Name: Medindo a atividade enzimática de enzimas desubiquitilantes associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento por meio de um ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Aprenda a medir a atividade de enzimas desubiquitilantes associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento usando ensaios de clivagem de cadeias de ubiquitina in vitro. Este método permite analisar variantes genéticas sem conhecimento prévio de substratos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O protocolo a seguir pode ser adaptado para proteínas recombinantes usando várias marcas de afinidade expressas em diferentes cepas de células competentes. Dependendo da proteína que está sendo expressa, as condições de cultura e expressão noturna podem exigir a otimização do OD600 na indução de expressão, tempo de expressão, temperatura de expressão e concentração de IPTG. Uma visão geral do protocolo é ilustrada na Figura 1. Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Transformação de células competentes de E. coli de Rosetta 2 com o plasmídeo de expressão GST-USP27X recombinante
NOTA: Para manter a esterilidade da cultura bacteriana, execute as etapas em que os recipientes de mídia são abertos sob uma chama de bico de Bunsen. Para permitir a transferência ideal de oxigênio, execute a agitação da cultura bacteriana em um agitador de bancada com temperatura controlada com uma órbita de 19 mm a 50 mm e uma velocidade de 200 rpm29.
<ol>
	<li>Descongele 20 μL de células de E. coli de Rosetta 2 quimicamente competentes em gelo imediatamente antes do uso. Adicione 1-10 ng do plasmídeo de expressão pGEX6P1-USP27X (codificando para N-terminal Glutationa-S-transferase (GST)30 - marcado com USP27X e contendo resistência à ampicilina) e incube 5 min no gelo.</li>
	<li>Choque térmico durante 30 s a 42 °C em banho seco. Incube no gelo por 2 min.</li>
	<li>Adicione 80 μL de meio SOC à temperatura ambiente (RT). Incubar durante 60 min a 37 °C com rotação de 200 rpm num agitador de bancada com temperatura controlada de 19 mm.</li>
	<li>Placa 50 μL de cultura em uma placa de ágar LB suplementada com 25 μg/L de cloranfenicol e 50 μg/L de ampicilina. Incubar durante 20 h a 37 °C com a tampa virada para baixo numa incubadora com temperatura controlada.</li>
</ol>
2. Expressão bacteriana durante a noite da proteína recombinante do plasmídeo de expressão
NOTAS: Para manter a esterilidade da cultura bacteriana, execute as etapas em que os recipientes de mídia são abertos sob uma chama de bico de Bunsen. Para permitir a transferência ideal de oxigênio, execute a agitação da cultura bacteriana em um agitador de bancada com temperatura controlada com uma órbita de 19 mm a 50 mm e uma velocidade de 200 rpm29. Meça a cultura OD600 usando um espectrofotômetro.
<ol>
	<li>Prepare 1 L de meio Terrific Broth (TB) adicionando 47,6 g de pó de TB a 1 L de água ultrapura com 0,4% de glicerol em um frasco de cultura de 2 L. Autoclave média por 30 min e esfriar para RT.</li>
	<li>Escolha uma única colônia de bactérias transformadas e adicione a 10 mL de meio LB estéril suplementado com 25 μg / L de cloranfenicol e 50 μg / L de ampicilina. Incubar durante 20 h a 37 °C com rotação de 200 rpm num agitador de bancada com temperatura controlada de 19 mm.</li>
	<li>Adicione 10 mL de cultura durante a noite a 1 L de meio TB suplementado com 25 μg/L de cloranfenicol e 50 μg/L de ampicilina (proporção de 1:100 da cultura inicial para a cultura de expressão). Incubar a 37 °C com rotação de 200 rpm num agitador de bancada com temperatura controlada de 19 mm em órbita até que a cultura OD600 esteja compreendida entre 0,5-0,6.</li>
	<li>Adicione 50 μM de IPTG à cultura para induzir a expressão, resfrie a 16 ° C e incube por 20 h a 16 ° C com rotação de 200 rpm.</li>
	<li>Células de pellets de cultura de expressão por centrifugação por 20 min a ≥3.000 x g e 4 °C. Conservar o pellet a -80 °C durante, pelo menos, 1 h. NOTA: Neste ponto, o experimento pode ser pausado e reiniciado mais tarde (de preferência na mesma semana). O pellet pode ser armazenado a longo prazo a -80 °C.</li>
</ol>
3. Purificação de proteínas por coluna de afinidade gravidade-fluxo
NOTA: A resina, ligação, lavagem, eluição e tampões de armazenamento apropriados para cada purificação dependerão da proteína recombinante que está sendo purificada. Colete amostras do pellet celular, sobrenadante, fluxo, frações de lavagem e frações de eluição no tampão SDS-PAGE. Realize a coloração SDS-PAGE e Coomassie para as amostras para avaliar o sucesso da purificação. Efectuar a purificação a 4 °C e manusear as fracções no gelo. A clivagem de marcadores de proteína pode ser realizada dentro ou fora da coluna usando a protease apropriada para atingir o local de clivagem específico da protease relevante.
<ol>
	<li>Prenda a coluna de fluxo de gravidade vazia no suporte de retorta e encha-a com resina de glutationa agarose. Use 2-3 mL de resina para purificar um pellet celular coletado de 1 L de cultura de expressão.</li>
