Name: Imagem ao vivo estendida de nichos de células-tronco germinativas de Drosophila melanogaster fêmea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprenda a realizar imagem ao vivo estendida de células-tronco germinativas em nichos ovarianos de Drosophila melanogaster. Este método permite monitorar a divisão celular e a dinâmica do espectrossomo ao longo do ciclo celular completo.

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Agradecemos a Acaimo González Reyes e María Olmedo López pelos comentários úteis sobre o manuscrito. Este estudo foi apoiado por PID2021-125480NB-I00 (H. S-G), "Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor" da Junta de Andalucía (J. G-M), "Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos" do VI e VII PPIT-Universidade de Sevilha (P. R-R) e "Contrato de Acesso de I+D+i" do VI PPIT-Universidade de Sevilha (P. R-R). Estendemos nossos agradecimentos à Company of Biologists Ltd por gentilmente fornecer os direitos de compartilhar imagens adaptadas da publicação original (doi: 10.1242 / DEV.199716).

NOTA: A etapa 1.4 deve ser feita com pelo menos 2 dias de antecedência. Os passos 2.1 e 2.2 podem ser feitos com 1 dia de antecedência.
1. Configuração pré-experimental I
<ol>
	<li>Prepare alíquotas de 100 μL de mistura de antibióticos estreptomicina/penicilina (10.000 U/mL de penicilina e 10 mg/mL de estreptomicina) e armazene a -20 °C até o uso.</li>
	<li>Prepare 15 mL das seguintes soluções usando água pura autoclavada, armazene-as a 4 ° C e use-as dentro de um mês: Bicarbonato de sódio (NaHCO3) 0,1 M pH 8,0 e 0,1% Tween 20.</li>
	<li>Preparar o meio de cultura e a solução a seguir indicados numa capela de fluxo laminar para evitar contaminação. Use pontas e tubos de filtro esterilizados.
	<ol>
		<li>Preparar alíquotas de 2 ml de soro fetal bovino não diluído (FBS) e conservar a -20 °C até à utilização em condições assépticas.</li>
		<li>Prepare o meio Drosophila de Schneider suplementado com 15% de FBS e 0,6% de mistura de antibiótico estreptomicina/penicilina. Preparar alíquotas de 7 ml e conservar a 4 °C. Uma alíquota é suficiente para duas placas MatTek (consulte a seção 2).
		<ol>
			<li>Prepare a solução de Ringer (NaCl 128 mM, KCl 2 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 4 mM, Sacarose 35,5 mM, Hepes 5 mM em água pura autoclavada; pH 6,9). Preparar alíquotas de 1 ml e conservar a -20 °C até à utilização.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Colete moscas de 1-2 dias expressando constitutiva e ubíquamente a proteína Par-1 fundida à GFP (linha poli Ubiquitina-mGFP6: :p ar-1) em um novo tubo com comida de mosca suplementada com fermento em pó. Cultive-os por 2 dias a 25 °C em uma estufa antes da dissecação. 
	NOTA: Esta etapa pode ser feita com qualquer repórter de interesse marcado com fluorescência.</li>
</ol>
2. Revestimento e preparação da placa de fundo de vidro
<ol>
	<li>Coloque uma gota de 3 μL de um adesivo Cell-Tak específico (doravante denominado adesivo para células e tecidos) no centro da lamínula de uma placa revestida de poli-D-lisina de 35 mm (prato de fundo de vidro, consulte Tabela de Materiais) sem espalhamento manual. Use pontas estéreis. 
