Quantificando a modulação da atividade da enzima elastase por meio de análise colorimétrica

O escopo de nossa pesquisa se concentra no desenvolvimento de compostos reativos naturais. Assim, utilizando um método in vitro, pretendemos avaliar a atividade da elastase, uma enzima envolvida na degradação da elastina e na perda de elasticidade, a fim de restaurar a homeostase do tecido. A quantificação de extratos naturais de plantas, a atividade, apresenta vários desafios, principalmente relacionados à sua composição química complexa e sua coloração muitas vezes forte que pode interferir em medições comuns.

O desenvolvimento de protocolos adaptativos confiáveis é vital para o avanço desse campo de pesquisa. Nosso estudo oferece vários benefícios para os campos, incluindo simplicidade, sensibilidade, resultado rápido de tensão e adaptabilidade a diferentes necessidades de pesquisa. Para começar, pesar a quantidade adequada de base Tris usando uma balança analítica e transferir a base Tris pesada para um béquer.

Adicionando água deionizada ao copo utilizando um cilindro graduado. Agite a solução com um agitador magnético até que a base Tris esteja completamente dissolvida. Em seguida, ajuste o pH da solução para oito usando quatro ácidos clorídricos normais.

Uma vez atingido o pH desejado, transferir a solução para um balão volumétrico. Utilizando água desionizada, encher o balão até ao volume marcado. Transfira o tampão preparado para um frasco de armazenamento rotulado e guarde-o em temperatura ambiente.

Para a preparação da amostra, pese com precisão a quantidade necessária de amostra usando uma balança analítica. Dissolva a amostra no tampão de reação preparado para atingir a concentração desejada. Use um misturador de vórtice para dissolver totalmente a amostra.

E armazene a amostra preparada no gelo. Em seguida, preparar uma solução de trabalho da enzima elastase em tampão de reacção até uma concentração final de 10 microgramas por mililitro. Armazene a solução de elastase no gelo até que esteja pronta para uso.

Agora prepare uma solução SANA 0,8 milimolar em tampão de reação. Proteja a solução da luz e guarde-a a quatro graus Celsius até o uso. Para o fluoreto de fenilmetanossulfonil, ou estoque de PMSF, prepare uma solução de PMSF a 100 milimolares em isopropanol.

Armazene a solução preparada no gelo. Preparar todas as reacções em triplicado utilizando tubos de microcentrífuga. Incube todos os tubos em temperatura ambiente por 20 minutos.

Em seguida, adicione 100 microlitros da solução de substrato SANA a cada tubo, exceto para os controles de cores. Inverta suavemente os tubos várias vezes para misturar as amostras e transfira 300 microlitros de cada tubo para uma placa de 96 poços, garantindo medições triplicadas para cada amostra. Finalmente, coloque a placa de 96 poços em um leitor de microplacas ajustado para 410 nanômetros e meça a absorbância periodicamente, a cada minuto por 20 minutos ou até que o sinal se estabilize à temperatura ambiente.

O extrato um mostrou atividade inibitória de elastase fraca, mas significativa, nas concentrações de um, 0,75 e 0,5 miligramas por mililitro, sem efeito significativo em 0,25 miligramas por mililitro. O extrato dois demonstrou alta atividade inibitória da elastase em todas as concentrações testadas, com níveis de inibição semelhantes ao controle positivo em um, 0,75 e 0,5 miligramas por mililitro.