Name: Revelando proteoformas de histonas usando eletroforese em gel 2D-TAU (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Aprenda a caracterizar proteoformas de histonas usando eletroforese 2D-TAU e espectrometria de massa. Este método avança a compreensão das mudanças epigenéticas e suas implicações no tratamento do câncer.

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<meta charset="utf8"></head><body>Separação de gel 2D para enriquecimento de isoformas de histonas e caracterização de PTM

<ol><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Cutter, A. R., Hayes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+nucleosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A brief review of nucleosome structure.</a> FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).</li>
<li>Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+post-translational+modifications+-+cause+and+consequence+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function.</a> Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+epigenetic+modifications+on+the+path+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer.</a> Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).</li>
<li>Kinnaird, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+control+of+epigenetics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metabolic control of epigenetics in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (11), 694-707 (2016).</li>
<li>Díaz-Hirashi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+signaling+to+chromatin+modifications+in+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and signaling to chromatin modifications in tumorigenesis.</a> Adv Exp Med Biol. 1219, 225-241 (2020).</li>
<li>Panatta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+by+p53+prevents+R-loop-associated+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation by p53 prevents R-loop-associated genomic instability.</a> Cell Rep. 41 (5), 111568(2022).</li>
<li>Scumaci, D., Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+meets+metabolism%3A+novel+vulnerabilities+to+fight+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Epigenetic meets metabolism: novel vulnerabilities to fight cancer.</a> Cell Commun Signal. 21 (1), 249(2023).</li>
<li>Chiaradonna, F., Scumaci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metabolism+as+a+new+real+target+in+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cancer metabolism as a new real target in tumor therapy.</a> Cells. 10 (6), 1393(2021).</li>
<li>Scumaci, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DJ-1+proteoforms+in+breast+cancer+cells%3A+The+escape+of+metabolic+epigenetic+misregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">DJ-1 proteoforms in breast cancer cells: The escape of metabolic epigenetic misregulation.</a> Cells. 9 (9), 1968(2020).</li>
<li>Olivo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+beyond+the+tip+of+the+iceberg%3A+DJ-1+implications+in+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Moving beyond the tip of the iceberg: DJ-1 implications in cancer metabolism.</a> Cells. 11 (9), 1432(2022).</li>
<li>Zheng, Q., Maksimovic, I., Upad, A., David, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+covalent+modifications%3A+a+new+link+between+metabolism+and+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic covalent modifications: a new link between metabolism and epigenetics.</a> Protein Cell. 11 (6), 401-416 (2020).</li>
<li>Maksimovic, I., David, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+covalent+modifications+as+a+new+chapter+in+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic covalent modifications as a new chapter in the histone code.</a> Trends Biochem Sci. 46 (9), 718-730 (2021).</li>
<li>Lowe, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+mutations%3A+an+updated+view+of+their+role+in+chromatin+deregulation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Histone H3 mutations: an updated view of their role in chromatin deregulation and cancer.</a> Cancers. 11 (5), 660(2019).</li>
<li>Karsli-Ceppioglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epigenetic+landscape+of+promoter+genome-wide+analysis+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The epigenetic landscape of promoter genome-wide analysis in breast cancer.</a> Sci Rep. 7 (1), 6597(2017).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methyltransferase+and+drug+resistance+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Histone methyltransferase and drug resistance in cancers.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 173(2020).</li>
