Name: Uma plataforma de matriz de múltiplos eletrodos para modelagem de epilepsia usando conjuntos cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:57:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Aprenda a modelar epilepsia usando matrizes de múltiplos eletrodos com assembloídes cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes humanas. Este método permite investigar mecanismos patológicos e respostas a drogas in vitro.

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<meta charset="utf8"></head><body>Registrando a Atividade de Rede em Assembléias Cerebrais: Abordagem de Matriz de Múltiplos Eletrodos

<ol><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+analyses+of+single-cell+transcriptomes+from+multiple+brain+organoids+and+fetal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Synthetic analyses of single-cell transcriptomes from multiple brain organoids and fetal brain.</a> Cell Rep. 30 (6), 1682-1689.e3 (2020).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembloid+CRISPR+screens+reveal+impact+of+disease+genes+in+human+neurodevelopment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembloid CRISPR screens reveal impact of disease genes in human neurodevelopment.</a> Nature. 622 (7982), 359-366 (2023).</li>
<li>Samarasinghe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+oscillations+and+epileptiform+changes+in+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of neural oscillations and epileptiform changes in human brain organoids.</a> Nat Neurosci. 24 (10), 1488-1500 (2021).</li>
<li>Saleem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+hyperexcitability+in+human+cerebral+cortical+organoids%3A+Oxygen%2Fglucose+deprivation+most+effective+stimulant%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Modelling hyperexcitability in human cerebral cortical organoids: Oxygen/glucose deprivation most effective stimulant.</a> Heliyon. 9 (4), e14999(2023).</li>
<li>Saberi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+engineered+human+cerebral+tissues+mimic+pathological+circuit+disturbances+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">In-vitro engineered human cerebral tissues mimic pathological circuit disturbances in 3D.</a> Commun Biol. 5 (1), 1-9 (2022).</li>
<li>Bagley, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fused+dorsal-ventral+cerebral+organoids+model+complex+interactions+between+diverse+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fused dorsal-ventral cerebral organoids model complex interactions between diverse brain regions.</a> Nat Methods. 14 (7), 743-751 (2017).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+functionally+integrated+human+forebrain+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids.</a> Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).</li>
<li>Sloan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+assembly+of+human+brain+region-specific+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures.</a> Nat Protoc. 13 (9), 2062-2085 (2018).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+regionally-specified+hPSC-derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fusion of regionally-specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398.e7 (2017).</li>
<li>VanDersarl, J. J., Renaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+surface+patterning+for+long-term+transmembrane+access%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Biomimetic surface patterning for long-term transmembrane access.</a> Sci Rep. 6 (1), 32485(2016).</li>
<li>Sandoval, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigor+and+reproducibility+in+human+brain+organoid+research%3A+Where+we+are+and+where+we+need+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Rigor and reproducibility in human brain organoid research: Where we are and where we need to go.</a> Stem Cell Rep. 19 (6), 796-816 (2024).</li>
<li>Hartmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characterization+of+different+brainsphere+models+for+use+in+neurotoxicity+testing+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characterization of different brainsphere models for use in neurotoxicity testing on microelectrode arrays.</a> Cells. 12 (9), 1270(2023).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+advanced+cerebellar+organoids+for+neurogenesis+and+neuronal+network+development%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Generation of advanced cerebellar organoids for neurogenesis and neuronal network development.</a> Hum Mol Genet. 32 (18), 2832-2841 (2023).</li>
<li>Fair, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+maturation+of+cerebral+organoids+correlates+with+dynamic+morphological+and+cellular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological maturation of cerebral organoids correlates with dynamic morphological and cellular development.</a> Stem Cell Rep. 15 (4), 855-868 (2020).</li>
<li>Muzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-derived+cortical+neurospheroids+coupled+to+passive%2C+high-density+and+3D+MEAs%3A+A+valid+platform+for+functional+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng.+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Human-derived cortical neurospheroids coupled to passive, high-density and 3D MEAs: A valid platform for functional tests.</a> Bioeng. (Basel). 10 (4), 449(2023).</li>
<li>Hruska-Plochan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+human+neural+networks+reveals+NPTX2+pathology+in+ALS+and+FTLD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A model of human neural networks reveals NPTX2 pathology in ALS and FTLD.</a> Nature. 626 (8001), 1073-1083 (2024).</li>