	NOTA: O adesivo para células e tecidos deve ser armazenado a 4 °C. No caso de experimentos com duas condições genéticas (normalmente, condições de controle e mutantes), coloque duas gotas individuais e bem separadas do adesivo na mesma placa de fundo de vidro. Isso garantirá que ambos os fundos genéticos sejam visualizados nas mesmas condições.</li>
	<li>Imediatamente após, adicione um volume igual (3 μL nesta configuração de protocolo) de 0,1 M NaHCO3 pH 8,0 cuidadosamente na gota adesiva de 3 μL conforme recomendado pelo fabricante e misture por pipetagem.</li>
	<li>Para evaporação completa, incubar a placa à temperatura ambiente (RT) durante 20 min e depois mantê-la a 4 °C durante a noite para ser utilizada no dia seguinte. Em alternativa, incubar a placa preparada a 37 °C durante 25 min até à evaporação completa e passar directamente para o passo seguinte. Em ambos os casos, mantenha a placa com sua tampa. Use pontas estéreis.</li>
	<li>Deixe o prato de fundo de vidro preparado atingir o RT, colocando-o na bancada por 15-20 min antes de usar.</li>
	<li>Lave 3 vezes o prato preparado com cuidado. Evite tocar e perturbar a(s) camada(s) adesiva(s). Em cada lavagem, adicione 6 μL de água pura autoclavada e, em seguida, remova a água usando uma ponta limpa para cada uma das três lavagens para eliminar os resíduos da solução de NaHCO3.</li>
	<li>Deixe a evaporação completa da água colocando a placa limpa e preparada em RT enquanto disseca por 5-10 min com a tampa para evitar partículas de poeira.</li>
</ol>
3. Dissecção do ovário de Drosophila e isolamento e montagem do ovário
NOTA: A dissecção do ovário é realizada em solução de Ringer (em vez de meio de Schneider) sem FBS para evitar a presença de proteínas que possam interferir na aderência do tecido da amostra ao adesivo.
<ol>
	<li>Limpe um prato de dissecação de três poços, fórceps e agulhas de dissecção com etanol a 70% antes de começar.</li>
	<li>Adicione um volume suficiente (~ 200 μL) de solução de Ringer em cada um dos três poços.</li>
	<li>Dissecar os ovários de 5 fêmeas alimentadas com leveduras em 200 μL de solução de Ringer no primeiro poço com a ajuda de dois pares de pinças seguindo os procedimentos padrão10,11. Pegue a fêmea Drosophila na interseção do tórax e abdômen com uma das pinças. Em seguida, rasgue suavemente a cutícula na parte posterior do abdômen e puxe a cutícula do abdômen até que os dois ovários fiquem expostos.</li>
	<li>Transfira os ovários dissecados para o segundo poço para reduzir a contaminação com restos de outros tecidos ou detritos resultantes da dissecção.</li>
	<li>Remova a bainha muscular de 15-20 ovaríolos com a ajuda de um estereomicroscópio (zoom 8X-13,5X) com iluminação de diodo emissor de luz (LED) e pinça de ponta fina. Use um par de pinças para ancorar todo o corpo do ovário e use a segunda para agarrar suavemente uma câmara de ovos em estágio avançado e alongar suavemente até que o músculo se quebre e fique para trás. 
	NOTA: É essencial evitar danos à germária apenas reduzindo o contato com esta parte dos ovários. Remova as câmaras de ovos anteriores aos estágios 8-9.</li>
	<li>Transfira um a um os 15-20 ovaríolos livres de bainha muscular usando a pinça para o terceiro poço contendo 200 μL de meio de Ringer.</li>
	<li>Pré-umedeça uma ponta de 20-200 μL com 0,1% de Tween 20 por pipetagem. Isso evita a adesão dos ovaríolos às paredes de plástico da ponta.</li>
	<li>Transferir 6 μL de solução de Ringer contendo os ovaríolos sem bainha muscular usando uma ponta pré-umedecida para a placa adesiva preparada (mantida em RT). 
	NOTA: Evite todo o contato entre a ponta e a camada adesiva para evitar o descolamento da germária após a deposição do ovaríolo (próximo passo). Aproximadamente 30% dos germários não aderem conforme o esperado.</li>
	<li>Para garantir que os ovaríolos transferidos adiram à superfície adesiva, pressione-os cuidadosamente até a parte inferior da gota de Ringer até que entrem em contato com a superfície adesiva usando uma agulha de dissecção ou fórceps. 
	NOTA: Não tente reorganizar os ovaríolos depois que eles se assentarem.</li>
	<li>Encha a placa MatTek cuidadosamente com 3 mL de meio Schneider suplementado com a mistura de antibiótico 15% FBS e estreptomicina/penicilina 0,6% (etapa 1.3). Para evitar o descolamento dos ovaríolos, adicione lentamente 1 mL de cada vez ao redor da borda externa da placa.</li>
	<li>Transportar a placa contendo os ovaríolos sem bainha muscular em uma superfície plana para a estação de microscópio.</li>
</ol>
4. Imagens ao vivo usando um microscópio confocal
<ol>
	<li>Coloque a placa na objetiva 63x de um microscópio de disco giratório ou um microscópio confocal (equipamento semelhante pode ser usado) e focalize a amostra. Selecione o plano z do meio para cada germarium.</li>
	<li>Configure os seguintes parâmetros experimentais: tipo de captura: lapso de tempo 3D, ajuste a potência do laser de 70/100, comprimento de onda de excitação: 488 nm, alcance da pilha z: 30 μm e distância entre pilhas Z: 1,2 μm, duração: 17 h, intervalo entre pontos de tempo: a cada 10 min.</li>
	<li>Se disponível, usando uma opção de várias posições, redefina as coordenadas XY das amostras e selecione um plano Z no meio de cada germarium, pois as pilhas z serão centralizadas nessa posição. Inicie a aquisição. 
