Medindo a atividade enzimática de enzimas desubiquitilantes associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento por meio de um ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro

Estamos interessados em definir a base molecular dos distúrbios do neurodesenvolvimento associados a variantes genéticas em enzimas do sistema ubiquitina. Usamos técnicas de ponta para dissecar as vias de sinalização controladas por essas enzimas e determinar o impacto das variantes genéticas na biologia das proteínas. A vantagem deste método é que é uma técnica independente do substrato que não requer conhecimento prévio dos substratos que são regulados por um DUB específico.

Dessa forma, podemos medir diretamente o impacto da variância gênica associada ao distúrbio do neurodesenvolvimento na atividade catalítica do DUB e sugerir possíveis mecanismos patogênicos. Como as funções celulares da maioria dos DUBs são pouco compreendidas, nosso foco de laboratório será identificar as vias de sinalização que essas enzimas medeiam e como as variantes genéticas associadas a doenças genéticas afetam esses processos. Para começar, descongele 20 microlitros de células de Rosetta 2 Escherichia coli quimicamente competentes no gelo imediatamente antes do uso.

Adicione um a 10 nanogramas do plasmídeo de expressão pGEX6P1 USP27X e incube por cinco minutos no gelo. Choque térmico nas células por 30 segundos a 42 graus Celsius em um banho seco. Em seguida, incube as células no gelo por dois minutos.

Adicione 80 microlitros de meio SOC à temperatura ambiente às células. Incube por 60 minutos a 37 graus Celsius com rotação de 200 RPM em um agitador de bancada com temperatura controlada de 19 milímetros. Em seguida, coloque 50 microlitros da cultura em uma placa de ágar LB, suplementada com cloranfenicol e ampicilina.

Incube por 20 horas a 37 graus Celsius, com a tampa voltada para baixo, em uma incubadora com temperatura controlada. Escolha uma única colônia de bactérias transformadas e adicione-a a 10 mililitros de meio LB estéril suplementado com cloranfenicol e ampicilina. Incube por 20 horas, conforme mostrado anteriormente.

Em seguida, adicione 10 mililitros da cultura noturna a um litro de meio TB suplementado com cloranfenicol e ampicilina. Incube até que a densidade óptica de 600 nanômetros atinja 0,5 a 0,6. Em seguida, adicione 50 micromolares isopropil beta-d-1-tiogalactopiranosídeo à cultura para induzir a expressão.

Depois de resfriar a amostra a 16 graus Celsius, incubar por 20 horas a 16 graus Celsius com rotação de 200 RPM. Em seguida, centrifugue as células durante 20 minutos a 3000 G ou mais a quatro graus Celsius para granular as células da cultura de expressão. Por fim, armazene o pellet a 80 graus Celsius negativos por pelo menos uma hora.

Para começar, prenda a coluna de fluxo de gravidade vazia em um suporte de retorta. Encha a coluna com dois a três mililitros de resina de agarose gluthathione para purificar um pellet celular coletado de um litro de cultura de expressão. Lave a coluna com um volume de leito de resina de 20% de etanol.

Depois de lavar a coluna, descongele o pellet celular a quatro graus Celsius. Adicione 30 mililitros de tampão MS500 ao pellet descongelado e incube com uma rotação suave de ponta a ponta. Agora sonicar as células lisadas em um tubo de centrífuga de 50 mililitros no gelo até que o lisado flua livremente quando dispensado de uma ponta de pipeta.

Centrifugue durante 30 minutos a quatro graus Celsius e 20 000 G ou mais para limpar o sobrenadante. Em seguida, transvase o sobrenadante para um copo e coloque o lisado limpo na coluna. Passe o lisado através da coluna por fluxo por gravidade enquanto coleta o fluxo.

Em seguida, lave a coluna com pelo menos dois volumes de leito de resina de tampão de lavagem MS500 e colete o fluxo de lavagem em frações de cinco mililitros. Em seguida, adicione um microlitro de cada fração a 100 microlitros de reagente de Bradford para verificar a presença de proteínas. Recupere a proteína executando o tampão de eluição MS500 através da coluna e coletando cinco frações de eluição de mililitros.

Para precipitar a proteína, adicione dois volumes de sulfato de amônio de quatro molares ao eluído e inverta suavemente o tubo até que fique turvo. Centrifugue por 30 minutos a quatro graus Celsius e 20.000 G ou mais. Remover o sobrenadante após cada centrifugação sem perturbar o sedimento proteico.

Em seguida, dissolva novamente a proteína em tampão MS500 suplementado com 25% de glicerol antes de armazená-la. Prepare 10 microlitros de USP27X purificado marcado com GST em tampão de ativação da enzima desubiquitilante para cada ponto de tempo para cada enzima desubiquitilante. Antes de adicionar cadeias de ubiquitina, adicione sete microlitros de tampão de carregamento SDS-PAGE à amostra de tempo zero para evitar que a reação de desubiquitilação comece.

Para cada ponto de tempo para cada enzima desubiquitilante, adicione 375 nanogramas de cadeias de di-ubiquitina ligadas a K63 diluídas em 10 microlitros de tampão de ativação enzimática. Incube os tubos a 30 graus Celsius, parando a cada ponto de tempo adicionando sete microlitros de buffer de carregamento SDS-PAGE. Execute SDS-PAGE usando um gel de gradiente de quatro a 12%.

O tipo selvagem USP27X clivou cadeias de di-ubiquitina ligadas a K63 em mono-ubiquitina após uma hora de incubação. A variância associada ao XLID-105 F313V, Y381H e S404N não clivou cadeias de di-ubiquitina ligadas a K63 após uma hora de incubação.