<li>Reumann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+the+human+dopaminergic+system+using+spatially+arranged+ventral+midbrain-striatum-cortex+assembloids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of the human dopaminergic system using spatially arranged ventral midbrain-striatum-cortex assembloids.</a> Nat Methods. 20 (12), 2034-2047 (2023).</li>
<li>Fenton, T. A., et al. Hyperexcitability and translational phenotypes in a preclinical model of SYNGAP1 mutations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFenton%2C+TA+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2023).</li>
<li>Huang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shell+microelectrode+arrays+%28MEAs%29+for+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Shell microelectrode arrays (MEAs) for brain organoids.</a> Sci Adv. 8 (33), eabq5031(2022).</li>
<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+organoids+establish+subcortical+projections+in+the+mouse+brain+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Human cerebral organoids establish subcortical projections in the mouse brain after transplantation.</a> Mol Psychiatry. 26 (7), 2964-2976 (2021).</li>
<li>Patton, M. H., et al. Synaptic plasticity in human thalamocortical assembloids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatton%2C+MH+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Osaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+activity+and+short-term+plasticity+of+human+cerebral+organoids+reciprocally+connected+with+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Complex activity and short-term plasticity of human cerebral organoids reciprocally connected with axons.</a> Nat Commun. 15 (1), 2945(2024).</li>
<li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+oscillatory+waves+emerging+from+cortical+organoids+model+early+human+brain+network+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569.e7 (2019).</li>
<li>Schröter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+brain+organoids+using+high-density+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bull%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of brain organoids using high-density microelectrode arrays.</a> MRS Bull. 47 (6), 530-544 (2022).</li>
<li>Nieto-Estevez, V., et al. Dual effects of ARX poly-alanine mutations in human cortical and interneuron development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieto-Estevez%2C+V+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Ciarpella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cerebral+organoids+develop+network+of+functional+neurons+and+hippocampal+brain+region+identity%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Murine cerebral organoids develop network of functional neurons and hippocampal brain region identity.</a> iScience. 24 (12), 103438(2021).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+brain+region-specific+organoids+for+investigating+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Development and application of brain region-specific organoids for investigating psychiatric disorders.</a> Biol Psychiatry. 93 (7), 594-605 (2023).</li>
<li>Andersen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+3D+cortico-motor+assembloids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human 3D cortico-motor assembloids.</a> Cell. 183 (7), 1913-1929.e26 (2020).</li>
<li>Atamian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebellar+organoids+with+functional+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human cerebellar organoids with functional Purkinje cells.</a> Cell Stem Cell. 31 (1), 39-51.e6 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Pratos de cultura não tratados com TC Corning de 10 cm</td><td>Corning</td><td>08-772-32</td><td>Para cultura em suspensão no shaker</td></tr><tr><td>100 mL Beaker&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB100100</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184-4L</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (&beta;-ME)</td><td>Thermo Fisher</td><td>21985023</td><td>Concentração de trabalho 100 &mu; </td></tr><tr><td>Placa de cultura de células M de 48 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-140</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 6 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 800</td><td>Fisher Scientific</td><td>501974754</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-14R Centrífuga Refrigerada</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>BE-AX14R</td><td></td></tr><tr><td>Allopregnanolone</td><td>Cayman</td><td>16930</td><td>Suspendeu 5mg em DMSO para obter solução estoque de 1 mM. Alíquota e congelamento em &menos; 80 ° C. Diluir a 1:10.000 para uso. Concentração de trabalho 100 nM.</td></tr><tr><td>Contador de células automatizado</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Axion CytoView MEA placas de 6 poços&nbsp;</td><td>Axion Biosystems</td><td>M384-tMEA-6B</td><td></td></tr><tr><td>Axion Maestro MEA plataforma Axion</td><td>Biosystems</td><td>Maestro</td><td>Com controle ambiental temporário</td></tr><tr><td>Suplemento B-27 (regular, com Vitamina A)</td><td>Suplemento Thermo Fisher</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>B-27 (sem Vitamina A)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal- Geltrex</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>Banho de contas</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-876-001</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de bancada invertido</td><td>Isotemp Olympus</td><td>CKX53</td><td>Mantido em fluxo laminar limpo bancada</td></tr><tr><td>Bicuculline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14340</td><td>Concentração