Análise por Citometria de Fluxo da Expressão de Fatores Tecidusuais em Plaquetas Humanas

Neste protocolo, propomos um tutorial passo a passo para medir o fator tecidual associado a plaquetas por citometria de fluxo sanguíneo total, avaliando a proteína no compartimento intracelular, condições de parada e na superfície celular, tanto em condição de repouso quanto após a ativação Com um DP, um dos fatores teciduais agonistas plaquetários mais comuns é expresso por um subconjunto de plaquetas. Se as plaquetas positivas para fator tecidual forem medidas no plasma rico em plaquetas com PRP ou em plaquetas lavadas, esse subconjunto pode ser perdido durante a preparação da amostra. Este risco não ocorre quando esta avaliação é realizada em parede.

O fator tecidual associado à placa sanguínea tem sido controverso desde o primeiro relatório publicado no início do século devido a questões pré-analíticas e metodológicas. Este protocolo lança luz sobre essas questões e também está sendo usado para conduzir um projeto internacional apoiado pela Sociedade Internacional de Trombose e Hemostasia ISDH para padronizar a medição do fator tecidual associado a plaquetas ou citometria de fluxo sanguíneo é realizada em alguns microlitros de sangue, permitindo a análise do fator tecidual associado a plaquetas adequada no ambiente clínico. Além disso, a possibilidade de fixação da amostra e posterior rotulagem, torna essa análise viável para muitos hospitais e laboratórios.

Para começar, prepare um tubo de ensaio para cada volume de anticorpo. Para testar, adicione uma gota de contas negativas e uma gota de contas positivas a cada tubo de ensaio. Adicione 20 microlitros de cada diluição de anticorpo ao tubo de ensaio e ao vórtice.

Incube imediatamente os tubos de ensaio no escuro em temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, adicione um mililitro de PBS sem cálcio e magnésio pH 7,4 a cada tubo e vórtice, inverta suavemente o vacutainer de citrato de sódio cinco vezes para misturar bem o sangue e o anticoagulante. Transfira 50 microlitros de sangue para um tubo de 1,5 mililitro.

Em seguida, adicione 950 microlitros de aldeído paraforme a 1%. Misture e incube suavemente a amostra por 90 minutos em temperatura ambiente. Agora centrifugue a amostra a 1.500 G por cinco minutos com uma pausa à temperatura ambiente.

Depois de remover o sobrenadante Reese, suspenda o pellet em um mililitro de PBS sem cálcio e magnésio. Em pH 7,4, dispense 100 microlitros de sangue fixo em cada tubo e centrifugue-os a 1.500 G por cinco minutos. Com a pausa à temperatura ambiente, remova o resus sobrenadante.

Suspenda o pellet em 100 microlitros de 0,1% Triton PBS para permear as amostras e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Para começar, prepare um tubo para a fluorescência menos um controle e um tubo para a coloração do fator tecidual. Adicione anticorpos a 100 microlitros de sangue total fixo e permanente em cada tubo.

Adicione 300 microlitros de PBS sem cálcio e magnésio a pH 7,4 a cada tubo e misture. Em seguida, armazene as amostras coradas no escuro até que a análise de citometria de fluxo dilua alfa CD 1 42 HTF um anticorpo monoclonal e Alexa Fluer 6 33 cabra anti-imunoglobulina G de camundongo em PBS sem cálcio e magnésio. Em seguida, prepare três tubos de amostra e dispense PBS sem cálcio e magnésio.

Em pH 7,4, dispense 7,5 microlitros de alfa CD diluído 1 42 htf um anticorpo monoclonal e adicione cinco microlitros de difosfato de adenosina. Inverta suavemente o vacutainer de citrato cinco vezes para misturar bem o sangue e o anticoagulante. Dispense cinco microlitros de sangue total em cada tubo.

Misture delicadamente as amostras e incube por 20 minutos em temperatura ambiente. Para a fixação da amostra, adicione 300 microlitros de 1%PFA a cada tubo e centrifugue a 1.500 G por cinco minutos com intervalo à temperatura ambiente. Uma vez removido o sobrenadante, suspender o pellet em 90 microlitros de PBS sem cálcio e magnésio.

Em pH 7,4, pipetando suavemente, dispense cinco microlitros de imunoglobulina G Alexa Fluer 6 33 diluída e cinco microlitros de alfa CD 41 PE em cada tubo. Incubar as amostras durante 15 minutos no escuro à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 300 microlitros de PBS sem cálcio e magnésio a pH 7,4 a cada tubo e misture.

Para começar, crie um gráfico de pontos de área de dispersão direta e de área de dispersão lateral em uma escala logarítmica exibindo todos os eventos, crie um gráfico de pontos de área de dispersão lateral CD 61 A e lateral em uma escala logarítmica exibindo todos os eventos. Para visualizar a população de plaquetas, defina o limite para aproximadamente 2000 na altura de dispersão lateral e 1000 no por CP B seis 90 H. Ajuste o ganho PE Y 5 8 5 e por CP B seis 90 de acordo com o controle de qualidade diário e defina a taxa de fluxo para baixa. Agora desenhe uma região entre 10 raios elevado a três e 10 raios elevado a cinco chamada CD 61 positivo.

Para identificar a população de plaquetas, duplique o FMO e renomeie-o como TFIC. Adquira as amostras e registre um arquivo de dados de 10.000 eventos dentro da porta positiva do CD 61. Crie uma área de dispersão direta e um gráfico de pontos de área de dispersão lateral em uma escala logarítmica exibindo todos os eventos.

Crie um gráfico de pontos de CD 41 A e área de dispersão lateral em uma escala logarítmica exibindo todos os eventos. Em seguida, ajuste o ganho Alexa floor 6 33 e o ganho PE wifi 5 8 5 de acordo com o controle de qualidade diário. Defina o limite aproximadamente para 1000 na altura de dispersão lateral e para 2.500 em PEY 5 85 H.To visualizar a população de plaquetas, defina a taxa de fluxo para baixa.

Agora desenhe uma região entre 10 raios elevado a quatro e 10 elevado à potência de cinco chamada CD 41 positivo para identificar a população de plaquetas. Em seguida, crie um tubo para cada amostra e nomeie TF Unstimulated e TF Stimulated. Adquira as amostras e registre um arquivo de dados de 10.000 eventos dentro da centrífuga de marcha positiva CD 41.

O vacutainer de citrato de sódio de 0,129 molar a 100 G por 10 minutos sem interrupção à temperatura ambiente. Em seguida, remova o vacutainer da centrífuga. Colete o plasma rico em plaquetas obtido, transfira-o para um tubo de polipropileno de 10 mililitros e registre o volume coletado, conte as plaquetas duas vezes no plasma rico em plaquetas usando um contador de células sanguíneas.

A população plaquetária identificada pela coloração do anticorpo alfa CD 61 mostrou que aproximadamente 26,8% das plaquetas circulantes continham análise de citometria de fluxo do fator tecidual intracelular indicou que o fator tecidual é expresso por aproximadamente 2,8% das plaquetas em repouso e aumenta para 24,5% após a ativação com difosfato de adenosina. Plaquetas de tamanho maior mostraram expressar níveis mais altos de fator tecidual com os pontos verdes representando o subconjunto de plaquetas maior. A análise por citometria de fluxo demonstrou que o plasma rico em plaquetas preparado usando centrifugação de 100 g preservou uma população semelhante ao sangue total, retendo plaquetas de tamanho maior com maior positividade do fator tecidual.

Uma maior força de centrifugação levou a uma perda de plaquetas positivas para fator tecidual maior, conforme indicado pela dispersão direta reduzida na população de PRP.