Name: Imagem longitudinal intravital da dinâmica vascular na medula óssea da calvária (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprenda a imagem intravital longitudinal da dinâmica vascular na medula óssea da calvária usando microscopia de dois fótons. Este método permite visualizar alterações vasculares em tecido vivo ao longo do tempo.

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<ol><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li>
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<li>Itkin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+bone+marrow+blood+vessels+differentially+regulate+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis.</a> Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).</li>
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<li>Upadhaya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+reveals+motility+of+adult+hematopoietic+stem+cells+in+the+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging reveals motility of adult hematopoietic stem cells in the bone marrow niche.</a> Cell Stem Cell. 27 (2), 336-345.e4 (2020).</li>
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<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLT3+inhibitors+upregulate+CXCR4+and+E-selectin+ligands+via+ERK+suppression+in+AML+cells+and+CXCR4%2FE-selectin+inhibition+enhances+anti-leukemia+efficacy+of+FLT3-targeted+therapy+in+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">FLT3 inhibitors upregulate CXCR4 and E-selectin ligands via ERK suppression in AML cells and CXCR4/E-selectin inhibition enhances anti-leukemia efficacy of FLT3-targeted therapy in AML.</a> Leukemia. 37 (6), 1379-1383 (2023).</li>
<li>Pendleton, E. G., Tehrani, K. F., Barrow, R. P., Mortensen, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+harmonic+generation+characterization+of+collagen+in+whole+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Second harmonic generation characterization of collagen in whole bone.</a> Biomed Opt Express. 11 (8), 4379-4396 (2020).</li>
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<li>Horton, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukemia+induced+by+MLL-ENL+is+cured+by+oncogene+ablation+despite+acquisition+of+complex+genetic+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukemia induced by MLL-ENL is cured by oncogene ablation despite acquisition of complex genetic abnormalities.</a> Blood. 113 (20), 4922-4929 (2009).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683(2014).</li>
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<li>Le, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+longitudinal+visualization+of+bone+marrow+engraftment+process+in+mouse+calvaria+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">In vivo longitudinal visualization of bone marrow engraftment process in mouse calvaria using two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 7, 44097(2017).</li>
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<li>Kolabas, Z. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+molecular+profiles+of+skull+bone+marrow+in+health+and+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct molecular profiles of skull bone marrow in health and neurological disorders.</a> Cell. 186 (17), 3706-3725.e9 (2023).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Amira</td><td>Thermo ScientificTM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anestesia</td><td></td><td></td><td>Isoflurano 2% a 3%</td></tr><tr><td>Máscara anestésica (detecção de animais)</td><td>Minerve</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unidade de anestesia</td><td>Minerve</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze</td><td>Laboratórios Jackson</td><td>MGI:3809523</td><td></td></tr><tr><td>CalvariaVue</td><td>Ymetry</td><td>https://ymetry.com/site/head-fixation-implants/44-mouse-head-fixation-implant-for-calvaria.html</td><td></td></tr><tr><td>Cimento dentário</td><td>Kemdent</td><td>SOL 527</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano 500 kDa-Cy5&nbsp;</td><td>Tebu-bio</td><td>DX500-S5-1</td><td>3 mg/camundongo</td></tr><tr><td>Dextrano 70 kDa-TRITC</td><td>Sigma</td><td>T1162</td><td>3 mg/camundongo</td></tr><tr><td>Desinfetante</td><td>MP-Labo</td><td>Dermidina-60ml</td><td></td></tr><tr><td>Barbeador</td><td>Aescular</td><td>Ísis</td><td></td></tr><tr><td>Gel para os olhos</td><td>Gel de ócrio</td><td>10 ouros</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td>v 17 30 de maio</td><td></td></tr><tr><td>Plugues de Fiji para ponte com Imaris</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td>Imaris_Bridge96.jar ; ImarisBridgeUtils.jar</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de aquecimento&nbsp;</td><td>Tâmaras e</td><td>Termacage</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento para cirurgia</td><td>Minerve</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento de imagem e Sonda retal</td><td>F. Haer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris v9.6.0</td><td>Instrumentos Oxford</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel intrassítio</td><td>Chinoxia</td><td>2390766</td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Software</td><td>Leica</td><td>LAS X 3.5.7.23225</td><td></td></tr><tr><td>Medicação</td><td></td><td></td><td>Buprecare, 0,01 mg/kg</td></tr><tr><td>Objetiva HCX IRAPO L 25x/0,95 ÁGUA</td><td>Leica</td><td>506374</td><td></td></tr><tr><td>Tampão salino (PBS 1x)</td><td>Sigma</td><td>Pág. 4417</td><td>Esterilizar por autoclave</td></tr><tr><td>Microscópio Multifotônico SP8 DIVE FALCON&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máscara estereotóxica</td><td>Minerve</td><td>1201261</td><td></td></tr><tr><td>Grânulos esterilizadores</td><td>Sigma</td><td>Z742555</td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas cirúrgicas</td><td>Moria</td><td>4877A; 2183</td><td></td></tr><tr><td>Manta de sobrevivência</td><td>SECURIMED</td><td>11006</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes / Lenços</td><td></td><td></td><td>Esterilizar por autoclave</td></tr><tr><td>Seringa 1 mL 26 G</td><td>BD Plastipak</td><td>305501</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>F. Haer</td><td>40-90-5D-02</td><td></td></tr><tr><td>Tg(Nes-EGFP)33Camundongos Enik&nbsp;</td><td>Laboratórios Jackson</td><td>MGI:5523870</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos Tg(Pdgfb-icre/ERT2)1Frut</td><td>Laboratórios Jackson</td><td>MGI:3793852</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos Tg(Cdh5-cre/ERT2)1Rha</td><td>Laboratórios Jackson</td><td>MGI:3848982</td><td></td></tr><tr><td>Gel de ultrassom</td><td>Laboratórios Parker</td><td>Aquasônico 100</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem longitudinal intravital da dinâmica vascular na medula óssea da calvária