de trabalho 10 &mu; M</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>CLOROX</td><td>67619-26</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de borato 20x</td><td>Thermo Fisher</td><td>28341</td><td>Concentração de trabalho em 1x</td></tr><tr><td>mídia BrainPhys</td><td>Reagente</td> de dissociação celular <td>StemCell Technologies 5790</td><td></td></tr><tr><td>(StemPro Accutase)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Celltron agitador orbital</td><td>HT-Infors</td><td>&nbsp; I69222&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Detergente/enzima (Terg-A-Zyme)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273287</td><td>Concentração de trabalho 1% m/v</td></tr><tr><td>DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher</td><td>113300</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67685</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorfina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5499</td><td>Dissolva 5 mg em DMSO para obter uma solução estoque de 10 mM. Alíquota e congelamento em &menos; 20 °C. Diluir a 1:2000 para uso. (concentração de trabalho 5 &mu; M)</td></tr><tr><td>D-PBS sem cálcio ou magnésio</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrófico derivado de linha de células gliais (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Dissolve 100 &mu; g em 1mL de PBS para 100 &mu; g/mL. Alíquota e congelamento em &menos; 20 ° C. Diluir a 1:5000 para uso. (concentração de trabalho 20 ng/mL).</td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitômetro</td><td>Eleição Microscopia Ciências</td><td>63510-20</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Heraguard ECO Clean Bench</td><td>Thermo Fisher</td><td>51029692</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células com umidade controlada</td><td>Thermo Fisher</td><td>370</td><td>definido para 37 &deg; C, 5% CO2</td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Selleckchem</td><td>S7085</td><td>Alíquota e congelar em &menos; 80 ° C. Ele irá precipitar se descongelado à temperatura ambiente. As alíquotas congeladas devem ser colocadas diretamente em 37 &deg; C antes de usar.</td></tr><tr><td>Reposição de soro knockout (KOSR)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>mTeSRplus (meio + suplementos)</td><td>StemCell Technologies</td><td>100-0276</td><td>cGMP, meio estabilizado sem alimentador para células iPSC humanas</td></tr><tr><td>Suplemento N2</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Thermo Fisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais (NEAA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>NT3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td>Dissolver 100 &mu; g em 1mL de PBS para 100 &mu; g/mL. Alíquota e congelamento em &menos; 20 ° C. Diluir a 1:5000 para uso. (concentração de trabalho 20 ng/mL).</td></tr><tr><td>NuFF Fibroblastos de prepúcio neonatal humano</td><td>MTI-GlobalStem</td><td>GSC-3002</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta (P10, P200, P1000)</td><td>Eppendorf</td><td>EP4926000034</td><td>Corte autoclavado P1000 pontas para coleta de organoides</td></tr><tr><td>Poli (Etilenoimina) (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td>Diluir o estoque em tampão de borato estéril. Concentração de trabalho 0,07%. Veja detalhes no manuscrito.</td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico humano recombinante (EGF)</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG-200</td><td>Suspenso em PBS. Alíquota e congelar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos humanos recombinantes (FGF) - básico&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Suspenso em PBS. Alíquota e congelar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Fator neurotrófico recombinante derivado do cérebro humano (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>Centrífuga brevemente antes da reconstituição. Dissolva 100 &mu; g em 1 mL de PBS para 100 &mu; g/mL. Alíquota e congelamento em &menos; 20 ° C. Diluir a 1:5000 para uso. (concentração de trabalho 20 ng/mL).</td></tr><tr><td>Ácido retinóico (RA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>Dissolva 100 mg em 3,3 mL de DMSO para obter uma solução estoque de 100 mM. Alíquota do estoque 100 &mu; L/tubo e congelar em &menos; 80 ° C. Pegue 200 &mu; L de estoque de 100 mM e diluir 10x (adicionar 1,8 mL de DMSO) para fazer estoque de 10 mM. Alíquota 50 &mu; L/tubo e armazene em &menos; 80 °C. Diluir a 1:100.000 para uso. (concentração de trabalho 100 nM).</td></tr><tr><td>Inibidor de ROCK Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>1:200 de estoque de 10 mM</td></tr><tr><td>SAG (agonista suavizado)</td><td>Selleckchem</td><td>S7779</td><td>Alíquota e congelamento em &minus; 80 °C. Concentração de estoque 1mM. Use na diluição de 1:10.000 (concentração de trabalho 100 nM).</td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td>Dissolva 5 mg em 1,3 mL de DMSO para obter uma solução estoque de 10 mM. Alíquota e congelamento em &menos; 80 ° C. Diluir a 1:1000 para uso. (concentração de trabalho 10 &mu; M)</td></tr> <tr><td>Enchedor de pipetas sorológico</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-387-166</td><td></td></tr><tr><td>Filtro superior de tubo de vácuo Steriflip</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Capas de cultura de células estéreis</td><td>Baker Company</td><td>SG-600</td><td></td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano (0,4%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio Zoom</td><td>Olympus</td><td>SZ61/SZ51</td><td>Mantido em bancada limpa de fluxo laminar</td></tr></tbody></table>