	<li>Lavar a coluna com um volume de leito de resina de etanol a 20%. Lave a coluna 3 vezes com um volume de leito de resina de tampão MS500 (20 mM de Tris pH 7,5, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP). Pare a coluna para que a resina permaneça coberta com tampão para evitar o ressecamento durante a preparação do pellet celular.</li>
	<li>Descongelar o sedimento celular a 4 °C. Adicione 30 mL de tampão MS500 (20 mM de Tris pH 7,5, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP, 60 mg de lisozima e um comprimido inibidor de protease) ao pellet descongelado. Lisar durante 30 min a 4 °C com uma rotação suave de ponta a ponta.</li>
	<li>Sonicar as células lisadas num tubo de centrifugação de 50 ml ou num copo metálico sobre gelo até que o lisado flua livremente quando dispensado a partir de uma ponta de pipeta. Centrifugue por 30 min a 4 °C e ≥20.000 x g para limpar o sobrenadante. NOTA: Determine as configurações do sonicador empiricamente. Defina o sonicador de modo que o tempo total de 120 s seja suficiente para reduzir o lisado viscoso a um líquido transparente e de fluxo livre.</li>
	<li>Transvase o sobrenadante para um copo e coloque o lisado limpo na coluna. Execute o lisado através da coluna por fluxo por gravidade enquanto coleta o fluxo. Carregue a coluna com o fluxo coletado e passe-o pela coluna.</li>
	<li>Lave a coluna com pelo menos dois volumes de leito de resina de tampão de lavagem MS500 (20 mM de Tris pH 7,5, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP) 5 vezes. Colete o fluxo de lavagem em frações de 5 mL. Adicione 1 μL de cada fração a 100 μL de reagente de Bradford para verificar visualmente a presença de proteínas. Lave até que a proteína não ligada não esteja mais presente na última lavagem, adicionando etapas de lavagem adicionais, se necessário.</li>
	<li>Recupere a proteína executando o tampão de eluição MS500 (tampão MS500 suplementado com 10 mM de glutationa e 10 mM de NaOH) através da coluna, coletando 5 mL de frações de eluição. Verifique a presença de proteínas adicionando 1 μL de eluato a 100 μL de reagente de Bradford. Pare de coletar frações quando o reagente de Bradford não indicar mais que as proteínas estão presentes.</li>
	<li>Realize a troca de tampão por precipitação e centrifugação. Precipitar a proteína adicionando 2 volumes de 4 M de sulfato de amónio ao eluído, invertendo suavemente até ficar turvo e, em seguida, centrifugando durante 30 min a 4 °C e ≥20.000 x g e novamente durante mais 5 min. Remover o sobrenadante após cada centrifugação sem perturbar o sedimento proteico.</li>
	<li>Dissolva e armazene proteínas em MS500 suplementado com 25% de glicerol. Armazene pellets de proteína ou proteína em tampão de armazenamento a -80 °C.</li>
</ol>
4. Ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro
NOTA: Selecione o comprimento da cadeia de ubiquitina e os tipos de ligação com base na especificidade do DUB descrita em relatórios anteriores31 ou determinada empiricamente. Se necessário, este protocolo pode ser usado para testar a atividade do DUB de tipo selvagem de interesse em um painel de cadeias de ubiquitina comercialmente disponíveis de comprimento e tipo de ligação definidos. Uma quantidade de cadeia de di-ubiquitina de 375-750 ng e uma concentração de DUB de 1-2 μM podem ser usadas como pontos de partida para o ensaio27.
<ol>
	<li>Prepare 10x tampão de ativação DUB (500 mM de Tris-HCl pH 7,5, 500 mM de NaCl e 100 mM de TCEP).</li>
	<li>Para cada ponto de tempo para cada DUB, prepare 10 μL no total de 2 μM de GST-USP27X purificado em 1x tampão de ativação DUB (mistura DUB). Prepare mastermixes e divida-os em pontos de tempo.</li>
	<li>Incube a mistura DUB por 10 min em RT.</li>
	<li>Adicione 7 μL de buffer de carregamento SDS-PAGE ao tempo 0 antes de adicionar cadeias de ubiquitina para evitar que a reação de desubiquitilação comece.</li>
	<li>Para cada ponto de tempo para cada DUB, adicione 375 ng de cadeias de di-ubiquitina K-63 diluídas em 10 μL 1x tampão de ativação de DUB. O volume total é de 20 μL por reação.</li>
	<li>Incubar os tubos a 30 °C, parando cada ponto de tempo com 7 μL de tampão de carga SDS-PAGE.</li>
	<li>Realize SDS-PAGE com um gel de gradiente de 4% a 12% e immunoblot 7,32 para ubiquitina e USP27X para analisar a mudança na presença de mono-ubiquitina em pontos de tempo selecionados.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67367/67367fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Esquema do desenho do estudo. (A) Transformação de células de E. coli competentes com plasmídeo de expressão de proteína recombinante. (B) Expressão bacteriana noturna da proteína deubiquitilase recombinante. (C) Purificação de proteínas da deubiquitilase recombinante usando uma coluna de afinidade gravidade-fluxo. (D) Ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro para avaliar a atividade desubiquitilante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/67367fig01largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Avaliação de variantes de DUB em distúrbios do neurodesenvolvimento usando um ensaio de clivagem