<li>Vardabasso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+variants%3A+emerging+players+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Histone variants: emerging players in cancer biology.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (3), 379-404 (2014).</li>
<li>Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+alterations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic alterations in cancer.</a> Front Biosci. 25 (6), 1058-1109 (2020).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2AX+promotes+metastatic+progression+by+preserving+glycolysis+via+hexokinase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Histone H2AX promotes metastatic progression by preserving glycolysis via hexokinase-2.</a> Sci Rep. 12 (1), 3758(2022).</li>
<li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZNF506-dependent+positive+feedback+loop+regulates+H2AX+signaling+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ZNF506-dependent positive feedback loop regulates H2AX signaling after DNA damage.</a> Nat Commun. 9 (1), 2736(2018).</li>
<li>Ribeiro-Silva, C., Vermeulen, W., Lans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF%3A+Complex+complexes+in+genome+stability+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF: Complex complexes in genome stability and cancer.</a> DNA Repair. 77, 87-95 (2019).</li>
<li>Yang, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epigenetic+regulation+in+plasticity+of+tumor+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of epigenetic regulation in plasticity of tumor immune microenvironment.</a> Front Immunol. 12, 640369(2021).</li>
<li>Miranda Furtado, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidrugs%3A+targeting+epigenetic+marks+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Epidrugs: targeting epigenetic marks in cancer treatment.</a> Epigenetics. 14 (12), 1164-1176 (2019).</li>
<li>Thomas, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+analysis+of+histone+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry%3A+best+practices+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: best practices and pitfalls.</a> Methods. 184, 53-60 (2020).</li>
<li>Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+characterization+of+histones+in+clinical+samples%3A+applications%2C+progress%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges.</a> FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).</li>
<li>Kwak, H. G., Dohmae, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+histone+variants+in+the+mouse+testis+by+mass+spectrometry-based+top-down+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Trends%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of histone variants in the mouse testis by mass spectrometry-based top-down analysis.</a> Biosci Trends. 10, 357-364 (2016).</li>
<li>Sidoli, S., Simithy, J., Karch, K. R., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+resolution+data-independent+acquisition+in+an+LTQ-Orbitrap+allows+for+simplified+and+fully+untargeted+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-Orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications.</a> Anal Chem. 87, 11448-11454 (2015).</li>
<li>Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction%2C+purification+and+analysis+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Extraction, purification and analysis of histones.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).</li>
<li>Basak, S. K., Ladisch, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+electrophoretic+mobilities+of+proteins+and+peptides+with+their+physicochemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Correlation of electrophoretic mobilities of proteins and peptides with their physicochemical properties.</a> Anal Biochem. 226 (1), 51-58 (1995).</li>
<li>Nuccio, A. G., Bui, M., Dalal, Y., Nita-Lazar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+methodology+for+identification+of+native+histone+variant+modifications+from+mammalian+tissues+and+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based methodology for identification of native histone variant modifications from mammalian tissues and solid tumors.</a> Methods Enzymol. 586, 275-290 (2017).</li>
<li>Zhang, S., Roche, K., Nasheuer, H. P., Lowndes, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+histones+by+sugar+%CE%B2-N-acetylglucosamine+%28GlcNAc%29+occurs+on+multiple+residues%2C+including+histone+H3+serine+10%2C+and+is+cell+cycle-regulated%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modification of histones by sugar β-N-acetylglucosamine (GlcNAc) occurs on multiple residues, including histone H3 serine 10, and is cell cycle-regulated.</a> J Biol Chem. 286 (43), 37483-37495 (2011).</li>