uma plataforma de matriz de múltiplos eletrodos para modelagem de epilepsia usando conjuntos cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes humanas

A Multi-Electrode Array Platform for Modeling Epilepsy Using Human Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Assembloids

Os conjuntos dorsais-ventrais humanos foram plaqueados em uma placa MEA de 6 poços (n = 6 por diferenciação, 3 diferenciações), com cada poço contendo 64 eletrodos (Figura 2A). Nove em cada dez assemblóides planejados para registro longitudinal foram firmemente fixados aos eletrodos por mais de 50 dias in vitro (Figura 2D). 6 dos 8 assemblóides designados para ensaios farmacológicos foram resolvidos com sucesso através da fase de wash-out com atividade de rede apropriada ao estágio de desenvolvimento ( Figura 2E ). Imagens de contraste de fase e fluorescência de um poço representativo são mostradas (Figura 2B), nas quais os organoides dorsais marcados com AAV-CAG-tdTomato e AAV-mDLX-GFP são facilmente distinguidos 7,9.
A atividade dos neurônios em um MEA pode ser analisada para avaliar a excitabilidade celular geral e a atividade da rede, por meio de uma variedade de parâmetros. As taxas gerais de disparo em toda a cultura fornecem informações sobre a excitabilidade celular e da rede, enquanto a frequência de rajadas sincronizadas em vários eletrodos indica o alcance de redes sinapticamente ativas de neurônios. Múltiplos picos repetidos ocorrendo em eletrodos espacialmente distintos durante um curto período de tempo (estouro de rede) podem servir como um correlato biológico para a atividade semelhante a convulsões, embora os assemblóides em MEAs permaneçam limitados em comparação com um organismo inteiro que pode ter convulsões de boa-fé . A Figura 2C ilustra os padrões de estouro de rede de assemblóides cultivados em meios neurofisiológicos basais disponíveis comercialmente nos dias 84 e 91, com aumento da duração do estouro no ponto de tempo posterior, provavelmente devido à maturação funcional dos neurônios. Nesse caso, a atividade celular e de rede aumenta gradualmente a partir do dia em que os assemblóides são plaqueados, geralmente atingindo o pico no dia 92 e quase desaparecendo no dia 125 (Figura 2D). O aumento da maturação no estágio posterior provavelmente contribui para a duração da explosão sincronizada estendida no ponto de tempo de gravação posterior.
A bicuculina, um antagonista do receptorGABA A , aumenta a atividade da rede sincronizada dos conjuntos, conforme mostrado por taxas de disparo significativamente mais altas e frequências de explosão (rede) após a adição do medicamento no dia 108 ( Figura 2E ). Isso é semelhante ao que foi demonstrado anteriormente em registros de eletrofisiologia de células únicas21. Uma análise de poder para o ensaio farmacológico foi conduzida usando a base G * Power3 em um tamanho de efeito de 0,94 e um alfa de 0,05. Uma amostra total de 15 assembleides, com três grupos de tamanhos iguais de n = 5, foi necessária para atingir um poder de 0,8 (Figura 2E). Um controle do veículo é incluído para verificar se a resposta é um evento de sinalização verdadeiro e não apenas uma mudança na intensidade do sinal que pode surgir da adição de uma pequena quantidade de mídia (Figura 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67396/67396fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral do estudo. Protocolo para a geração e plaqueamento de conjuntos duplamente marcados na linha do tempo MEA do protocolo de diferenciação detalhando estágios críticos e suplementos de moléculas pequenas correspondentes (para obter informações adicionais sobre a composição, consulte a Tabela 1 e a Tabela de Materiais). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67396/67396fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67396/67396fig02.jpg"> Figura 2: Registro de assembléias MEA. (A) Mapa de calor da atividade média de queima de uma única placa MEA (n = 6 poços) no dia 82, ou seja, pós-plating Todos os poços representam culturas da mesma condição e genótipo. (B) Imagens representativas de contraste de fase e confocais do assemblóide, com o assembloide dorsal marcado com vermelho e ventral com verde. As pontas das setas brancas indicam interneurônios GABAérgicos migrados do lado ventral para o dorsal. Barra de escala = 500 μm. (C) Gráficos raster representativos ao longo de 120 s de tempo de gravação de um único poço. As rajadas de rede são destacadas com uma caixa roxa. Dois pontos de tempo separados, Dia 78 (1 semana após o revestimento, dia inicial do registro) e Dia 92 (3 semanas após o revestimento, também quando a atividade atinge o pico), são demonstrados. (D) Quantificação das taxas médias de disparo, frequência de burst e frequência de bursting de rede do dia 78 ao dia 127 (n = 3 diferenciações, 3 assembleias / diferenciação). Cada curva indica um conjunto individual, compilado a partir de 3 diferenciações (codificadas por cores). A curva vermelha demonstra o valor médio. (E) Quantificação dos resultados do ensaio de bicuculina (n = 6 assemblóides/condição). O gráfico de barras foi exibido como média ± EPM. Cada ponto representa um conjunto, compilado a partir de 3 lotes de diferenciação (codificados por cores). Foi realizado um teste não paramétrico de Friedman. **p &lt; 0,01; ns, não significativo. MEA, matrizes de vários eletrodos. O mapa de calor e os gráficos raster são gerados usando o software analítico Neural Metric Tool. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67396/67396fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Componentes da mídia em vários estágios de diferenciação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67396/67396_Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Uma plataforma de matriz de múltiplos eletrodos para modelagem de epilepsia usando conjuntos cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes humanas