Intravital Longitudinal Imaging of Vascular Dynamics in the Calvarial Bone Marrow

Na Figura 1 e na Figura 2, é mostrado o modelo CAD de um implante de fixação de cabeça de titânio posicionado em um crânio de camundongo digitalizado, projetado para seguir a estrutura anatômica do crânio e fornecer um dispositivo leve e biocompatível capaz de segurar firmemente o estágio do microscópio, garantindo a estabilidade do nível celular. Seguindo este protocolo passo a passo, o implante é fixado de forma estável ao crânio do camundongo e pode ser firmemente preso ao suporte do microscópio por sua cauda de andorinha, permitindo uma área de imagem plana para retenção de líquidos e observação intravital ao longo do tempo. Pode ser fechado com uma tampa para minimizar qualquer dano ou infecção da ferida, permitindo imagens repetidas da mesma área de tecido ao longo de semanas. Uma vez acordado, o camundongo que usa um implante de cabeça pode andar livremente, se alimentar e ter uma rotina regular.
A Figura 3 mostra uma visão de varredura em bloco da vasculatura da MO da calvária feita de capilares heterogêneos, incluindo arteríolas, capilares de transição e sinusóides. Os vasos são incorporados em um microambiente de tecido complexo em contato próximo com a superfície óssea e as células mesenquimais perivasculares. Durante o desenvolvimento da leucemia, células leucêmicas isoladas podem ser detectadas no microambiente da MO nas proximidades dos vasos, e seu enxerto aumenta com o tempo, preenchendo a calvária nos estágios finais da doença.
A Figura 4 mostra como as imagens obtidas com esse protocolo podem fornecer dados quantitativos, que podem ser analisados com métodos estatísticos. Mostramos como segmentar vasos com a ferramenta de filamento IMARIS e medir o comprimento e o diâmetro dos fragmentos vasculares, bem como sua retidão. A correlação desses parâmetros também pode ser avaliada.
A Figura 5 mostra a aquisição de imagens longitudinais de duas posições diferentes da MO da calvária durante a progressão da LMA nos dias 4, 7 e 10, com o dia 10 sendo associado a um enxerto de ~ 50% da MO com células leucêmicas, conforme medido por citometria de fluxo (não mostrado). Podemos observar um importante remodelamento do tamanho dos vasos preexistentes, bem como a formação de novos vasos em áreas específicas associadas à perda óssea local.
Finalmente, na Figura 6, mostramos como a permeabilidade vascular pode ser medida como um parâmetro dinâmico com imagens de lapso de tempo mostrando a capacidade de diferentes barreiras vasculares de reter um corante fluorescente ao longo do tempo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67332/67332fig01.jpg"> 
Figura 1: Projeto e produção de um suporte de cabeça biocompatível à base de titânio. (A) Partes do implante in situ: 1 anel de observação, 2 características de cimentação, 3 âncoras estabilizadoras, 4 caudas, 5 caudas de andorinha, 6 furos roscados, 7 Bregma. (B) Conexão do implante de cabeça ao suporte: 8 corpo de fixação, 9 braçadeira, 10 alavanca excêntrica, 11 estrutura, 12 objetiva de microscópio. (C) Deformação do implante contra carga por simulação FEM, onde o deslocamento máximo é de 0,23 μm contra 0,04 N de força. (D) Tampa de proteção e seu parafuso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/67332fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67332/67332fig02.jpg"> 
Figura 2: Preparação do camundongo para imagens intravitais. (A) Vista do implante de cabeça e da área de imagem exposta cirurgicamente antes da imagem. (B) Implante de cabeça firmemente preso ao crânio do camundongo. (C) Rato acordado na gaiola de recuperação com a tampa fechada no implante da cabeça. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/67332fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67332/67332fig03.jpg"> 
