Um modelo de camundongo de transformação hemorrágica induzida por hiperglicemia aguda combinada com isquemia focal transitória

Na presente pesquisa, pretendemos fornecer um protocolo abrangente e detalhado para estabelecer um modelo animal altamente reprodutível de transformação radical humana usando reperfusão de oclusão da artéria cerebral média em camundongos C57BL / 6 com hiperglicemia aguda.

Comparado a outras técnicas, nosso protocolo demonstra boa repetibilidade, alta estabilidade e baixa mortalidade animal, tornando-o adequado para uso generalizado em pesquisas pré-clínicas de transformação hemorrágica.

No futuro, nosso foco será investigar o impacto da transformação hemorrágica na neurológica e explorar o mecanismo subjacente.

[Instrutor] Para começar, limpe a plataforma cirúrgica e a área de trabalho ao redor com etanol a 75%. Ligue o interruptor de aquecimento e ajuste a temperatura para 37 graus Celsius. Mova o mouse anestesiado para a plataforma cirúrgica em decúbito dorsal e prenda seus membros com fita adesiva. Em seguida, 15 minutos antes do procedimento cirúrgico, administrar por via intraperitoneal glicose a 30% ou soro fisiológico aos camundongos. Usando um bisturi, faça uma incisão horizontal com uma abertura de 1,5 centímetros ao longo da linha média do pescoço. Realize a dissecção romba dentro da área do triângulo invertido para identificar e separar a artéria carótida comum esquerda. Usando uma pinça oftálmica, disseque o nervo vago adjacente à artéria carótida comum e o tecido mucoso ao redor dos vasos sanguíneos. Com uma sutura absorvível de ácido poliglicólico 5-0, faça uma campainha na artéria carótida comum, mantendo a sutura destensionada. Em seguida, separe para cima ao longo da artéria carótida comum. Agora, separe a bifurcação para expor totalmente a artéria carótida externa e interna. Enrole e amarre firmemente uma sutura absorvível de ácido poliglicólico 5-0 ao redor da artéria carótida externa distalmente da bifurcação. Em seguida, usando duas pinças leves de artéria arterial microsserrafina, prenda temporariamente a artéria carótida comum e a artéria carótida interna para bloquear o fluxo sanguíneo. Em seguida, estique a gravata de sutura na artéria carótida externa distal e na artéria carótida comum para endireitar o segmento da artéria carótida externa. Agora, use uma microtesoura para fazer uma pequena incisão entre os dois laços de sutura na artéria carótida externa. Insira uma sutura de monofilamento revestida de silicone de 30 milímetros de comprimento na artéria carótida externa. Enrole e amarre levemente uma segunda sutura absorvível de ácido poliglicólico 5-0 na artéria carótida externa perto da bifurcação para evitar que a sutura do monofilamento recue. Em seguida, corte completamente a artéria carótida externa distal à ligadura permanente e remova a pinça da artéria da artéria carótida interna. Em seguida, retire a sutura para a bifurcação da artéria carótida comum. Retraia e gire cuidadosamente o coto da artéria carótida externa. Ajuste a direção da sutura e insira-a de 9 a 10 milímetros da bifurcação da artéria carótida comum na artéria carótida interna para bloquear a artéria cerebral média. Em seguida, aperte a segunda sutura absorvível de ácido poliglicólico ao redor da artéria carótida externa e remova a pinça da artéria carótida comum. Depois de reanestesiar o mouse, usando uma pinça de artéria microclipe, prenda a artéria carótida comum. Retraia parcialmente o monofilamento da artéria carótida interna até que a ponta revestida de silicone se torne visível através da artéria carótida interna. Em seguida, coloque outra pinça de artéria microclip na artéria carótida interna acima da ponta revestida de silicone. Retire completamente o monofilamento e lege firmemente o coto da artéria carótida externa. Finalmente, remova a pinça da artéria microclip da artéria carótida interna e da artéria carótida comum, respectivamente. Para começar, limpe a cauda do rato com uma bola de algodão embebida em álcool para tornar a veia da cauda totalmente hiperêmica. Usando uma tesoura cirúrgica, corte a ponta da cauda em um a dois milímetros. Aperte suavemente ao longo da raiz da cauda até a ponta para facilitar o fluxo sanguíneo para fora da incisão. Em seguida, posicione o sample tanque de absorção do papel de teste na borda da gota de sangue. Leia a leitura do medidor de glicose no sangue e registre o resultado. Para medição do fluxo sanguíneo cerebral, segure a ponta da sonda de fluxometria doppler a laser perpendicular à superfície do crânio parietal esquerdo até que um fluxo estável seja lido e registre esse valor. Depois de remover o cérebro do camundongo MCAO sacrificado, coloque o tecido cerebral em uma matriz cerebral de roedor e corte-o em fatias coronais de dois milímetros. Transfira as fatias para uma placa de 24 poços e incube-as com solução de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio a 2% a 37 graus Celsius por 15 minutos. Depois, corte as seções de tecido da placa de 24 poços com uma pinça curva e organize-as na placa de varredura de vidro. Manchar a fatia fixa do cérebro com solução de hematoxilina durante três minutos. Diferencie-o mergulhando a fatia em álcool de ácido clorídrico a 5% por cinco segundos. Em seguida, desidrate e hialinize a fatia usando soluções de etanol gradiente e xileno. Monte a seção com resinas neutras. 23 horas após o MCAO, injete a solução de Evans Blue a 2% no camundongo e colha o cérebro. Depois de homogeneizar e centrifugar o tecido, transferir o líquido sobrenadante para outro tubo de centrifugação e diluí-lo quatro vezes com etanol. Medir a absorvância do líquido sobrenadante a 620 nanómetros utilizando um espectrofotómetro. Injete FITC-dextrano na veia da cauda 24 horas após o MCAO e deixe-o circular no sangue por 10 minutos. Depois de fixar o tecido cerebral, incorpore o tecido cerebral usando um composto de temperatura de corte ideal e corte-o em seções de 30 micrômetros de espessura. Transfira as seções para uma lâmina de microscópio usando um laço de inoculação, garantindo que elas adiram à superfície da lâmina. Monte as seções de tecido cerebral usando um meio de montagem contendo 4',6-diamidino-2-fenilindo. Os níveis de glicose no sangue aumentaram significativamente pós-MCAO em camundongos injetados com glicose em comparação com os grupos salinos. Nenhum infarto visível foi observado em fatias de cérebro no grupo sham com solução salina ou sham com glicose. O grupo MCAO com glicose apresentou um volume de infarto cerebral significativamente maior em comparação com o grupo MCAO com solução salina. Múltiplas hemorragias puntiformes foram observadas no hemisfério isquêmico do MCAO com o grupo glicose, que estavam ausentes nos outros grupos. Infiltração significativa de células sanguíneas foi observada nas regiões de infarto do córtex e estriado no grupo MCAO com glicose. A permeabilidade ao azul de Evans e o vazamento de FITC-dextrana foram marcadamente maiores no grupo MCAO com glicose em comparação com o grupo MCAO com solução salina.