) para observar a discriminação entre os grupos que produzem pontuações de importância variável de projeção (VIP) para cada metabólito responsável pela diferença no perfil metabólico.</li>
		<li>Realizar métodos univariados, como o teste t de Student e ANOVA, para identificar os metabólitos significativos com base nos critérios de ter um valor de p menor que 0,05. Ambos os testes produzem gráficos de bigode de caixa mostrando a diferença na concentração relativa dos metabólitos.</li>
		<li>Realize a análise de biomarcadores, que produz uma área sob o gráfico da curva característica de operação do receptor (AUROC). O valor da AUC (área sob a curva) &gt; 0,8 é considerado significativo46.</li>
		<li>Selecione a lista final de metabólitos significativos usando os critérios pontuação VIP&gt;1, valor de p corrigido por Bonferroni&lt;0,0544 e AUC &gt; 0,846.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identifique os metabólitos conforme descrito abaixo.<ol>
		<li>O binning fornece metabólitos significativos na forma de valores de ppm em vez de nomes. Identifique os metabólitos correspondentes a valores específicos de ppm usando bancos de dados como o Banco de Ressonância Magnética Biológica (BMRB)47e o Banco de Dados de Metaboloma Humano (HMDB).</li>
		<li>Além desses, use a literatura publicada anteriormente42,44 para identificação e validação.</li>
		<li>Use o módulo profiler do software de quantificação de metabólitos de RMN para confirmar os metabólitos identificados com seus valores de ppm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Quantificação de metabólitos usando software de quantificação de metabólitos de RMN
NOTA: O módulo profiler do software é amplamente utilizado para quantificar os metabólitos identificados.
<ol>
	<li>Antes de iniciar a quantificação, calibre o composto de referência selecionado para o estudo (tsp usado neste estudo) usando o módulo do processador. Clique na opção Calibrar CSI (indicador de forma química). Mencione a concentração do composto de referência (0,05 mM para este estudo). Em seguida, arraste o pico do software para o pico de referência espectral e ajuste sua altura e largura corretamente. Assim que os picos de referência espectral se ajustarem ao pico do software, clique em Aceitar.</li>
	<li>Abra os espectros desejados no módulo profiler e selecione a biblioteca de compostos apropriada para estudo.</li>
	<li>Na parte inferior da tela, uma lista de metabólitos é exibida. Selecione o metabólito de interesse nesta lista. Uma vez selecionado, o possível ppm do metabólito escolhido aparecerá no canto superior do espectro.</li>
	<li>Selecione o valor de Ppm no canto superior e amplie os espectros para a escala específica de ppm do metabólito.</li>
	<li>Neste ponto, dois picos aparecerão na tela: um representando os dados gravados e o outro, exibido como uma linha pontilhada, representando o pico do software. Alinhe os dois picos. Arraste o pico do software e ajuste sua altura e posição para corresponder ao pico presente na amostra.</li>
	<li>Uma vez devidamente alinhada, a concentração do metabolito pode ser obtida a partir do valor apresentado na rubrica concentração em mM para esse metabolito (figura 1).</li>
	<li>Siga o mesmo procedimento para todos os metabólitos e amostras e exporte os valores quantificados em uma planilha. Para gerar o arquivo de saída, clique na opção Operações em lote no menu Ferramentas . Especifique a pasta desejada para salvar o arquivo de saída.</li>
</ol>
7. Análise de vias
NOTA: Os metabólitos significativos identificados após a análise são utilizados para determinar as principais vias que influenciam diretamente o resultado em grupos de doenças. O módulo de análise de vias do software de análise estatística metabolômica e o banco de dados KEGG são geralmente empregados para esse fim.
<ol>
	<li>Insira a lista obtida de metabólitos significativos no módulo. Uma lista contendo os nomes dos caminhos é gerada.</li>
	<li>Selecione as vias finais com base em um critério de ter um fator de impacto maior que 0,1. Valores de impacto significativos indicam vias relacionadas à doença30.</li>
	<li>Analise minuciosamente as vias resultantes para elucidar a desregulação associada à gravidade da doença. Um dos deméritos desse método é sua ineficiência em identificar as vias desreguladas quando os metabólitos significativos são menores que 3.</li>
	<li>Para lidar com o mesmo, o metabólito identificado e sua correlação com a gravidade da doença também podem ser determinados usando a literatura publicada anteriormente. Faça uma pesquisa bibliográfica completa e observe se o metabólito identificado também está seguindo a mesma tendência de acordo com seu interesse.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67319/67319fig01.jpg"> 
Figura 1: Etapas fundamentais na metabolômica baseada em RMN. A figura apresenta as principais etapas da metabolômica baseada em RMN: coleta e preparação de amostras, realização de espectroscopia de RMN, pré-processamento de dados, realização de análises estatísticas, identificação e quantificação de metabólitos e interpretação do significado biológico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67319/67319fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Metabolômica usando espectroscopia de RMN para identificar metabólitos desregulados