<ol><li>Morris-Rosendahl, D. J., Crocq, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+disorders%3A+the+history+and+future+of+a+diagnostic+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Dialogues+Clin+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental disorders: the history and future of a diagnostic concept.</a> Dialogues Clin Neurosci. 22 (1), 65-72 (2020).</li>
<li>Ebstein, F., Küry, S., Papendorf, J. J., Krüger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+disorders+%28NDD%29+caused+by+genomic+alterations+of+the+ubiquitin-proteasome+system+%28UPS%29%3A+the+possible+contribution+of+immune+dysregulation+to+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental disorders (NDD) caused by genomic alterations of the ubiquitin-proteasome system (UPS): the possible contribution of immune dysregulation to disease pathogenesis.</a> Front Mol Neurosci. 14, 733012(2021).</li>
<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67 (10), 425-479 (1998).</li>
<li>Pickart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying ubiquitination.</a> Annu Rev Biochem. 70 (1), 503-533 (2001).</li>
<li>Komander, D., Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+chains%3A+structure+and+function+of+the+deubiquitinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 550-563 (2009).</li>
<li>Yau, R., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+complexity+of+the+ubiquitin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The increasing complexity of the ubiquitin code.</a> Nat Cell Biol. 18 (6), 579-586 (2016).</li>
<li>Koch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP27X+variants+underlying+X-linked+intellectual+disability+disrupt+protein+function+via+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">USP27X variants underlying X-linked intellectual disability disrupt protein function via distinct mechanisms.</a> Life Sci Alliance. 7 (3), e202302258(2024).</li>
<li>Hao, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP7+acts+as+a+molecular+rheostat+to+promote+WASH-dependent+endosomal+protein+recycling+and+is+mutated+in+a+human+neurodevelopmental+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">USP7 acts as a molecular rheostat to promote WASH-dependent endosomal protein recycling and is mutated in a human neurodevelopmental disorder.</a> Mol Cell. 59 (6), 956-969 (2015).</li>
<li>Fountain, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+variants+in+USP7+cause+a+neurodevelopmental+disorder+with+speech+delays%2C+altered+behavior%2C+and+neurologic+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Med%22%5BJournal%5D)">Pathogenic variants in USP7 cause a neurodevelopmental disorder with speech delays, altered behavior, and neurologic anomalies.</a> Genet Med. 21 (8), 1797-1807 (2019).</li>
<li>Santiago-Sim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biallelic+variants+in+OTUD6B+cause+an+intellectual+disability+syndrome+associated+with+seizures+and+dysmorphic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Biallelic variants in OTUD6B cause an intellectual disability syndrome associated with seizures and dysmorphic features.</a> Am J Hum Genet. 100 (4), 676-688 (2017).</li>
<li>Beck, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage-specific+deubiquitylation+by+OTUD5+defines+an+embryonic+pathway+intolerant+to+genomic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Linkage-specific deubiquitylation by OTUD5 defines an embryonic pathway intolerant to genomic variation.</a> Sci Adv. 7 (4), eabe2116(2021).</li>
<li>Cho, J., Park, J., Kim, E. E., Song, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+systems+for+profiling+deubiquitinating+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Assay systems for profiling deubiquitinating activity.</a> Int J Mol Sci. 21 (16), 1-16 (2020).</li>
<li>Matsui, S., Sandberg, A. A., Negoro, S., Seon, B. K., Goldstein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isopeptidase%3A+A+novel+eukaryotic+enzyme+that+cleaves+isopeptide+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Isopeptidase: A novel eukaryotic enzyme that cleaves isopeptide bonds.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79 (5), 1535-1539 (1982).</li>
<li>Rose, I. A., Warms, J. V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme+with+ubiquitin+carboxy-terminal+esterase+activity+from+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme with ubiquitin carboxy-terminal esterase activity from reticulocytes.</a> Biochemistry. 22 (18), 4234-4237 (1983).</li>
<li>Wilkinson, K. D., Cox, M. J., Mayer, A. N., Frey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+ubiquitin+ethyl+ester%2C+a+new+substrate+for+ubiquitin+carboxyl-terminal+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of ubiquitin ethyl ester, a new substrate for ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase.</a> Biochemistry. 25 (21), 6644-6649 (1986).</li>
<li>Pickart, C. M., Rose, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+carboxyl-terminal+hydrolase+acts+on+ubiquitin+carboxyl-terminal+amides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase acts on ubiquitin carboxyl-terminal amides.</a> J Biol Chem. 260 (13), 7903-7910 (1985).</li>
