Estudo Multimodal da Remodelação Cardiovascular Murina: Ultrassom Quadridimensional e Imagem por Espectrometria de Massas

Nosso laboratório usa imagens de ultrassom pré-clínicas para estudar a biomecânica cardiovascular em várias doenças e estados fisiológicos. Também usamos imagens de espectrometria de massa para estudar a distribuição espacial de lipídios no tecido cardiovascular e cerebral. Estamos tentando ver onde no tecido temos mudanças funcionais e moleculares.

Embora técnicas comuns de imagem molecular, como histologia e imuno-histoquímica, possam produzir dados moleculares, elas são limitadas pelas colorações e anticorpos atualmente disponíveis. Por outro lado, a imagem por espectrometria de massa é uma abordagem não direcionada para estudos multiômicos que ainda mantém a integridade espacial do tecido. Com nossa técnica, podemos expandir a multiômica para incluir lipídios, glicanos e peptídeos e acoplá-los a técnicas de imagem funcionais, como ultrassom.

Com essas técnicas, os pesquisadores agora podem combinar imagens funcionais com técnicas de imagens moleculares. Em nosso laboratório, temos duas áreas de foco principais para doenças cardiovasculares, e uma delas é olhar para a remodelação cardíaca com ataques cardíacos ou tratamentos de câncer, portanto, cardiotoxicidade. E nosso segundo grande objetivo cardiovascular é olhar para o envelhecimento e como o envelhecimento afeta a vasculatura.

Para realizar ultrassom quadridimensional cardíaco, coloque o mouse em decúbito dorsal na placa de imagem. Em seguida, coloque o transdutor no suporte em uma posição semitravada. Alinhe o ponto em relevo no transdutor com o ponto azul na tela, posicionando-o em direção ao lado direito do mouse.

Gire o transdutor para alinhar ao longo do plano sagital do mouse com o entalhe elevado apontando caudalmente. Aplique uma quantidade generosa de gel de ultrassom na superfície ventral da cavidade torácica para acoplamento acústico com um transdutor. Abaixe o transdutor até que ele entre em contato com o gel de ultrassom.

Faça ajustes precisos com os botões XY na base da placa para ajuste fino. Em seguida, certifique-se de que a visualização do eixo longo periesternal na tela inclua o ápice, a via de saída do ventrículo esquerdo e a aorta, alinhados horizontalmente para obter imagens precisas. Selecione Nome da imagem no canto inferior da tela para salvar a imagem na série atual.

Gire o transdutor 90 graus no sentido horário para obter uma visão do eixo curto periesternal. Certifique-se de que o ventrículo esquerdo esteja claramente definido na imagem e que os músculos papilares estejam visíveis. Selecione o ícone do cubo no canto superior esquerdo da tela para configurar uma imagem quadridimensional.

Depois de redefinir o transdutor, ajuste a posição inicial logo abaixo do ápice e a posição de parada para o arco aórtico. Defina o tamanho do passo para 0,08 a 0,13 milímetros e a taxa de quadros para 200 a 300 hertz. Certifique-se de que os sinais vitais e o sinal do eletrocardiograma permaneçam estáveis antes de iniciar a varredura.

Depois de concluir a varredura e o processamento, ative Salvar dados EKV/4D e Respiration Gating para pós-processamento. Selecione Nome Imagem no canto inferior direito e inclua o ID do mouse no nome. Para visualizar cada plano de visualização através do ciclo cardíaco, selecione Mais controles e escolha Carregar em quatro dimensões.

Revise cada visão plana do coração, confirmando que o centro do coração permanece estável durante todo o ciclo cardíaco. Para começar, prepare barcos de papel alumínio para congelamento instantâneo de tecidos de camundongos. Usando uma pinça, cubra a pele do camundongo sacrificado e corte a pele da tenda com uma tesoura sobre o pescoço para acesso vascular ou logo abaixo do esterno para acesso cardíaco.

