Imagem longitudinal intravital da dinâmica vascular na medula óssea da calvária

Esta pesquisa tem como foco a compreensão da dinâmica vascular no macroambiente da medula óssea por meio de microscopia intravital, com o objetivo de revelar como os vasos sanguíneos respondem à hematopoiese normal e patológica. Usamos tecnologias avançadas de imagem, como fotomicroscopia, modelos animais transgênicos e analisamos um traçador para visualizar e quantificar mudanças vasculares dinâmicas em tecidos vivos ao longo do tempo. O principal avanço é um refinamento de nosso protocolo para melhorar o bem-estar animal e alinhar com os três Rs. Nossa abordagem longitudinal minimiza as etapas cirúrgicas e reduz significativamente o número de animais necessários para nosso estudo.

Nosso protocolo atende à necessidade de imagens intravitais não tóxicas e de longo prazo usando um microscópio de dois fótons, que permite a penetração profunda do tecido e a visualização de alta resolução do comportamento e interação celular. O uso do implante de cabeça impresso em 3D tornará muito fácil encontrar a área de interesse durante a sessão de imagem longitudinal sem o objetivo de alterar a altura, o ângulo ou a ordem. Atualmente, estamos usando este protocolo para rastrear subtipos endoteliais específicos e sua resposta ao desenvolvimento de leucemia e tratamento medicamentoso para entender melhor sua contribuição na patogênese da doença.

Para começar, inicie o software de segmentação e importe os arquivos DICOM micro-CT para isolar o crânio. Realize a segmentação baseada em limiar para separar o tecido ósseo das estruturas circundantes. Ajuste manualmente regiões complexas ou ruidosas para refinar a segmentação.

No 3D Slicer, importe os arquivos DICOM e carregue o conjunto de dados. Observe os cortes de TC nas incidências axial, sagital e coronal. Abra o editor de segmentos e clique em Adicionar para criar uma nova segmentação e, em seguida, clique em adicionar novamente para criar um novo segmento para limite.

No painel do editor de segmentos, clique no efeito de limite. Ajuste os controles deslizantes de limite inferior e superior ou insira valores numéricos para destacar a região segmentada em vermelho. Para exportar o crânio segmentado como um arquivo stl, alterne para o módulo de segmentação.

Certifique-se de que o segmento com limite esteja selecionado. Na seção exportar/importar modelos e mapas de rótulos, defina o tipo de exportação como modelos e o formato de arquivo como stl e clique em exportar para salvar o arquivo. Para a preparação do modelo de crânio em CAD, primeiro importe o modelo de crânio simplificado no formato stl para o software CAD como uma nova peça ou modelo.

No plano mediano, crie um eixo tangencial à calvária e salve o modelo de crânio preparado. Crie um esboço no plano da calvária e projete uma spline em forma de pêra de AP mais 6,5 a menos dois. Com uma largura de seis milímetros em AP 0,0, este será o contorno da superfície observável.

Projete a cauda do implante garantindo que ele esteja em conformidade com a estrutura do crânio para uma fixação adequada, respeitando o volume disponível. Por fim, crie uma capa protetora para proteger a janela de observação quando não estiver em uso. Coloque um mouse anestesiado em uma almofada de aquecimento ajustada para 37 graus Celsius e monitore visualmente a frequência respiratória.

Raspe a cabeça do mouse com um barbeador elétrico. Em seguida, aplique uma gota de gel oftálmico nos olhos do camundongo. Certifique-se de que todos os pelos sejam removidos para evitar artefatos de imagem e reduzir o risco de infecção da ferida.

Agora, use uma pinça e tesoura estéreis para fazer uma pequena incisão na porção central do couro cabeludo para expor a cicatriz óssea central. Remova o tecido conjuntivo entre o crânio e o couro cabeludo. Misture cimento dental suficiente em uma placa de Petri para fazer uma pasta.

Aplique-o rapidamente na parte inferior do implante de fixação da cabeça. Sem permitir que o cimento dentário entre na área de imagem, coloque o suporte da cabeça no crânio exposto e deixe-o endurecer. Ligue o fluxo de isoflurano em direção à máscara estereotáxica do microscópio.

Agora, traga o mouse rapidamente para o microscópio. Insira cuidadosamente os dentes do mouse na máscara para garantir a penetração adequada do isoflurano, levantando o nariz com uma mão. Enquanto segura o mouse com uma mão, deslize suavemente a cauda de andorinha do implante de fixação da cabeça no suporte de fixação usando a outra mão.