<li>Hadari, T., Warms, J. V. B., Rose, I. A., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ubiquitin+C-terminal+isopeptidase+that+acts+on+polyubiquitin+chains%3A+Role+in+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A ubiquitin C-terminal isopeptidase that acts on polyubiquitin chains: Role in protein degradation.</a> J Biol Chem. 267 (2), 719-727 (1992).</li>
<li>Woo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+ubiquitin+C-terminal+hydrolases+from+chick+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple ubiquitin C-terminal hydrolases from chick skeletal muscle.</a> J Biol Chem. 270 (32), 18766-18773 (1995).</li>
<li>Woo, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+new+ubiquitin+C-terminal+hydrolase+%28UCH-1%29+with+isopeptidase+activity+from+chick+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a new ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH-1) with isopeptidase activity from chick skeletal muscle.</a> J Biochem. 121 (4), 684-689 (1997).</li>
<li>Baek, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+a+novel+ubiquitin-specific+protease%2C+UBP41%2C+with+isopeptidase+activity+in+chick+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of a novel ubiquitin-specific protease, UBP41, with isopeptidase activity in chick skeletal muscle.</a> J Biol Chem. 272 (41), 25560-25565 (1997).</li>
<li>Wilkinson, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+the+polyubiquitin+degradation+signal%3A+Structure%2C+mechanism%2C+and+role+of+isopeptidase+T%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolism of the polyubiquitin degradation signal: Structure, mechanism, and role of isopeptidase T.</a> Biochemistry. 34 (44), 14535-14546 (1995).</li>
<li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+UBP-family+deubiquitinating+enzyme+in+isolation+and+in+complex+with+ubiquitin+aldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a UBP-family deubiquitinating enzyme in isolation and in complex with ubiquitin aldehyde.</a> Cell. 111 (7), 1041-1054 (2002).</li>
<li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanisms+of+the+proteasome-associated+deubiquitinating+enzyme+USP14%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanisms of the proteasome-associated deubiquitinating enzyme USP14.</a> EMBO J. 24 (21), 3747-3756 (2005).</li>
<li>Gorka, M., Magnussen, H. M., Kulathu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+biology+tools+to+study+deubiquitinases+and+UBL+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical biology tools to study deubiquitinases and UBL proteases.</a> Semin Cell Dev Biol. 132, 86-96 (2022).</li>
<li>Faesen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+modulation+of+USP+activity+by+internal+regulatory+domains%2C+interactors%2C+and+eight+ubiquitin+chain+types%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">The differential modulation of USP activity by internal regulatory domains, interactors, and eight ubiquitin chain types.</a> Chem Biol. 18 (12), 1550-1561 (2011).</li>
<li>Mevissen, T. E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OTU+deubiquitinases+reveal+mechanisms+of+linkage+specificity+and+enable+ubiquitin+chain+restriction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">OTU deubiquitinases reveal mechanisms of linkage specificity and enable ubiquitin chain restriction analysis.</a> Cell. 154 (1), 169-184 (2013).</li>
<li>Kwasna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+ZUFSP%2FZUP1%2C+a+distinct+deubiquitinase+class+important+for+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of ZUFSP/ZUP1, a distinct deubiquitinase class important for genome stability.</a> Mol Cell. 70 (1), 150-164.e6 (2018).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-exome+sequencing+of+405+unresolved+families+identifies+seven+novel+intellectual+disability+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">X-exome sequencing of 405 unresolved families identifies seven novel intellectual disability genes.</a> Mol Psychiatry. 21 (1), 133-148 (2016).</li>
<li>Hartmann, I. Shaker Orbit - Revolving in Space Around the Samples? Eppendorf Lab Academy. Eppendorf Lab Academy. , at 
 <a target="_blank" href="https://www.eppendorf.com/us-en/lab-academy/lab-solutions/others/shaker-orbit-revolving-in-space-around-the-samples">https://www.eppendorf.com/us-en/lab-academy/lab-solutions/others/shaker-orbit-revolving-in-space-around-the-samples</a> (2020).</li>
<li>Smith, D. B., Johnson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+purification+of+polypeptides+expressed+in+Escherichia+coli+as+fusions+with+glutathione+S-transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase.</a> Gene. 67 (1), 31-40 (1988).</li>
<li>Ritorto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+DUB+activity+and+specificity+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Screening of DUB activity and specificity by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nat Commun. 5, 4763(2014).</li>
<li>Bustos, F., Bustos, F. Immunoblotting using precast gels. , protocols.io (2024).</li>