<li>Perri, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+proteomics+reveals+novel+post-translational+modifications+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Histone proteomics reveals novel post-translational modifications in breast cancer.</a> Aging. 11, 11722-11755 (2019).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Omenn, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+the+human+proteome+reaches+a+major+milestone%3A+%3E90%25+of+predicted+human+proteins+now+credibly+detected%2C+according+to+the+HUPO+human+proteome+project%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Research on the human proteome reaches a major milestone: >90% of predicted human proteins now credibly detected, according to the HUPO human proteome project.</a> J Proteome Res. 19 (12), 4735-4746 (2020).</li>
<li>Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+characterization+of+histones+in+clinical+samples%3A+applications%2C+progress%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges.</a> FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).</li>
<li>Starkova, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+profile+of+post-translational+modifications+of+histone+H1+in+chromatin+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">The profile of post-translational modifications of histone H1 in chromatin of mouse embryonic stem cells.</a> Acta Naturae. 11 (2), 82-91 (2019).</li>
<li>García-Giménez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+carbonylation+occurs+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Histone carbonylation occurs in proliferating cells.</a> Free Radic Biol Med. 52 (8), 1453-1464 (2012).</li>
<li>García-Saura, A. G., Schüler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP10+multi-site+auto-+and+histone+MARylation+visualized+by+acid-urea+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">PARP10 multi-site auto- and histone MARylation visualized by acid-urea gel electrophoresis.</a> Cells. 10, 654(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,4-Ditioeritritol</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>D8255;</td><td>Reagente para manutenção &minus; Grupos SH no estado reduzido; reduz quantitativamente os dissulfetos.</td></tr><tr><td>Tampão Tris-HCL 1,5 M, pH 8.8</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0798</td><td>Tampão de Gel Resolvente</td></tr><tr><td>10x Tris/Glicina/SDS&nbsp;</td><td>BIO-RADA</td><td>1610772</td><td>Use este tampão de corrida 10x Tris/glicina/SDS pré-misturado para separar amostras de proteína por SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>33539</td><td>2-Propanol (Isopropanol) é um álcool secundário. Ele foi testado como um substituto do combustível para uso em várias células de combustível. O pó de CuO dissolvido em 2-propanol tem sido usado para a síntese assistida por ablação a laser de colóides de. A suspensão de 2-propanol com Zn(NO3)2 tem sido empregada para a fabricação de fotoânodo de aço inoxidável revestido de dióxido de titânio (P25-TiO2/SS) revestido com uma camada uniformemente espessa de P25-TiO2.</td></tr><tr><td>Solução de Acrilamida 30%/Bis&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1610158</td><td>2,6% Crosslinker. Reagente de pureza de eletroforese</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Glacial Carlo Erba Reagennts</td><td>401392</td><td>O ácido acético é um importante reagente químico com muitas aplicações industriais.</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Panreac Applichem</td><td>211007.1214</td><td>Acetona&nbsp; é um solvente, conhecido por sua versatilidade em várias aplicações de laboratório, fabricação e limpeza.</td></tr><tr><td>Acetonitile</td><td>VWR</td><td>83640320</td><td>para HPLC&nbsp; &nbsp; Grau LC-MS</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td>Agarose&nbsp; é a&nbsp; heteropolissacarídeo&nbsp; frequentemente usado em biologia molecular.</td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A6141</td><td>mínimo 99,0%</td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A3678</td><td>Para biologia molecular, para eletroforese, &ge; 98%&nbsp;</td></tr><tr><td>Bioruptor mais</td><td>Diagenode</td><td>B01020001 - B01020002- B01020003</td><td>sonicator</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>D9163-5G</td><td>Agente redutor usado para reduzir ligações dissulfeto em proteínas.