<table><tbody><tr><td>Centirfuge</td><td>Sigma aldrich</td><td>3-18KS</td><td></td></tr><tr><td>Chenomx NMR suite&nbsp;</td><td>NMR Suite, v9, Chenomx Inc., Edmonton, Canadá</td><td></td><td>Software de quantificação de metabólitos de RMN</td></tr><tr><td>Inserção coaxial</td><td>Sigma aldrich</td><td>Z278513</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de deuterim</td><td>Sigma aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td>tubes Tarsons</td><td>500020</td><td></td></tr><tr><td>Metaboanalyst</td><td>Wishart Research Group</td><td></td><td>Software de análise estatística de metabolômica</td></tr><tr><td>Tubo de RMN</td><td>Wilmad</td><td>Z412007</td><td>Pipeta de 5mm de diâmetro</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf research plus</td><td>3123000039</td><td>0-100 &mu; l</td></tr><tr><td>Frascos de coleta de amostra Frascos</td> de <td>resfriamento criogênico Tarsons</td><td>523194</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Cristal de cloreto de sódio</td><td>Sigma aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma aldrich</td><td>567550</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Topspin 3.6.4</td><td>Ferramenta de processamento e análise de RMN</td><td>Bruker</td><td></td></tr><tr><td>Sal Sigma</td><td>aldrich</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

identificação e quantificação de metabólitos perturbados em pacientes críticos usando metabolômica baseada em rmn

Identification and Quantification of Deranged Metabolites in Critically Ill Patients Using NMR-Based Metabolomics