	NOTA: Como a largura normal de um germário é de 30 μm, cada pilha Z terá ~ 25-27 seções. Dependendo do confocal, pelo menos 25 germários podem ser fotografados dentro dos intervalos de 10 minutos. Normalmente, são usadas objetivas corrigidas por planapo de imersão em óleo de 40x/1,30 NA ou 63x/1,40 NA.</li>
	<li>Analise as imagens no tempo e no eixo Z para visualizar mudanças específicas na morfologia do espectrossomo usando o software Imaris ou ImageJ (Fiji12,13. Horários específicos em sua observação são exibidos (Figura 1B'). Para montar os filmes, selecione manualmente o melhor plano Z em cada ponto de tempo.</li>
</ol>

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

<ol><li>Li, L., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+niche%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cell niche: structure and function.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 605-631 (2005).</li>
<li>Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+physiological+control+of+germline+stem+cell+lineages+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Local and physiological control of germline stem cell lineages in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 213 (1), e234(2019).</li>
<li>Eliazer, S., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+niche%3A+studies+from+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).</li>
<li>Rojas-Ríos, P., Guerrero, I., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+delivery+of+Hedgehog+regulates+the+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+to+maintain+germline+stem+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated delivery of Hedgehog regulates the expression of bone morphogenetic proteins to maintain germline stem cells in Drosophila.</a> PLoS Biol. 10 (4), e1001298(2012).</li>
<li>Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+plasticity+of+stem+cell+niches%3A+a+general+property+behind+tissue+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the plasticity of stem cell niches: a general property behind tissue homeostasis and repair.</a> Stem Cells. 32 (4), 852-859 (2014).</li>
<li>Deng, W., Lin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrosomes+and+fusomes+anchor+mitotic+spindles+during+asymmetric+germ+cell+divisions+and+facilitate+the+formation+of+a+polarized+microtubule+array+for+oocyte+specification+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Spectrosomes and fusomes anchor mitotic spindles during asymmetric germ cell divisions and facilitate the formation of a polarized microtubule array for oocyte specification in Drosophila.</a> Dev Biol. 189 (1), 79-94 (1997).</li>
<li>Huynh, J. R., Shulman, J. M., Benton, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-1+is+required+for+the+maintenance+of+oocyte+fate+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-1 is required for the maintenance of oocyte fate in Drosophila.</a> Development. 128 (7), 1201-1210 (2001).</li>
<li>Villa-Fombuena, G., Lobo-Pecellín, M., Marín-Menguiano, M., Rojas-Ríos, P., González-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+ovarian+niche+shows+spectrosome+and+centrosome+dynamics+during+asymmetric+germline+stem+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila ovarian niche shows spectrosome and centrosome dynamics during asymmetric germline stem cell division.</a> Development (Cambridge). 148 (18), dev199716(2021).</li>
<li>De Cuevas, M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+Drosophila+fusome+and+its+implications+for+oocyte+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the Drosophila fusome and its implications for oocyte specification.</a> Development. 125 (15), 2781-2789 (1998).</li>
<li>Wong Li, C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Drosophila ovaries.</a> J Vis Exp. (1), 52(2006).</li>
<li>Merkle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection%2C+fixation%2C+and+standard+staining+of+adult+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissection, fixation, and standard staining of adult Drosophila ovaries.</a> Methods Mol Biol. 2626, 49-68 (2023).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+correction+ImageJ+plugin+for+compensating+the+photobleaching+of+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences.</a> F1000Res. 9, 95(2020).</li>
<li>Duan, T., Cupp, R., Geyer, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+female+germline+stem+cells+undergo+mitosis+without+nuclear+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila female germline stem cells undergo mitosis without nuclear breakdown.</a> Curr Biol. 31 (7), 1602-1610 (2021).</li>
<li>Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+imaginal+disc+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila imaginal disc development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (32), 14217-14222 (2010).</li>
<li>Dye, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods Mol Biol. 2540, 275-285 (2022).</li>
<li>Sohr, A., Du, L., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+Drosophila+wing+imaginal+disc+culture+and+furin+inhibitor+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo Drosophila wing imaginal disc culture and furin inhibitor assay.</a> Bio Protoc. 9 (16), e3336(2019).</li>
<li>Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+reveals+hub+cell+assembly+and+compaction+dynamics+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+testis+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche.</a> Dev Biol. 446 (1), 25-34 (2019).</li>