</td></tr><tr><td>Kit de Mancha de Prata Dodeca&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0480</td><td>O kit de coloração de prata Dodeca é fácil de usar para a detecção de níveis de proteínas nonagrama em géis de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>GE - Ciências da Vida em Saúde</td><td>171325010L</td><td>O glicerol é um composto triol simples, está envolvido para auxiliar na fundição de géis gradientes, estabilizador de proteínas e componente tampão de armazenamento.</td></tr><tr><td>Halt Inibidor de Fosfatase&nbsp;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>78428</td><td>Thermo Scientific Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail preserva o estado de fosforilação das proteínas durante e após a lise celular ou extração de proteínas teciduais&nbsp; Coquetel de uso único (100X).&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Inibidor de Protease Halt</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>78430</td><td>Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) são soluções estoque concentradas prontas para uso de inibidores de protease para adição a amostras para prevenir a degradação proteolítica durante a lise celular e extração de proteínas. Coquetel de uso único (100X).&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H1758</td><td>BioReagent, para biologia molecular</td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I6125</td><td>&ge; 99% (NMR), cristalino</td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541</td><td>Cloreto de potássio, KCl, é&nbsp; geralmente usado em rotinas de laboratório. Seu uso como tampão de armazenamento para eletrodos de pH e como solução de referência para medições de condutividade está bem estabelecido.</td></tr><tr><td>Linha celular MCF10</td><td>atcc</td><td>CRL-10317&nbsp;</td><td>linhagem de células epiteliais que foi isolada em 1984 da glândula mamária de uma mulher branca, de 36 anos, com mamas fibrocísticas. Esta linha celular foi depositada pela Michigan Cancer Foundation.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>208337</td><td>O cloreto de magnésio é um sólido cristalino incolor.</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametiletileno-diamina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T9281</td><td>Para Eletroforese, aprox. 99%</td></tr><tr><td>Tampão de fosfato salino 1X</td><td>Corning</td><td>15373631</td><td>1 X PBS (solução salina tamponada com fosfato) é&nbsp; um buffer&nbsp; solução salina balanceada&nbsp; Usado para uma variedade de aplicações biológicas e de cultura de células, como lavar células antes da dissociação, transportar células ou tecidos, diluir células para contagem e preparar reagentes.</td></tr><tr><td>Hexacianoferrato de potássio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>60299</td><td>Aceptor de elétrons, empregado em sistemas envolvendo transporte de elétrons,</td></tr> <tr><td>Solução SDS 20% (p/v)&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0418</td><td>Dodecil sulfato de sódio. Reagente de pureza de eletroforese</td></tr><tr><td>Tiossulfato de sódio, ReagentPlus 99%</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>21,726-3</td><td>Tiossulfato de sódio, ReagentPlus 99%</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339741</td><td>Ácido Sulfúrico, Reagente, é&nbsp; um ácido extremamente corrosivo que vem como um líquido amarelado ligeiramente viscoso. É solúvel em água e é um ácido diprótico. Possui propriedades corrosivas, desidratantes e oxidantes muito fortes, além de ser higroscópica.</td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T6399-5G</td><td>O ácido tricloroacético (TCA) é&nbsp; Usado como reagente para a precipitação de proteínas1,2 e ácidos nucléicos3.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Riedel-de Ha&euml; n</td><td>34957</td><td>Ácido trifluoroacético</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>T9284-1L</td><td>Triton X-100 é um surfactante de polioxietileno não iônico que é mais frequentemente usado para extrair e solubilizar proteínas.</td></tr><tr><td>Tripsina do pâncreas suíno</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T6567</td><td>Grau de proteômica, BioReagente, Dimetilado</td></tr><tr><td>UREIA</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>33247</td><td>A ureia é um agente caotrópico e é usada para desnaturação de proteínas. Ele perturba as ligações de hidrogênio na estrutura secundária, terciária e quaternária das proteínas. Também pode perturbar a ligação de hidrogênio presente na estrutura secundária do DNA</td></tr></tbody></table>

