Name: Interferência de RNA Larval no Bicho-da-Seda Bombyx mori por meio da Entrega de Nanopartículas de Quitosana/dsRNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Aprenda a induzir silenciamento gênico em larvas de Bombyx mori usando nanopartículas de quitosana/dsRNA via alimentação. Este método eficiente facilita estudos de regulação gênica e triagem de alto rendimento em insetos.

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<meta charset="utf8"></head><body>Alimentação de dsRNA mediada por nanopartículas para silenciamento de genes em larvas de bicho-da-seda

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<li>Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%2Fdouble-stranded+RNA+nanoparticle-mediated+RNA+interference+to+silence+chitin+synthase+genes+through+larval+feeding+in+the+African+malaria+mosquito+%28Anopheles+gambiae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae).</a> Insect Mol Biol. 19 (5), 683-693 (2010).</li>
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<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+function+of+bombyx+toll9-2+in+the+silkworm+%28Bombyx+mori%29+larval+midgut%3A+Activation+by+escherichia+coli%2Flipopolysaccharide+and+regulation+of+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Insect+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Immunological function of bombyx toll9-2 in the silkworm (Bombyx mori) larval midgut: Activation by escherichia coli/lipopolysaccharide and regulation of growth.</a> Arch Insect Biochem Physiol. 116 (4), e22130(2024).</li>
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<li>Laisney, J., Loczenski Rose, V., Watters, K., Donohue, K. V., Unrine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+rna+in+the+neotropical+brown+stink+bug%2C+Euschistus+heros%2C+using+a+composite+nanomaterial%5BTitle%5D)+AND+%22Pestic+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin rna in the neotropical brown stink bug, Euschistus heros, using a composite nanomaterial.</a> Pestic Biochem Physiol. 177, 104906(2021).</li>
<li>Terenius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rna+interference+in+Lepidoptera%3A+An+overview+of+successful+and+unsuccessful+studies+and+implications+for+experimental+design%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rna interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design.</a> J Insect Physiol. 57 (2), 231-245 (2011).</li>
<li>Kolge, H., Kadam, K., Ghormade, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+nanocarriers+mediated+dsrna+delivery+in+gene+silencing+for+Helicoverpa+armigera+biocontrol%5BTitle%5D)+AND+%22Pestic+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chitosan nanocarriers mediated dsrna delivery in gene silencing for Helicoverpa armigera biocontrol.</a> Pestic Biochem Physiol. 189, 105292(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga de 1,5 mL</td><td>Sangon</td><td>F601620</td><td>para reação de dsRNA ou nanopartículas</td></tr><tr><td>10 &mu; l pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>P13473G</td><td>para aspirar ou ressuspender líquido</td></tr><tr><td>100 &mu; l pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>Q12115G</td><td>para aspirar ou ressuspender líquido</td></tr><tr><td>2,5 &mu; l pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>P20777G</td><td>para aspirar ou ressuspender líquido</td></tr><tr><td>20 &mu; l pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>H19229E</td><td>para aspirar ou ressuspender líquido</td></tr><tr><td>200 &mu; l pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>H20588E</td><td>para aspirar ou ressuspender placas de</td></tr><tr><td>poços múltiplos tratadas com TC transparente de 6 poços</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>para criação individual de bicho-da-seda</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Aladdin</td><td>A116165</td><td>para fazer TAE</td></tr><tr><td>Agarose M</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A610013</td><td>para eletrofose em gel de agarose</td></tr><tr><td>Balança analítica</td><td>Sartorius</td><td>BSA224S</td><td>para pesar ingredientes</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sartorius</td><td>Centrisart A-14C</td><td>para centrifugar para formar dsRNA ou nanopartículas</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3646</td><td>para combinar com dsRNA para preparação de nanopartículas</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon</td><td>A500895</td><td>para fazer TAE</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Aladdin</td><td>E130059</td><td>para fazer TAE, ou para precipitação de dsRNA</td></tr><tr><td>Freezer</td><td>Siemens</td><td>iQ300</td><td>para armazenar dsRNA ou nanopartículas</td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>M712</td><td>para reação PCR</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>para reação qRT-PCR</td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp;</td><td>Aladdin</td><td>I112011</td><td>para precipitação de dsRNA</td></tr><tr><td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td><td>ThermoFisher</td><td>Um</td><td>para determinar a concentração de dsRNA</td></tr><tr><td>ph</td><td>meter Sartorius</td><td>&nbsp; PB-10</td><td>para preparar tampões</td></tr><tr><td>SanPrep Column PCR Product Purification Kit</td><td>Sangon</td><td>B518141</td><td>para purificação de produtos PCR</td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>para fazer tampão de acetato de sódio 100 mM</td></tr><tr><td>Sulfato de sódio&nbsp;</td><td>A Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td>para fazer tampão de sulfato de sódio de 100 mM</td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express RNAi System</td><td>Promega</td><td>P1700</td><td>para síntese de dsRNA</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>C</td><td>para geração de dsRNA ou aquecimento de nanopartículas</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sangon</td><td>A501492</td><td>para fazer TAE</td></tr><tr><td>Vortex&nbsp;</td><td>IKA</td><td>Vortex 3</td><td>para preparar nanopartículas de quitosana/dsRNA</td></tr></tbody></table>

