Identificação e quantificação de metabólitos perturbados em pacientes críticos usando metabolômica baseada em RMN

Nossa pesquisa usa metabolômica baseada em RMN para identificar metabólitos desregulados e vias bioquímicas que são alteradas em pacientes de UTI gravemente enfermos, e também incluímos pacientes com SDRA, que é uma doença pulmonar grave. Ao traçar o perfil e comparar as assinaturas metabólicas, pretendemos descobrir os distúrbios bioquímicos que estão ligados à progressão da doença e personalizar os tratamentos para melhorar os resultados. Na verdade, estamos tentando resolver a lacuna na compreensão da desregulação metabólica em todas as categorias de pacientes com SDRA, que inclui pacientes com SDRA leve, moderada e grave.

Para melhorar nossos insights, para uma melhor compreensão da doença, sua progressão, com o objetivo geral de melhorar o resultado do paciente, fornecendo medicina precisa e personalizada. A RMN oferece fácil preparação de amostras, preservando a integridade do soro para reanálise e detectando metabólitos conhecidos e desconhecidos sem derivatização química. Ele fornece dados quantitativos reprodutíveis, garantindo uma medição confiável de metabólitos.

Ao contrário das abordagens direcionadas, a RMN permite a exploração sensível e imparcial das alterações metabólicas, tornando-a ideal para descobrir assinaturas e vias na progressão da doença. Nossa descoberta aprimorará a pesquisa da SDRA, descobrindo alterações metabólicas em diferentes estágios, que são pouco estudados. Usando metabolômica baseada em RMN, pretendemos identificar metabólitos e vias desreguladas, levando a assinaturas potenciais para diagnóstico precoce, prognóstico, previsão e tratamentos mais oportunos.

Essa abordagem promove o gerenciamento personalizado e aprofunda o conhecimento em perfis metabólicos de vários estados. Nossos resultados abriram caminho para novas questões científicas, como: Como os metabólitos específicos identificados em diferentes estágios da SDRA influenciam a progressão da doença? Essas vias desreguladas podem ser direcionadas para intervenções terapêuticas precoces?

Além disso, como essas alterações metabólicas variam em outras condições respiratórias ou inflamatórias? Para começar, usando uma agulha estéril, colete dois mililitros de sangue das artérias de um paciente diagnosticado com síndrome do desconforto respiratório agudo leve ou moderado ou SDRA. Transfira o sangue para um frasco estéril e deixe-o coagular por 30 minutos em temperatura ambiente.

Centrifugue o sangue coagulado a 3.100 G por 15 minutos para separar o soro. Transferir o soro para tubos de microcentrífuga estéreis, fazendo alíquotas de 400 a 500 microlitros. Rotule os tubos com os detalhes do paciente e armazene-os a 80 graus Celsius.

Para experimentos de RMN, misture 250 microlitros da alíquota sérica com 250 microlitros de tampão fosfato salino para minimizar a variação do pH. Vortex a mistura por aproximadamente 15 segundos para garantir uma mistura homogênea. Transfira a amostra preparada para um tubo de RMN limpo com um inserto coaxial contendo TSP a uma concentração de 0,05 milimolar.

Em seguida, coloque o tubo de RMN no ímã. Digite WRPA e selecione o número de experimento apropriado para configurar um experimento de prótons com o programa de pulso CPMG. Clique na opção Título para inserir o nome do paciente e outros detalhes necessários.

Digite lock e pressione Enter para bloquear o campo magnético. Em seguida, selecione as opções 90% de água e 10% de óxido de deutério. Em seguida, digite ATMM e pressione Enter para realizar o ajuste e a correspondência da sonda.

Em seguida, na opção Parâmetros de aquisição, selecione os parâmetros como 64.000 pontos em 128 varreduras para coletar dados de otimização. Defina o atraso de relaxamento de cinco segundos, uma largura de varredura espectral de 12 PPM e um tempo de eco de 200 microssegundos, repetido 300 vezes. Aplique o alargamento de linha de 0,3 hertz usando uma função de janela exponencial.

Em seguida, usando as ferramentas de processamento e análise de RMN, adquira os espectros de RMN. Depois que os espectros finais forem obtidos, digite APK e ABSN para realizar a correção de fase e a correção de linha de base, respectivamente. Em seguida, clique na opção Calibrar eixo no painel superior e calibre o pico do TSP para 0 PPM, automática ou manualmente.