revelando proteoformas de histonas usando eletroforese em gel 2d-tau

Unveiling Histone Proteoforms using 2D-TAU Gel Electrophoresis

Na Figura 1A, é possível observar como as proteínas histonas migram em um gel 1D. Este é um passo preliminar importante para entender o tempo de execução da primeira dimensão. Uma vez determinado o tempo certo de separação, execute a segunda dimensão. O mapa 2D das proteoformas das histonas mostra um padrão topográfico distinto (Figura 1B). Cada ponto na Figura 1B representa um tipo específico de histona. Observe a região exata do gel onde cada histona proteoforma pode ser encontrada. A identificação por espectrometria de massas para cada proteoforma histona é relatada em Perri et al.32. Portanto, cada ponto nesta condição está associado a um tipo específico de histona. A presença de pontos adicionais, ao lado dos canônicos, pode indicar a existência de novas modificações. As imagens de gel podem ser adquiridas usando densitometria e a imagem resultante pode ser analisada usando software de análise de imagem.
A confiabilidade do mapa 2D TAU depende da rotundidade do local. Se a corrida tiver sido realizada corretamente, os pontos aparecerão como sinais distintos e nenhuma faixa horizontal e vertical será visível. Por outro lado, impurezas na amostra, soluções e sobreposição de agarose podem causar estrias e/ou listras no gel. A qualidade do gel terá impacto na digitalização da imagem e na análise quantitativa e qualitativa a seguir. Além disso, pode influenciar o sucesso da análise de Western Blot e das investigações de EM. Para verificar a confiabilidade do método, sondamos a membrana de nitrocelulose de proteoformas histonas resolvidas com o anticorpo primário Acetilada-Lisina (Ac-K2-100) Rabbit mAb32 (Figura 2). Um anticorpo secundário anti-HRP de coelho foi usado para detectar sinais de histonas. Como esperado, usando um densitômetro, é possível quantificar a modificação pós-traducional peculiar em cada variante de histona presente no blot.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67321/67321fig01.jpg"> 
Figura 1: 1D e 2D TAUgel. (A) Imagem representativa do padrão topográfico de histonas obtida usando 1D TAUgel. (B) Imagem representativa do padrão topográfico das histonas obtido usando 2D TAUgel. As identificações dos dados são relatadas por Perri et al. 32. Como esperado, cada ponto representa uma histona proteoforme específica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67321/67321fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67321/67321fig02.jpg"> 
Figura 2: Western blot 2DTAU representativo. Na imagem, é possível observar o nível de acetilação da lisina em cada proteoforma histona. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67321/67321fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagentes</td>
			<td>Concentração: 15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% de acrilamida/bis</td>
			<td>3.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5 M Tris pH 8,8</td>
			<td>2,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Água MilliQ</td>
			<td>3,6 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% APS</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Composição da solução de gel de resolução.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Passo</td>
			<td>Hora</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixação de 50% de metanol / 5% de ácido acético</td>
			<td>1 h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lave o etanol 30%</td>
			<td>2 x 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lave a água deionizada</td>
			<td>1 x 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagente de tiossulfato sensibilizador</td>
			<td>1 minuto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lave a água deionizada</td>
			<td>3 x 20 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prata Nitrato de prata</td>
			<td>30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lave a água deionizada</td>
			<td>3 x 1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desenvolvedor de Desenvolvimento</td>
			<td>25-30 min Nota: Desenvolver o gel até que as manchas fiquem visíveis (castanho claro)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solução de parada</td>
			<td>1 x 10 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lave a água deionizada</td>
			<td>2 x 5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lave a água deionizada</td>
			<td>1 h</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Método de coloração de prata.

Revelando proteoformas de histonas usando eletroforese em gel 2D-TAU

Histones undergo various post-translational modifications (PTMs) such as methylation, acetylation, phosphorylation, acylation, and ubiquitination, which ...

unveiling-histone-proteoforms-using-2d-tau-gel-electrophoresis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo descreve um protocolo para avaliar o estado de fosforilação da proteína tau por um ensaio de fosfatase em células de câncer colorretal. A enzima fosfatase atua nos grupos fosfato presentes na proteína tau, aumentando a mobilidade da proteína tau no gel SDS PAGE em comparação com as amostras de proteína tau não tratadas.

Ensaio de fosfatase em células CRC: um método para examinar o estado de fosforilação da proteína Tau em células de câncer colorretal

Este vídeo demonstra o uso de técnicas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) para identificar múltiplas fosforilações em uma proteína. A fosforilação de uma proteína em aminoácido específico causa a desblindagem do hidrogênio amida vizinho, que gera a diferença espectral.