Prenda-o com meia volta do botão do parafuso. Em seguida, introduza uma sonda retal pré-embutida com um gel à base de água para monitorar a temperatura do mouse. Encha a câmara de imagem da cabeça com uma grande quantidade de gel à base de água, ou PBS.

Abaixe a objetiva de imersão em água até que esteja totalmente imersa para excitação ideal e detecção de sinal durante a excitação de dois fótons. Mova o estágio x, y e a unidade z para focar no osso central na cicatriz do andaime. Identifique o tecido marcado pela superfície óssea e veia central.

Apague a luz da sala e feche a caixa ao redor do suporte do microscópio. Depois de ativar os detectores não TOSCAN. Defina PMT1 para detectar o segundo SHG em 423 a 461 nanômetros, D2 alto para GFP em 485 a 548 nanômetros e D3 alto para TD D'Amato em 551 a 645 nanômetros.

Deixe o deslocamento em zero. Agora, defina o ganho PMT SHG para 850 volts e os ganhos altos de D em 100%Aumente a potência do laser infravermelho até que uma imagem com uma faixa dinâmica de 200 níveis de cinza seja visível no mais baixo dos três canais. No software de aquisição, a região localizadora contendo bolsas de medula óssea, indicada envolta nas superfícies ósseas.

Para identificar diferentes regiões de interesse, ou ROIs, ative o Loss Navigator e crie uma visão geral usando o modo espiral. Clique no ícone de imagem única para registrar as posições de ROI selecionadas e renomear cada posição na lista de tarefas. Para adquirir um volume de pilha Z, selecione o modo de pilha Z e defina o tamanho da etapa em três micrômetros.

Desmarque a opção de mesmo tamanho de pilha para todas as regiões e pressione begin para iniciar e end para terminar. Após a captura, clique em redefinir pilha. Pressione start para iniciar a coleta de imagens e salve as imagens na pasta apropriada.

Para medir uma característica dinâmica, como permeabilidade vascular, altere o modo de aquisição para XYZT para adquirir um lapso de tempo. No módulo T, ajuste o intervalo de tempo para três minutos e a duração para uma hora. Agora, injete 100 microlitros de 70 kilodalton Dextran TRITC por via intravenosa a uma concentração de quatro miligramas por mililitro e inicie a aquisição.

Depois de transferir o camundongo para uma marca de cirurgia em uma almofada de aquecimento de 37 graus Celsius, aplique gel intrasite no crânio para mantê-lo hidratado. Feche a área de imagem do implante de cabeça com a tampa específica e prenda cuidadosamente a tampa com um parafuso. Coloque o mouse na caixa de aquecimento ajustada para 37 graus Celsius e espere que ele desperte.

Assim que o rato estiver totalmente recuperado, transporte-o para a instalação animal e aloje-o em uma gaiola limpa com hidrogel e enriquecimento ambiental. Para aquisições longitudinais, coloque uma pequena gota de gel oftálmico nos olhos de um camundongo com um suporte de cabeça já instalado. Obtenha a imagem de visão geral conforme demonstrado anteriormente.

Se necessário, realinhe as imagens anteriores e novas usando o módulo carregar e alinhar imagem. Abra a imagem de captura de tela para marcar as posições em seu lugar original. O modelo CAD de um implante de fixação de cabeça de titânio foi projetado para se adequar à estrutura anatômica do crânio, garantindo uma fixação estável ao estágio do microscópio para imagens em nível celular.

O implante foi fixado com sucesso ao crânio do camundongo e permitiu imagens estáveis ao longo do tempo, permitindo que o camundongo mantivesse as atividades normais. A vasculatura da medula óssea da calvária foi visualizada por meio de uma varredura em blocos, revelando uma complexa rede de arteríolas, capilares de transição e sinusóides. A análise quantitativa dos vasos demonstrou segmentação das estruturas vasculares, permitindo a medição do diâmetro, comprimento e retidão dos vasos e sua correlação.

A imagem longitudinal capturou a remodelação progressiva da vasculatura da calvária durante a progressão da leucemia com aumento da densidade vascular observada ao longo do tempo. A permeabilidade vascular foi avaliada dinamicamente, mostrando retenção diferencial de corante fluorescente ao longo do tempo, exibindo permeabilidade diferencial de diferentes vasos da medula óssea.