Figura 3: Imagem intravital da vasculatura da calvária. (A) projeção z da visão de varredura em bloco da vasculatura da calvária marcada por cdh5-DSRED. (B) Amplie as áreas representadas para descrever diferentes tipos de vasos representados por setas, arteríolas por setas vermelhas, capilares de transição por setas laranja, sinusóides por setas amarelas. (i) e (ii) projeções z de tecido X μm; (iii) fatia única. (C) Cortes únicos de vários campos de visão dos vasos da MO, mostrando a superfície óssea (SHG), as células perivasculares (nes-GFP+) e o lúmen vascular (dextrana-TRITC). (D) Nicho vascular associado à progressão da LMA. Fatias representativas dos pontos de tempo iniciais (superiores) e tardios (inferiores) do desenvolvimento da LMA. A leucemia MLL-AF9 é marcada com tdTOMATO (setas vermelhas), enquanto os vasos são marcados com pdgfb-GFP (setas verdes), a superfície óssea com SHG e os macrófagos em amarelo (autofluorescência, asterisco amarelo). Barras de escala = 200 μm (A), 40 μm (B,D-painel inferior), 50 μm (C). Abreviaturas: MO = medula óssea; GFP = proteína fluorescente verde; LMA = leucemia mieloide aguda; CE = Células endoteliais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/67332fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67332/67332fig04.jpg"> 
Figura 4: Quantificação de parâmetros vasculares. (A) Medição de parâmetros vasculares via ferramenta de filamento IMARIS em uma projeção z representativa de vasos da medula óssea marcados com TRITC-dextrano. As representações de linha e cone são mostradas. (B) Quantificação dos parâmetros do vaso na imagem mostrada em A. (C) Correlação entre os parâmetros vasculares mostrando uma correlação oposta entre a retidão e o comprimento do vaso (negativo, Spearman r = -3523; p &lt; 0,0001; R2 = 0,2102) vs diâmetro (positivo; Spearman r = 0,4110; p &lt; 0,0001; R2 = 0,1299). Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/67332fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67332/67332fig05.jpg"> 
Figura 5: Imagem longitudinal de duas posições diferentes da calvária MO sobre o desenvolvimento da LMA. As células endoteliais que revestem os vasos são marcadas com cdh5-GFP, a superfície óssea com SHG e os macrófagos em amarelo (autofluorescência). Remodelação de vasos preexistentes (setas vermelhas) e formação de novos vasos (setas amarelas) são mostrados. Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/67332fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67332/67332fig06.jpg"> 
Figura 6: Permeabilidade vascular. (A) Esquemas de medição da permeabilidade vascular via ferramenta de superfície IMARIS. (B) Projeção Z da mesma área fotografada longitudinalmente ao longo de 1 h. (C) Quantificação da permeabilidade vascular dentro das áreas conforme descrito em A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/67332fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura Suplementar S1: Crânio preparado. No plano mediano, crie um eixo tangencial à calvária e, em seguida, salve o crânio preparado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/Sup_fig_1_JoVE67332R1_screenfile5_prepared_skull.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar S2: Planos espaçados de 2 mm. Como criar um conjunto de planos igualmente espaçados (espaçamento de 2 mm) ao longo do crânio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/Sup_fig_2_JoVE67332R1_screenfile4_plans_2mm_spaced.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar S3: Contorno de superfície observável. Crie um esboço no plano da calvária e crie uma spline em forma de pêra de AP +6,5 a -2, 6 mm de largura em AP 0,0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/Sup_fig_3_JoVE67332R1_screenfile3_Observable_Surface_Contour.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar S4: Observação vindow. Crie um esboço no plano da calvária e desenhe uma forma C de 0,5 mm de espessura conectando-se à janela de observação . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/Sup_fig_4_JoVE67332R1_screenfile1_1.4.1.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar S5: Clique em novo estudo. Navegue até a guia Simulação (se visível) ou vá para Simulação | Estude. Na caixa de diálogo Estudo , escolha Estático como o tipo de estudo. Clique em OK para criar o novo estudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/Sup_fig_5_JoVE67332R1_screenfile2_clic_new_study.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar S6: Clique com o botão direito do mouse para criar a malha. Refine a malha em áreas onde é esperada alta tensão ou deformação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67332/Sup_fig_6_JoVE67332R1_screenfile6_right_clic_create_mesh.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Imagem longitudinal intravital da dinâmica vascular na medula óssea da calvária