interferência de rna larval no bicho-da-seda bombyx mori por meio da entrega de nanopartículas de quitosana/dsrna

Larval RNA Interference in Silkworm Bombyx mori through Chitosan/dsRNA Nanoparticle Delivery

Para avaliar a eficiência do RNAi, um gene imune direcionado ao BmToll9-2 foi escolhido para análise. O gene BmToll9-2 é bem caracterizado em laboratório, e o silenciamento gênico por injeção de dsRNA resulta em larvas mais leves e menores em nossa recente publicação20. Para confirmar a eficácia do RNAi por ingestão através de nanopartículas de quitosana/dsRNA, nanopartículas de quitosana foram usadas como controle, e o dsRNA nu foi comparado ao mesmo tempo.
Em comparação com o controle, nanopartículas de quitosana sem dsRNA, dsRNA nu direcionado ao gene BmToll9-2 não mostra efeito de silenciamento. A alimentação de nanopartículas de quitosana/dsRNA no bicho-da-seda inibe significativamente o transcrito, com um knockdown de 79% (Figura 1). A inibição do transcrito relativo indica que o gene BmToll9-2 foi silenciado com sucesso por meio da ingestão de quitosana / dsRNA.
O knockdown do gene BmToll9-2 afeta significativamente o crescimento do bicho-da-seda. Ao observar as larvas, as larvas silenciadas por BmToll9-2 são menores que as larvas de controle (Figura 2A). Ao comparar os casulos, os casulos silenciados BmToll9-2 também são menores (Figura 2B). As nanopartículas de quitosana/dsRNA mostram efeitos bem-sucedidos de RNAi tanto no transcrito quanto no fenótipo no bicho-da-seda.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67360/67360fig01v2.jpg"> Figura 1: Transcrição relativa de BmToll9-2 após a ingestão de nanopartículas de quitosana/dsBmToll9-2 em larvas de B. mori de5º ínstar. Os níveis relativos de mRNA de BmToll9-2 nas larvas alimentadas com nanopartículas de quitosana como controle, dsRNA nu e nanopartículas de quitosana/dsRNA. Os dados foram representados como médias ± desvio padrão de três repetições biológicas. Para cada replicação biológica, houve três repetições técnicas. Letras diferentes nas barras indicam diferenças significativas com base na análise ANOVA unidirecional. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67360/67360fig01largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67360/67360fig02v2.jpg"> Figura 2: Observação do fenótipo após alimentação com nanopartículas de quitosana/dsBmToll9-2. As nanopartículas de quitosana são usadas como controle. (A) O aparecimento de larvas de bicho-da-seda após a ingestão de nanopartículas. (B) O aparecimento de casulos de bicho-da-seda após a ingestão de nanopartículas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67360/67360fig02largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Interferência de RNA Larval no Bicho-da-Seda Bombyx mori por meio da Entrega de Nanopartículas de Quitosana/dsRNA

The silkworm, Bombyx mori, is an important economic insect with thousands of years of history in China. Meanwhile, the silkworm is the model insect of ...

larval-rna-interference-silkworm-bombyx-mori-through-chitosandsrna

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