<li>Gärthner, S. M. K., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+Drosophila+pupal+testis+and+single+male+germ-line+cysts%3A+dissection%2C+imaging%2C+and+pharmacological+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment.</a> J Vis Exp. 91, e51868(2014).</li>
<li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Dev Cell. 50 (3), 296-310 (2019).</li>
<li>Jackson, J. A., Imran Alsous, J., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+nurse+cell+behavior+in+late+stages+of+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of nurse cell behavior in late stages of Drosophila oogenesis.</a> Methods Mol Biol. 2626, 191-206 (2023).</li>
<li>Díaz de la Loza, M. C., Díaz-Torres, A., Zurita, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+levels+regulate+tissue+migration+and+anterior-posterior+polarity+during+egg+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Laminin levels regulate tissue migration and anterior-posterior polarity during egg morphogenesis in Drosophila.</a> Cell Rep. 20 (1), 121-133 (2017).</li>
<li>Christophorou, N., Rubin, T., Bonnet, I., Piolot, T., Arnaud, M., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-driven+nuclear+rotations+promote+meiotic+chromosome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-driven nuclear rotations promote meiotic chromosome dynamics.</a> Nat Cell Biol. 17 (11), 1388-1398 (2015).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
<li>Zielke, N., Korzelius, J., van Straaten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fly-FUCCI%3A+a+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Fly-FUCCI: a versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Rep. 7 (2), 588-598 (2014).</li>
<li>Hinnant, T. D., Alvarez, A. A., Ables, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+remodeling+of+the+cell+cycle+accompanies+differentiation+in+the+Drosophila+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal remodeling of the cell cycle accompanies differentiation in the Drosophila germline.</a> Dev Biol. 429 (1), 118-131 (2017).</li>
<li>Hsu, H. J., LaFever, L., Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+controls+normal+and+tumorous+germline+stem+cells+via+insulin-dependent+and+-independent+mechanisms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Diet controls normal and tumorous germline stem cells via insulin-dependent and -independent mechanisms in Drosophila.</a> Dev Biol. 313 (2), 700-712 (2008).</li>
<li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development (Cambridge). 143 (8), 1375-1382 (2016).</li>
<li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Dev Biol. 314 (2), 360-372 (2008).</li>
<li>Ables, E. T., Drummond-Barbosa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+E+controls+Drosophila+female+germline+stem+cell+maintenance+independently+of+its+role+in+proliferation+by+modulating+responsiveness+to+niche+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Cyclin E controls Drosophila female germline stem cell maintenance independently of its role in proliferation by modulating responsiveness to niche signals.</a> Development (Cambridge). 140, 4267-4276 (2013).</li>
<li>Lin, H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cell+division+and+egg+chamber+development+in+transplanted+Drosophila+germaria%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cell division and egg chamber development in transplanted Drosophila germaria.</a> Dev Biol. 159 (1), 140-152 (1993).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui apresentamos um protocolo para monitorar o nicho GSC de Drosophila melanogaster por um período prolongado de tempo, até 16 h. A maioria dos protocolos para filmar processos biológicos de Drosophila ex vivo concentra-se em janelas de tempo mais curtas e vários exemplos podem ser encontrados para discos de asas imaginárias 15,16,17, gônadas embrionárias 18,19 ou ovários 20,21,22,23. Certamente, a duração da aquisição da imagem depende do processo de desenvolvimento sob escrutínio. Enquanto os eventos transitórios podem ocorrer em um intervalo que pode variar de milissegundos a segundos, dependendo do tipo de célula e das condições fisiológicas24, outros processos, como a divisão celular, podem exigir horas ou dias de filmagem para serem observáveis. Em particular, o ciclo celular de GSCs fêmeas de Drosophila leva aproximadamente 12-14 h para ser concluído25. Em Villa-Fombuena et al. (2021)8, a estimativa da duração do ciclo completo foi de 15,5 h, conforme determinado pelo estudo das alterações na morfologia do espectrossomo. A combinação desse método de imagem com marcadores de cromatina e/ou a tecnologia Fly-FUCCI26 mostrou que um GSC normalmente se dividia a cada 15,5 h e que as durações médias das fases do ciclo celular eram: M (forma redonda, 22 min), G1 (formas redondas G1, plugue e barra, 3,45 h), S (forma de fusão, 43 min) e G2 (forma de fusão, Ponto de exclamação e formas redondas, 10,5 h). Dados brutos sobre a duração das fases do ciclo celular são mostrados em Villa-Fombuena et al.8. Essas observações foram consistentes com estudos anteriores que usaram imagens fixas para analisar o ciclo celular do GSC e a morfologia do fusome 25,27,28. Além disso, este método in vivo pode ajudar a decifrar as consequências a jusante da divisão anormal do GSC e / ou dinâmica do espectrossomo na seleção de oócitos a jusante, uma vez que o fusome desempenha um papel importante nesses eventos. Além disso, este protocolo pode ser aplicado para analisar a taxa de divisão do GSC em mutantes estabelecidos ou novos.