<li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+purification+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Overview of the purification of recombinant proteins.</a> Curr Protoc Protein Sci. 80, 6.1.1-6.1.35 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Amersham Protran 0,45 NC 200 mm &vezes; 200 mm 25/PK</td><td>Cytiva</td><td>10600041</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de amônio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC205872500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760 25</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ubiquitina (Camundongo monoclonal)</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 646302, RRID:AB_1659269</td><td>(WB: 1:1000)</td></tr><tr><td>Anti-GST (Ovino policlonal)</td><td>MRC-PPU Reagentes e Serviços</td><td>Cat# S902A Terceiro sangramento</td> <td>(WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/</td></tr> <tr><td>Frascos de Cultura Defletores 2 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-042-5N</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagent</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-25</td><td></td></tr><tr><td>Completo, comprimidos inibidores de protease</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>5056489001</tr><tr><td>Econo-Coluna 1.5 &vezes; 5 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7371507</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer F1.5&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-205</td><td></td></tr><tr><td>Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td>https://www.adobe.com/products/illustrator.html</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>https://www.licor.com/bio/image-studio/ </td></tr><tr><td>Inkscape</td><td>Inkscape</td><td></td><td>https://inkscape.org/</td></tr> <tr><td>Invitrogen 4-12% NuPAGE 1mm 1mm 12 well gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropil-b-D-Tiogalactopiranosídeo)</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-109</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Anticorpo Secundário IgG Anti-Cabra de Burro</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>Cat# 926-32214</td>(<td>WB: 1:10000)</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Anticorpo Secundário IgG Anti-Rato de Burro</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>Cat# 926-32212</td><td>(WB: 1:10000)</td></tr><tr><td>Isotemp Digital Dry Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>88860022</td><td></td></tr><tr><td>K63 Di-Ubiquitina</td><td>South Bay Bio LLC</td><td>SBB-UP0072</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Agar Genesee Scientific</td><td>11-119</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-118</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Gold Biotechnology</td><td>L-040-100</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 Agitador Orbital de Bancada</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE4000-7</td><td></td></tr><tr><td>MES-SDS Running Buffer</td><td>Boston Bioproducts Inc</td><td>BP-177</td><td></td></tr><tr><td>Mini Tube Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-051</td><td></td></tr><tr><td>NuPage LDS Sample buffer 4x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Odisseia&nbsp; Fc Imager</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>43214</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26620</td><td></td></tr><tr><td>pGEX6P1 humano USP27X</td><td>MRC-PPU Reagentes e Serviços</td><td>DU21193</td><td>https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/</td></tr> <tr><td>pGEX6P1 humano USP27X F313V</td><td>Addgene</td><td>225715</td><td>Koch et at 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>pGEX6P1 humano USP27X S404N</td><td>Addgene</td><td>225717</td><td>Koch et at 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>pGEX6P1 humano USP27X Y381H</td><td>Addgene</td><td>225716</td><td>Koch et at 2024 (PMID: 38182161)</td></tr><tr><td>Pierce Glutathione Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16100</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonila)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P-470-10</td><td></td></tr><tr><td>Polissorbato 20 (Tween 20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC233360010</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta 2 Células Competentes</td><td>Millipore Sigma</td><td>71402-M</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-216</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 250</td><td>Branson</td><td>100-132-135</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus Centrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (Cloridrato de fosfina Tris-(carboxietil)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>TCEP10</td><td></td></tr><tr><td>Pó de Caldo Fantástico</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-225</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-146</td><td></td></tr><tr><td>Módulo XCell SureLock Mini-Cell e XCell II Blot&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EI0002</td><td></td></tr></tbody></table>