Intravital longitudinal fluorescence microscopy imaging has emerged as a crucial technique for studying dynamic biological processes, notably in the ...

intravital-longitudinal-imaging-vascular-dynamics-calvarial-bone

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Os monócitos são os principais reguladores da imunidade inata e desempenham um papel crítico na renovação do sistema fagocítico mononuclear periférico e em caso de inflamação. Este manuscrito descreve o procedimento de imagem em tempo real da medula óssea da calvária de camundongos para estudar o mecanismo de mobilização de monócitos.

Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos<em&gt; In Vivo</em

Implantação de enxertos ósseos autólogos e alogênicos constituem aceite abordagens para tratar a maior perda óssea craniofacial. No entanto, o efeito da composição do enxerto sobre a interacção entre a neovascularização, a diferenciação celular e a formação de osso não é clara. Nós apresentamos um protocolo de imagiologia multimodal objetivou elucidar a interdependência angiogênese-osteogênese na proximidade do enxerto.

Tomografia Computadorizada e imageamento óptico de acoplamento Osteogenesis-angiogênese para avaliar a integração do osso craniano Autoenxertos e Aloenxertos

Este artigo descreve um método pelo qual a arquitetura vascular no cérebro pode ser quantificada usando microscopia de dois fótons in vivo e ex vivo.

Quantificação de Vascular Cerebral Arquitetura usando dois fótons Microscopia em um modelo de mouse Neuroinflammation induzida por HIV

Este manuscrito descreve um procedimento para controlar a remodelação do cerebrovasculature durante amyloid acúmulo de placa in vivo utilizando microscopia de dois fótons longitudinal. Uma preparação crânio-diluídos permite a visualização de corantes fluorescentes para avaliar a progressão do dano vascular cerebral num modelo de rato da doença de Alzheimer.

Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagens do Cerebrovasculature: Relevância para doenças do SNC

O objetivo deste artigo é apresentar um método que permite uma reconstrução 3-dimensional da árvore vascular em ratos após micro computado tomografia computadorizada e determinação de volumes de segmentos de toda embarcação que podem ser usados para quantificar o vasoespasmo cerebral em modelos de murino de hemorragia subaracnoide.

Um método volumétrico para quantificação de vasoespasmo Cerebral em um modelo murino de hemorragia subaracnoide

Descrevemos aqui o método para imagem de megacaiócitos e proplatelets na medula do osso do crânio de ratos vivos usando microscopia de dois fótons.

In Vivo Imagem de dois fótons de megacariócitos e proplatelets na medula óssea do crânio do rato

Este protocolo apresenta etapas para adquirir e analisar imagens fluorescentes de cálcio de pericytes e dados de fluxo sanguíneo de vasos sanguíneos próximos em camundongos anestesiados. Essas técnicas são úteis para estudos de fisiologia celular mural e podem ser adaptadas para investigar transitórios de cálcio em qualquer tipo de célula.

Imagem pericínica cerebral de cálcio e hemodinâmica em camundongos transgênicos em Vivo

O recrutamento de leucócitos e plaquetas constitui um componente essencial necessário para o crescimento efetivo das artérias colaterais durante a arteriogênese. A microscopia multifóton é uma ferramenta eficiente para rastrear a dinâmica celular com alta resolução espaço-temporal in vivo e menor fototoxicidade para estudar o recrutamento e extravasamento de leucócitos durante a arteriogênese.

Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

Aprenda a imagem intravital longitudinal da dinâmica vascular na medula óssea da calvária usando microscopia de dois fótons. Este método permite visualizar alterações vasculares em tecido vivo ao longo do tempo.

Imagem longitudinal intravital da dinâmica vascular na medula óssea da calvária

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