A aquisição contínua de imagens durante longas horas implica uma série de questões críticas a serem consideradas, principalmente a manutenção da integridade do tecido e sua funcionalidade e a preservação da fluorescência da amostra. A manutenção das condições ambientais adequadas das células de nicho é essencial para evitar mau funcionamento, estresse, parada do ciclo celular ou morte celular. Nas condições deste estudo, as GSCs podem entrar em mitose, uma etapa crítica para indicar a saúde do tecido, mesmo após 12 h ou mais durante as filmagens. Assim, supomos que os germários cultivados mantêm sua integridade e funcionalidade durante a maior parte do tempo de imagem. Da mesma forma, devido à nova produção de material GFP:Par-1 (ver Villa-Fombuena et al. 2021)8 ao longo do ciclo celular, e como reduzimos a aquisição de imagens para apenas uma vez a cada 10 minutos, mesmo os pontos de tempo mais próximos do final dos filmes retêm sinal suficiente para permitir sua análise. Em qualquer caso, o branqueamento da amostra pode ser potencialmente corrigido por plug-ins como a correção de branqueamento13.
Para imitar um ambiente adequado ex vivo, os tecidos dos insetos podem ser mantidos usando o meio de Schneider por um certo número de horas durante as filmagens com suplementação específica. É importante ressaltar que este protocolo não usa fatores de crescimento ou extrato de mosca além do FBS. Um estudo anterior mostrou que muitas GSCs são normalmente interrompidas no G2 e entram na fase M por altos níveis de insulina25. Assim, não adicionamos insulina às condições de cultura para evitar essa estimulação anormal do ciclo celular do GSC. A adição de FBS ao meio de dissecção também pode reduzir a chance de as câmaras de ovos grudarem na ponta da pipeta ou no prato de vidro durante a transferência do ovário21. Finalmente, o uso de antibióticos é apropriado para filmes prolongados para evitar a proliferação bacteriana e/ou fúngica. O crescimento excessivo de microrganismos nas placas de cultura pode alterar a homeostase do tecido e, portanto, afetar a divisão celular. Neste protocolo, o meio contém uma mistura de antibióticos (normalmente suplementados a 1% (100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). Da mesma forma, incubações longas podem afetar a eficiência dos antibióticos, e a substituição do meio pode ser considerada para prevenir a deterioração dos antibióticos.
A Drosophila germaria é circundada por uma bainha muscular tubular que é necessária para remover para evitar os movimentos peristálticos, de rotação e contração típicos desse tecido29,30. Assim, a remoção dessa bainha muscular melhora a observação dos sinais do repórter, permite o uso de configurações de configuração confocal para minimizar o branqueamento do sinal e o fotodano e permite imagens de alta resolução de tempo. No lado negativo, a contribuição da bainha muscular para a homeostase do tecido ainda é desconhecida. Assim, a sua supressão pode de alguma forma afetar o funcionamento normal do nicho do SGC. Outra desvantagem do sistema é que a germária pode se desprender do adesivo durante a filmagem e derivar no meio circundante. Portanto, as imagens podem mudar dentro de pontos de tempo ou mesmo durante a aquisição da série z fornecida. Se for esse o caso, diferentes plug-ins podem ser usados para corrigir o movimento da amostra no ImageJ, como os métodos de registro12.