Por fim, transfira os dados adquiridos do sistema de RMN para a estação de trabalho para análise posterior. Depois de adquirir espectros de RMN de pacientes diagnosticados com SDRA leve ou moderada, abra o software de quantificação de metabólitos de RMN para processamento de dados. Para realizar a correção manual da linha de base usando o método Whitaker, abra o arquivo espectral no módulo processador do software de quantificação de metabólitos de RMN.

Selecione a correção da linha de base e, em seguida, escolha o método Whitaker. Coloque pontos na base dos picos em todo o espectro. Depois de concluído, salve os arquivos espectrais corrigidos da linha de base em uma única pasta.

Em seguida, para executar o agrupamento espectral usando o módulo Profiler, selecione Ferramentas, Processo em lote e Agrupamento espectral. Para gerar a planilha de compartimentalização final para análise estatística, selecione a pasta com todos os arquivos espectrais corrigidos da linha de base. Divida os espectros em caixas de tamanhos iguais com uma largura espectral definida variando de 0,01 a 0,04 partes por milhão.

Especifique o tamanho do bucket e os valores de PPM inicial e final. Escolha uma pasta para salvar as planilhas de compartimentalização de saída. Exclua as regiões de deslocamento químico correspondentes à água e ao solvente TSP para evitar interferência espectral.

A planilha final exibirá os nomes das amostras em uma linha e os valores dos compartimentos com o PPM correspondente em outras linhas. Antes de executar a análise estatística, normalize os dados usando alguma normalização, transformação de log e escala de Pareto. Para análise multivariada, realize a Análise de Componentes Principais, a Análise Discriminante de Mínimos Quadrados Parciais e a Análise Discriminante de Mínimos Quadrados Parciais Ortogonais para observar a discriminação entre os grupos, produzindo importância variável dos escores de projeção para cada metabólito responsável pela diferença no perfil metabólico.

Realize o teste t de Student para identificar metabólitos significativos com um valor de p inferior a 0,05. Os testes T produzem gráficos de bigode de caixa exibindo diferenças nas concentrações de metabólitos. Em seguida, realize a análise de biomarcadores para gerar uma área sob o gráfico da curva característica de operação do receptor.

Selecione a lista final de metabólitos significativos com base em uma importância variável da pontuação de projeção maior que um, um valor de p corrigido por Bonferroni menor que 0,05 e uma área sob a curva maior que 0,8. Usando o Banco de Dados de Metaboloma Humano, identifique os metabólitos correspondentes a valores específicos de PPM. Antes de iniciar a quantificação, calibrar o composto de referência selecionado para o estudo utilizando o módulo do processador.

Clique na opção Calibrar Indicador de Mudança Química e insira a concentração do composto de referência. Arraste o pico do software para o pico de referência espectral e ajuste sua altura e largura. Quando os picos de referência espectral se alinharem com o pico do software, clique em Aceitar.

Em seguida, abra os espectros desejados no módulo Profiler e selecione a biblioteca de compostos apropriada para estudo. Na parte inferior da tela, uma lista de metabólitos será exibida. Selecione o metabólito de interesse na lista.

Clique no valor do PPM no canto superior da tela. Amplie os espectros para a escala PPM específica do metabólito. Neste ponto, dois picos aparecem na tela, um representando os dados gravados e o outro, mostrado como uma linha pontilhada, representando o pico do software.

Arraste o pico do software para alinhá-lo com o pico registrado, ajustando a altura e a posição para corresponder. Uma vez que os picos estejam devidamente alinhados, leia a concentração do metabólito a partir do valor exibido sob o título Concentração em milimolar. Para gerar o arquivo de saída, no menu Ferramentas, clique na opção Operações em lote e especifique a pasta desejada para salvar o arquivo de saída.

A Análise de Componentes Principais exibiu agrupamento distinto entre os grupos de pacientes com SDRA leve e moderada. A Análise Discriminante de Mínimos Quadrados Parciais Ortogonais revelou uma clara separação entre os grupos de SDRA leve e moderada, enfatizando as diferenças metabólicas. O teste t de Student e a análise de biomarcadores revelaram os principais metabólitos desregulados entre SDRA leve e moderada.

O lactato e a isoleucina foram identificados como metabólitos significativamente desregulados, correlacionando-se com a gravidade da SDRA.