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para Identificar Múltiplas Fosforilações em Proteínas

Fonte: Bennett, S. A., et al., Caracterizando alterações de modificação pós-tradução de histonas em modelos de proteinopatia neurodegenerativa de levedura. J. Vis. Exp. (2019). Este vídeo demonstra o procedimento de avaliação de modificações de histonas em células de levedura que superexpressam proteínas neurodegenerativas. As etapas incluem lise celular, centrifugação, eletroforese, transferência de membrana e detecção baseada em anticorpos de histonas modificadas.

Detecção de modificações de histonas em células de levedura com superexpressão de proteínas neurodegenerativas

Um protocolo de extração de proteínas comum utilizando tampão uréia / tiouréia / SDS para tecido cerebral humano e camundongos permite indentification de proteínas por 2D-DIGE e sua posterior caracterização por mini-immunoblotting 2DE. Este método permite a obtenção de resultados mais reprodutíveis e confiáveis ​​a partir de biópsias humanos e modelos experimentais.

Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Descrevemos aqui um método para identificar fosforilações múltiplas de uma proteína intrinsecamente desordenada por Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), usando a proteína Tau como estudo de caso. A Tau recombinante é isotopicamente enriquecida e modificada in vitro por uma quinase antes da aquisição e análise dos dados.

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para a identificação de múltiplas fosfolarização de intrinsecamente desordenados Proteínas

flexibilidade conformacional desempenha um papel crucial na função da proteína. Aqui, nós descrevemos o uso de espectrometria de massa por ionização por electropulverização resolvida no tempo acoplado a troca de hidrogénio-deutério para sondar as rápidas mudanças estruturais que conduzem a função de proteínas ordenadas e desordenadas.

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Este manuscrito descreve protocolos padrão para medir a tau hyperphosphorylation, medindo a vinculação de tau de microtúbulos e localização de tau intracelular após tratamentos com drogas. Estes protocolos podem ser usados repetidamente para triagem de drogas ou outros compostos que se destinam a ligação de hyperphosphorylation ou microtubule tau.

Ensaio para fosforilação e vinculação de Microtubule juntamente com a localização da proteína Tau em células de cancro colo-rectal

Aqui, apresentamos uma eletroforese em gel bidimensional (2DE) acoplada com espectrometria de massa (MS) para separar e identificar adenoma de hipófise humana tecido proteome, que apresenta um padrão de 2DE bom e reprodutíveis. Muitas proteínas são observadas em cada ponto de 2DE quando analisando proteome complexo de câncer com o uso de MS de alta sensibilidade.

Eletroforese em Gel bidimensional juntamente com métodos de espectrometria de massa para uma análise do proteoma de tecido humano Adenoma de hipófise

Este protocolo descreve procedimentos experimentais para caracterizar todo o genoma de alterações nos níveis de modificações borne-translational do histone (PTM) ocorrendo em relação a superexpressão de proteínas associadas com a ALS e a doença de Parkinson em Modelos de Saccharomyces cerevisiae . Após a separação de SDS-PAGE, níveis PTM histona individuais são detectados anticorpos específicos de modificação através da mancha ocidental.

Caracterizando a histona modificação pós-traducional alterações nos modelos de Neurodegenerative Proteinopathy de levedura

Tau é uma proteína neuronal presente tanto no citoplasma, onde liga microtúbulos, e no núcleo, onde exerce funções não convencionais, incluindo a modulação dos genes relacionados à doença de Alzheimer. Aqui, descrevemos um método para investigar a função do tau nuclear, excluindo quaisquer interferências provenientes de Tau citoplasmamic.

Modulação da localização subcelular tau como uma ferramenta para investigar a expressão de genes relacionados à doença

Aprenda a caracterizar proteoformas de histonas usando eletroforese 2D-TAU e espectrometria de massa. Este método avança a compreensão das mudanças epigenéticas e suas implicações no tratamento do câncer.

Revelando proteoformas de histonas usando eletroforese em gel 2D-TAU

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