Em resumo, criamos um método para adquirir filmes estendidos de germaria ao vivo. Embora este método tenha permitido uma definição detalhada do ciclo celular do GSC e como a dinâmica do espectrossomo se correlaciona com as diferentes fases do ciclo celular do GSC, estamos cientes de algumas das limitações inerentes ao nosso protocolo. Em primeiro lugar, a aquisição de imagens ocorre em um meio artificial onde as condições ambientais não recapitulam exatamente as condições in vivo . No entanto, como obtivemos resultados semelhantes em relação à morfologia do espectrossomo durante as diferentes fases do ciclo celular do que os relatados por outros autores usando tecido fixo31, acreditamos que este protocolo recapitula amplamente as condições in vivo . Em segundo lugar, embora a integridade e a funcionalidade do tecido pareçam não ser afetadas pelas culturas de 16 horas de duração, não avaliamos isso cuidadosamente. Idealmente, pode-se transplantar germários filmados de volta para um abdômen feminino e avaliar se ele pode produzir novas câmaras de ovos como o germário de controlefaz 32. O método de imagem ao vivo utilizado neste estudo é uma ferramenta valiosa para a análise da divisão assimétrica do GSC, particularmente para a biologia ovariana de Drosophila em geral. Além disso, essa abordagem é particularmente adequada para estudos farmacológicos de compostos químicos, fatores de crescimento ou nutrientes, pois podem ser suplementados diretamente nos meios de cultura. Além disso, podemos colocar amostras experimentais e de controle na mesma placa, minimizando as variações técnicas dentro dos experimentos.

Imagens ao vivo de processos biológicos são fundamentais para obter evidências experimentais diretas. A combinação de microscopia confocal avançada e a otimização de metodologias permite a exploração de múltiplos eventos biológicos com alta precisão. A otimização de etapas em protocolos como manipulação e dissecção de tecidos, preparação e preservação de amostras e configurações de aquisição de microscopia é fundamental para maximizar a confiabilidade e a robustez dos resultados obtidos. Aqui, apresentamos um protocolo para monitorar amostras para imagens estendidas, que é especialmente focado em ovários de Drosophila melanogaster. O ovário de Drosophila melanogaster é um excelente sistema modelo para a análise de uma ampla gama de processos de desenvolvimento. Entre muitos outros, este órgão reprodutor da mosca da fruta Drosophila melanogaster contém um nicho de células-tronco adultas muito bem definido. Este nicho GSC sustenta o desenvolvimento dos gametas femininos durante a idade adulta. Os ovários de Drosophila são compostos por aproximadamente 18 ovaríolos, onde as câmaras de ovos são desenvolvidas no germarium. Na ponta de cada germário, 2-4 GSCs são mantidas em um nicho celular somático formado principalmente por um filamento terminal de 8-10 células, uma roseta de 5-8 células de capa e 2-3 células de escolta anterior (Figura 1A). Esse nicho somático fornece aos GSCs sinais essenciais e suporte físico para manter sua stemness, controlar a proliferação e evitar a diferenciação1,2,3,4,5.
As GSCs normalmente se dividem assimetricamente para gerar uma nova célula-tronco que mantém contato com o nicho somático e uma célula-filha, o cistoblasto (CB), que perde o contato direto com as células do capuz somático e se diferencia. As GSCs e CBs contêm uma organela altamente dinâmica e citoplasmática, o espectrossomo, cuja principal função é a orientação correta do fuso mitótico durante a mitose6. O CB se divide 4 vezes com citocinese incompleta para desenvolver cistos de 16 células, onde uma das células germinativas se especifica no oócito e as outras 15 células se tornam células enfermeiras. O espectrossomo CB cresce em uma estrutura ramificada chamada fusome, que conecta as células germinativas interconectadas de 16 células. O espectrossomo é enriquecido em pequenas vesículas e proteínas esqueléticas, como a serina-treonina quinase Par-1 e o componente de membrana Hu-li tai shao (Hts)7. Durante o ciclo celular do GSC, o espectrossomo cresce pela adição de novo material e muda sua forma, permitindo a identificação das fases G1, S, G2 e M (Figura 1B)8,9.
Recentemente, implementamos um método de cultura ex vivo do germário Drosophila que permite a aquisição de imagens de GSCs vivas por até 16 h. Como essas células se dividem uma vez a cada 15,5 h em média8, esse método permite a filmagem de grandes porções do ciclo celular do GSC. Assim, em combinação com outras ferramentas, nosso método de cultura permitiu a descrição da morfologia do espectrossomo durante o ciclo celular do GSC e a análise da duração das diferentes fases do ciclo celular in vivo8 (Figura 1C). Aqui, fornecemos um protocolo detalhado desse método de imagem ao vivo estendido apoiado por um vídeo guiado passo a passo que descreve a metodologia (Figura 2).