Continue cortando as camadas da pele e dos músculos para expor a vasculatura. Para a remoção do coração, corte o osso para expor o coração. Usando dissecção romba com cotonetes, isole o coração ou a vasculatura dos tecidos circundantes, incluindo a gordura.

Separe cuidadosamente o vaso carotídeo do nervo. Em seguida, remova o coração ou a vasculatura usando ferramentas cirúrgicas. Coloque o vaso carotídeo, o coração e a vasculatura em um barco de folha de alumínio pré-rotulado.

Em seguida, coloque os barcos em nitrogênio líquido para congelamento instantâneo. Para começar, encha um copo com água HPLC e reserve-o junto com seringas de cinco e um mililitro. Em seguida, ajuste a temperatura do criostato para menos 25 graus Celsius e insira a lâmina.

Coloque um par de pinças dentro da câmara do criostato para esfriar antes de montar o tecido. Retire cinco mililitros de água HPLC em uma seringa e coloque-a no criostato para congelar parcialmente a água. Antes que a água na seringa congele totalmente, dispense-a no mandril de metal e deixe-a congelar completamente.

Agora, encha uma seringa de um mililitro com água HPLC e coloque-a no criostato. Após 30 a 60 segundos, coloque uma pequena quantidade de água parcialmente solidificada no centro do mandril. Usando uma pinça, coloque rapidamente o coração de rato extraído na gota de água e segure-o lá até que a água ao redor esteja completamente congelada.

Para começar, remova a lâmina com o coração de rato montado do freezer e coloque-a em um dessecador para secar. Ligue o pulverizador HTX M3+. Abra o aplicativo HTX no laptop e, no Método, defina a temperatura do bico para 75 graus Celsius, a vazão para 100 microlitros por minuto e a pressão para 10 psi.

Registre o nome da amostra, polaridade, matriz, solvente e concentração no caderno de laboratório. Em seguida, calcule a quantidade de matriz necessária para a concentração desejada. Em seguida, pese a quantidade desejada de ácido 2,5-di-hidroxibenzóico para a matriz de modo positivo.

Dissolva a matriz em 70% de metanol em um tubo de 15 mililitros. Sonicar a solução da matriz durante 10 minutos. Durante a sonicação, remova a lâmina do dessecador.

Abra a bandeja do pulverizador. Em seguida, coloque o slide no canto inferior esquerdo e prenda as bordas com fita adesiva. Selecione a região de pulverização da amostra e feche a bandeja.

Usando uma seringa e um filtro, aspire a solução da matriz para a seringa. Filtre a solução da matriz através da seringa para o frasco com a tampa preta localizada no lado esquerdo do pulverizador. Coloque o frasco de volta em seu local designado no pulverizador e insira o tubo da linha D firmemente no frasco.

Em seguida, ligue o gás inerte e confirme se o medidor do pulverizador lê 10 psi. Pressione Iniciar e, quando o pulverizador atingir a temperatura definida, selecione o botão Iniciar piscando para iniciar a pulverização. Após a conclusão da pulverização, remova o sample do pulverizador e coloque-o no suporte de lâminas MALDI.

Digitalize o porta-lâminas MALDI e a lâmina usando um scanner. Salve a imagem em uma unidade flash para uso com imagens de espectrometria de massa. Selecione a opção Lavar no pulverizador e mova a linha D do frasco da matriz para o copo de resíduos.

Por fim, borrife metanol na bandeja do pulverizador e limpe-a. Desligue o nitrogênio. A espectrometria de massa MALDI do tecido miocárdico infartado identificou massa de íons moleculares com carga 577,52, provavelmente correspondendo a COHb em C ou D, sugerindo envolvimento no remodelamento miocárdico.

A imagem ultrassonográfica quadridimensional mostrou regiões miocárdicas com magnitude tensa de área superficial inferior a 20%, visualizadas como tecido verde-amarelo, indicando zonas infartadas. Na visão de eixo longo do tecido do infarto do miocárdio, a deslocalização lipídica foi visível, complicando a correlação entre a biomecânica do tecido e a composição molecular.