medindo a atividade enzimática de enzimas desubiquitilantes associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento por meio de um ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

Para determinar o impacto das variantes associadas ao XLID105 na atividade catalítica do USP27X, as proteínas USP27X do tipo selvagem marcadas com GST e as proteínas F313V, Y381H e S404N USP27X associadas ao XLID105 foram purificadas de bactérias. Essas variantes estão localizadas dentro do domínio catalítico USP do USP27X (Figura 2A). Como o USP27X foi relatado anteriormente como clivando as cadeias de ubiquitina K6331, o USP27X do tipo selvagem e as proteínas F313V, Y381H e S404N USP27X associadas ao XLID105 foram incubadas com cadeias de di-ubiquitina ligadas a K63 por 1 h. Essas amostras foram separadas via SDS-PAGE32, e as proteínas ubiquitina e USP27X foram analisadas via immunoblotting. O USP27X do tipo selvagem induz clivagem de di-ubiquitina, gerando mono-ubiquitina (Figura 2B e Figura Suplementar 1). XLID105 proteínas variantes F313V, Y381H e S404N USP27X associadas a não clivaram essas cadeias. Como as variantes F313V, Y381H e S404N interrompem a atividade catalítica do USP27X, a interrupção funcional do USP27X parece ser o principal mecanismo subjacente ao XLID1057. Quantificação adicional e experimentos complementares foram relatados anteriormente7.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67367/67367fig02v2.jpg"> 
Figura 2: Impacto das variantes XLID105 na atividade desubiquitilante do USP27X. (A) Diagrama da estrutura da proteína USP27X humana, mostrando o número de resíduos e a localização das variantes XLID105 avaliadas no domínio USP (roxo). (B) As variantes USP27X e XLID105 do tipo selvagem marcadas com GST (F313V, Y381H e S404N) foram incubadas com cadeias de di-ubiquitina K63 pelos tempos indicados. A análise de immunoblot foi realizada usando anticorpos anti-GST (USP27X) e ubiquitina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/67367fig02largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Borrões não cortados da Figura 2B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/R1%20Koch%202024%20Jove%20supplemental%20Figure.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Medindo a atividade enzimática de enzimas desubiquitilantes associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento por meio de um ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