<table><tbody><tr><td>Placa de vidro de 9 poços</td><td>Corning&nbsp;</td><td>7220-85</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td>CaCl2&middot; 2H2O; Para preparar a solução de Ringer</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354240</td><td>Adesivo para células e tecidos usado para fixar células ou seções de tecido a muitos tipos de superfícies, incluindo plástico, vidro, metal, polímero FEP e materiais biológicos.</td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #5&nbsp;</td><td>Pinça Finescience</td><td>11252-20</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Dumont #55&nbsp;</td><td>Finescience</td><td>11255-20</td><td>Dimensões 0.05 mm x 0.02 mm e comprimento 11 cm</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td>Qualificado, inativado pelo calor, aprovado pela UE, Origem na América do Sul&nbsp;</td></tr><tr><td>Pratos de fundo de vidro</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td>Prato de 35 mm, Nº 1.5 Lamínula, Diâmetro do Vidro de 10 mm,&nbsp; HEPES Revestido com Poli-D-Lisina</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>Para preparar a solução de Ringer</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td>MgCl2; Para preparar a solução de Ringer</td></tr><tr><td>Porta-agulhas</td><td>Roboz&nbsp;</td><td>RS-6061</td><td>Peso leve, cabo oco de aço inoxidável; 4 3/4" de comprimento.</td></tr><tr><td>Binóculo Nikon SMZ18&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>https://www.microscope. healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10.000 U/mL</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>KCl; Para preparar a solução de Ringer</td></tr><tr><td>, o Drosophila Medium da Schneider</td><td>Biowest&nbsp;</td><td>L0207</td><td>Meio de cultura de células para células de insetos</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8875&nbsp;</td><td>NaHCO3; &ge; 99,5%, cloreto de</td></tr><tr><td>sódio</td> em pó <td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>NaCl; Para preparar a solução de Ringer</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>&ge; 99,5% (GC); Para preparar a solução de Ringer</td></tr><tr><td>Agulha de Dissecção de Tungstênio</td><td>Roboz&nbsp;</td><td>RS-6064</td><td>0,25 mm, Ultra Fino, Ponta de 1 Mícron (Pk 10)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>para biologia molecular, líquido viscoso</td></tr><tr><td>Levedura em pó</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51475</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

imagem ao vivo estendida de nichos de células-tronco germinativas de drosophila melanogaster fêmea

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Os métodos de imagem ao vivo permitem a análise de processos celulares dinâmicos em detalhes e em tempo real. O ovário de Drosophila representa um excelente modelo para explorar a dinâmica de uma miríade de processos de desenvolvimento, como divisão celular, estaminalidade, diferenciação, migração, apoptose, autofagia, adesão celular, etc., ao longo do tempo. Recentemente, implementamos uma cultura ex vivo estendida e imagens ao vivo do nicho feminino de Drosophila GSC. Usando uma linhagem de Drosophila que abriga um transgene GFP::P ar-1 como exemplo, este método permite a visualização da divisão assimétrica das GSCs dentro de seu nicho e a descrição das mudanças na morfologia do espectrossomo ao longo do ciclo celular. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a cultura ex vivo de Drosophila germaria, permitindo a visualização prolongada do nicho feminino do GSC. É importante ressaltar que este protocolo é amplamente aplicável a GSCs de imagem ao vivo com várias proteínas de interesse marcadas com fluorescência que estão disponíveis em centros de estoque e / ou na comunidade de pesquisa de Drosophila.