Para realizar um estudo metabolômico, é essencial determinar o tamanho da amostra e os grupos específicos que serão analisados. A seleção de um tamanho amostral adequado é essencial para a obtenção de resultados significativos que se correlacionem com precisão com a gravidade da doença48. No entanto, neste trabalho em particular, usamos um pequeno tamanho de amostra para demonstrar as etapas envolvidas na identificação e quantificação de metabólitos usando metabolômica baseada em RMN, que se destinava principalmente à referência. Neste estudo, examinamos as diferenças metabólicas entre pacientes nos estágios leve e moderado da SDRA no dia 1 de sua internação na UTI, incluindo um total de 8 indivíduos. Seguindo o protocolo, espectros de RMN de todas as amostras foram adquiridos e processados e, eventualmente, uma planilha foi criada com os resultados do binning.
Em seguida, realizamos uma análise estatística rigorosa, onde as planilhas de binning foram usadas como arquivos de entrada, normalizando os dados usando soma, log e Pareto. Realizamos ACP (Figura 2A) e OPLS-DA (Figura 2B), onde a primeira apresentou agrupamento, mas a segunda revelou clara discriminação entre os grupos e destacou diferenças metabólicas. A análise estatística do teste de permutação (20x) produziu valores de R2Y=0,99 e Q2=0,47. Posteriormente, realizamos um teste t de Student (Figura 2C) e análise de biomarcadores (Figura 2D) para identificar metabólitos desregulados. Seguindo os critérios descritos na seção do protocolo, filtramos os resultados para os metabólitos significativos (Tabela 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67319/67319fig02.jpg"> 
Figura 2: Análise multivariada e univariada. (A) Análise de componentes principais (PCA) e (B) Análise discriminante de mínimos quadrados parciais ortogonais (OPLS-DA) de pacientes com SDRA leve (representada pela cor vermelha) e pacientes com SDRA moderada (representada pela cor verde). (C) Os gráficos de caixa com bigode destacam as diferenças na concentração relativa de metabólitos entre pacientes com SDRA leve e moderada detectadas por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de prótons em amostras de soro. O eixo x representa os grupos de estudo, e o eixo y mostra a concentração relativa quando pacientes com SDRA leve (representada pela cor vermelha) e pacientes com SDRA moderada (representada pela cor verde) foram comparados no dia 1 de admissão na UTI. (D) O gráfico de área sob a curva (AUC) de metabólitos significativos prevendo a gravidade obtida após a realização da análise de biomarcadores comparando pacientes com SDRA leve e moderada no dia 1 da internação na UTI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67319/67319fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>S.No.</td>
			<td>Nome</td>
			<td>Localização espectral (ppm)</td>
			<td>Valor de p</td>
			<td>VIP</td>
			<td>Valor AUC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Lactato</td>
			<td>1.34</td>
			<td>0.04</td>
			<td>1.99</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Isoleucina</td>
			<td>1.42</td>
			<td>0.03</td>
			<td>2.01</td>
			<td>0.875</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Lista de metabólitos significativos obtidos após a comparação de pacientes com SDRA leve e moderada no dia 1 de internação na UTI.
Como os resultados foram obtidos em valores de ppm, atribuímos metabólitos usando literatura anterior e os validamos por meio do profiler. Após a atribuição, lactato e isoleucina foram obtidos como metabólitos significativos, que também foram relatados em alguns estudos anteriores de SDRA30,40. Garantimos a seleção de picos bem resolvidos e não sobrepostos. Após a identificação, filtrou-se a lista dos metabólitos significativos utilizando os critérios citados no protocolo. Em seguida, quantificamos os metabólitos de interesse usando o módulo profiler, abrindo os espectros, procurando o metabólito de interesse e ajustando o pico do software ao pico obtido nos espectros. Isso forneceu os valores quantificados dos metabólitos em mM. Uma planilha contendo nomes de amostras, nomes de metabólitos e concentrações foi gerada para referência. Após a quantificação com o software, a validação por meio de outras abordagens, como a proteômica, pode ser realizada.
Além disso, os metabólitos identificados são analisados minuciosamente para determinar sua correlação com a gravidade da doença e identificar as vias bioquímicas nas quais esses metabólitos estão ativamente envolvidos. Como apenas dois metabólitos significativos foram identificados após o uso dos critérios mencionados na seção de material e método, a análise da via usando o software não foi possível. Portanto, uma pesquisa bibliográfica completa foi feita para destacar os ciclos metabólicos perturbados. Os dois metabólitos identificados neste estudo se correlacionaram com sucesso com a gravidade da SDRA. O aumento do lactato denotou inflamação pulmonar e respiração anaeróbia, enquanto o aumento da isoleucina indicou catabolismo proteico associado a lesão pulmonar, infecção e metabolismo energético40. Compreender essas vias metabólicas serve a um duplo propósito. Em primeiro lugar, revela a complexidade da doença, fornecendo insights sobre seus mecanismos biológicos. Em segundo lugar, auxilia nos avanços terapêuticos, orientando os médicos na adaptação dos tratamentos para os pacientes, melhorando os resultados clínicos.

Identificação e quantificação de metabólitos perturbados em pacientes críticos usando metabolômica baseada em RMN

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