measuring-enzymatic-activity-neurodevelopmental-disorder-associated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Ubiquitinação é uma modificação fundamental posttranslational realizado por um conjunto de três enzimas. Mutações dos genes envolvidos nesta modificação estão associadas com diferentes tipos de doenças humanas. Aqui, descrevemos os protocolos para detectar ubiquitinação de proteínas em células...

Detecção de Ubiquitinação Protein

O protocolo atual detalha um método para medir a atividade das enzimas funcionalmente homóloga deubiquitinating. Sondas especializados modificar covalentemente o enzima e permitir a detecção. Este método tem o potencial para identificar novos alvos terapêuticos.

Método para medir a actividade de enzimas deubiquitinating em linhas celulares e amostras de tecidos

A ubiquitinação é uma modificação pós-translacional que desempenha papéis importantes em processos celulares e é fortemente coordenada pela deubiquitinação. Os defeitos em ambas as reações fundamentam patologias humanas. Nós fornecemos protocolos para a realização de ubiquitinação e reação de deubiquitinação in vitro usando componentes purificados.

Ensaios de Ubiquitinação e Deubiquitinação in vitro de histonas Nucleossomal

Este protocolo é projetado para quantificar eficientemente a atividade do sistema de ubiquitina-proteasome (UPS) em diferentes compartimentos celulares do cérebro de roedores. Os usuários podem examinar o funcionamento da UPS em frações nucleares, citoplasmáticas e sinápticas no mesmo animal, reduzindo a quantidade de tempo e o número de animais necessários para realizar essas análises complexas.

Quantificando a ubiquitina subcelular-atividade de proteasome no cérebro de roedores

Este método descreve a avaliação das mudanças globais na topologia da cadeia de ubiquitina. A avaliação é realizada pela aplicação de uma abordagem de proteômica direcionada baseada em espectrometria de massa.

Análise da cadeia de Ubiquitin por monitoramento de reação paralela

O presente estudo fornece protocolos de ensaio de on-lona in vitro detalhados para a análise da atividade catalítica da ubiquitina E3. Proteínas recombinantes foram expressas usando sistemas procarióticos como a cultura Escherichia coli.

In vitro Análise da Função Ligase E3 Ubiquitin

Um método simples e escalável foi desenvolvido para avaliar o significado funcional de variantes missense em Ube3a, um gene cuja perda e ganho de função estão ligados à síndrome de Angelman e ao transtorno do espectro do autismo.

Um método escalável baseado em células para a avaliação funcional de variantes do Ube3a

O experimento usado aqui mostra um método de docking molecular combinado com tecnologias de sonda para prever e validar a interação entre pequenas moléculas da medicina tradicional chinesa e alvos proteicos.

Triagem de compostos da medicina tradicional chinesa para inibir a atividade de UCHL3 com base na tecnologia de sonda enzimática de acoplamento molecular e desubiquitinação

Um ensaio de alto rendimento para triagem enzimática é descrito. Este kit de ensaio multiplexado pronto para uso é composto por substratos Chromogênicos Polymer Hydrogel (CPH) pré-escolhidos e substratos complexos de Chromogênico B iomassa (ICB). As enzimas-alvo são endoenzimas e proteases degradadoras de polissacarídeos.

High-throughput screening de enzimas Carboidratos-degradantes Usando Novel Insolúvel substrato cromogénico Kits de Ensaio

Quinase cyclin-dependente 1 (Cdk1) é ativada na fase G2 do ciclo celular e regula muitos caminhos celulares. Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio da quinase em vitro Cdk1, que permite a identificação dos sítios de fosforilação Cdk1-específicos para o estabelecimento de alvos celulares deste importante quinase.

Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

Aprenda a medir a atividade de enzimas desubiquitilantes associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento usando ensaios de clivagem de cadeias de ubiquitina in vitro. Este método permite analisar variantes genéticas sem conhecimento prévio de substratos.

Medindo a atividade enzimática de enzimas desubiquitilantes associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento por meio de um ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro (Vídeo) | JoVE Journal

Medindo a atividade enzimática de enzimas desubiquitilantes associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento por meio de um ensaio de clivagem da cadeia de ubiquitina in vitro

Explorar mais vídeos