Com este protocolo expandido de imagem em tempo real, podemos registrar a mitose assimétrica das CSGs femininas dentro de seu nicho sem distúrbios biológicos aparentes. Para tanto, utilizamos germários que expressam ubiquitamente a proteína GFP::Par-1, a qual discrimina entre cinco morfologias distintas do espectrossomo ao longo do ciclo celular das CSGs: Redondo, Tampão, Barra, Fusão e Ponto de Exclamação (Figura 1B,C). Em uma descrição mais detalhada, observamos que o sinal forte de GFP::Par1 no espectrossomo Redondo-G2 (Figura 1C, painel a) é drasticamente reduzido durante as fases G2-M-G1. Importante, o uso desta linhagem transgênica também permite a visualização da entrada da CSG em mitose, já que a maior parte da GFP::Par-1 deixa o espectrossomo e preenche o citoplasma durante a prófase inicial (Figura 1C, painel b). Além disso, a GFP::Par-1 citoplasmática permite a detecção precisa da etapa de permeabilização da membrana nuclear (NEP)8,14, quando o sinal GFP entra no nucleoplasma nesse exato momento (Figura 1C, painel b). Após a mitose e a reconstituição da membrana nuclear, o sinal de GFP::Par1 é gradualmente recuperado no espectrossomo Redondo-G1 (Figura 1C, painel c). A adição de novo de material GFP::Par1 ao espectrossomo Redondo-G1 promove a formação das morfologias espectrossomais Tampão (Figura 1C, painel d), Barra (Figura 1C, painel e) e Fusão (Figura 1C, painel f). Por fim, o marcador GFP::Par1 permite a visualização do espectrossomo em Ponto de Exclamação (Figura 1C, painel e), como consequência da formação do corpo médio, uma estrutura proteica rica em microtúbulos formada durante a citocinese, além do anel contrátil de actomiosina.
<img alt="Fases da diferenciação de células-tronco germinativas; morfologia do espectrossomo; diagrama das fases do ciclo; microscopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Dinâmica do ciclo do espectrossomo em CSGs vivas. (A) Diagrama esquemático do nicho de células-tronco germinativas (CSG, em amarelo), composto por células do filamento terminal (TFCs, em azul), célula de transição (TC, em vermelho), células-cap (CpCs, em roxo) e células de acompanhamento (ECs, em cinza). As CSGs contêm um orgânulo característico chamado espectrossomo (em verde). Durante o ciclo celular da CSG, o espectrossomo passa de uma forma esférica para uma alongada e depois novamente para uma esfera. A CSG se divide para gerar uma célula-filha, o cistoblasto (CB, em laranja), que perde o contato com o nicho e que também contém um espectrossomo esférico. O CB se divide quatro vezes consecutivas e sincrônicas com citocinese incompleta, produzindo cistos de 2, 4, 8 e 16 células interconectadas pelo fusoma. (B) Diagrama representando as diferentes formas do espectrossomo geradas durante o ciclo celular. (B') Tempo esperado para observação das morfologias do espectrossomo. (C) Imagens em diferentes pontos temporais de um filme com duração de 17 h mostrando o sinal de GFP::Par-1 no nicho de CSGs. O tempo 0 min (0') corresponde à Permeabilização da Envoltória Nuclear (NEP). O painel ilustra cinco morfologias diferentes do espectrossomo (cabeças de seta brancas e verdes): Redondo (tanto em G2 quanto em G1; painel a e c), Tampão (painel d), Barra (painel e), Fusão (painel f) e Ponto de exclamação (painel e, cabeça de seta verde). Esta última morfologia do espectrossomo pertence à segunda CSG (linha tracejada verde) mostrada aos 70'. As CSGs são delimitadas por linhas tracejadas amarelas e verdes. Os CBs resultantes após a divisão da CSG são delimitados por linhas tracejadas laranjas. Barra de escala: 10 µm. Os painéis A e B foram adaptados com permissão de Villa-Fombuena et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama de isolamento de ovaríolos de Drosophila; etapas: preparo em MatTek, dissecção, imagem; método biológico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67389/67389fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Método de montagem com adesivo Cell-Tak para imagens vivas prolongadas de germários de Drosophila. (1) Processo passo a passo para preparar a placa com fundo de vidro com o adesivo. (2) Visão geral da dissecção de ovário de Drosophila em solução de Ringer e preparo de ovaríolos individuais livres de músculo. (3) Transferir os ovaríolos sem a bainha muscular para a placa com fundo de vidro. (4) Preencher a placa com fundo de vidro com meio Schneider suplementado. (5) Obter imagens dos germários por 10 h a 16 h utilizando um microscópio confocal invertido. Esta figura foi adaptada com permissão de Villa-Fombuena et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67389/67389fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para realizar imagens ao vivo da divisão assimétrica de células-tronco germinativas (GSCs) no nicho ovariano de Drosophila. Usamos uma linhagem transgênica que expressa de forma ubíqua uma fusão de proteína fluorescente verde (GFP) da proteína do espectrossomo Par-1.

Imagem ao vivo estendida de nichos de células-tronco germinativas de Drosophila melanogaster fêmea

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

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