Human brain organoids are three-dimensional (3D) structures derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) that recapitulate&#160;aspects of fetal ...

a-multi-electrode-array-platform-for-modeling-epilepsy-using-human

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Neurociência

O vídeo demonstra como usar um arranjo de microeletrodos (MEA) para registrar a atividade eletrofisiológica de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). A atividade eletrofisiológica de um MEA multipoço contendo uma co-cultura neurônio-astrócitos é registrada para detectar potenciais de ação de vários neurônios na rede, confirmando a diferenciação bem-sucedida de hiPSCs em neurônios.

Medindo a atividade eletrofisiológica de redes neuronais usando matrizes de microeletrodos

Este vídeo demonstra o procedimento de uso da matriz de multieletrodos (MEA) para medir a fisiologia sináptica em esferas de cocultura 3D. Este método permite entender a dinâmica da rede neural e a atividade de explosão da rede sináptica dentro das esferas 3D.

Utilizando matrizes de multieletrodos para medir a fisiologia sináptica em esferas de cocultura 3D

Este protocolo envolve o uso de um conjunto de microeletrodos (MEA) para registrar a atividade elétrica em uma fatia do cérebro exposta a uma droga indutora de convulsões. O procedimento inclui posicionar a fatia do cérebro em uma câmara de gravação MEA, aplicar estimulação elétrica para induzir convulsões artificiais e analisar os sinais resultantes.

Monitoramento da atividade elétrica neural induzida por convulsões em fatias cerebrais usando matrizes de microeletrodos

Nós aqui descrevem como realizar gravações de matriz multi-eletrodo de tecido cortical epiléptico humano. Ressecção do tecido epiléptico, preparação e fatia de matriz multi-eletrodo gravações de eventos interictais e ictais são demonstrados em detalhes.

Multieletrodos Recordings Matriz de Human epiléptica pós-operatória Cortical Tissue

A caracterização eletrofisiológica de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC-CMs) é crucial para a modelagem de doenças cardíacas e para a determinação de respostas de fármacos. Este protocolo fornece as informações necessárias para dissociar e plaquear hPSC-CMs em matrizes de múltiplos eléctrodos, medir o seu potencial de campo e um método para analisar os intervalos QT e RR.

Análise eletrofisiológica de cardiomiócitos humanos derivados de células-tronco pluripotentes (hPSC-CMs) usando matrizes de múltiplos eletrodos (MEAs)

Nós projetamos um procedimento em que um cadáver humano formaldeído-fixo é usado para ajudar os neurocirurgiões em treinamento para a implantação de matrizes de microeletrodos no córtex do cérebro humano.

Treinamento cirúrgico para implantação de microeletrodos Neocortical matrizes usando um modelo de cadáver humano formaldeído-fixo

Neste protocolo, nosso objetivo é descrever um método reprodutível para os neurônios de células-tronco derivadas de pluripotentes humanas combinando dissociado e astrócitos juntos em 3D sphere cocultures, mantendo estas esferas em condições de flutuação livre e, posteriormente medindo a atividade sináptica circuito das esferas com immunoanalysis e gravações de matriz multielectrode.

Modelagem de microcircuito sináptica com Cocultures 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas

Aqui, descrevemos a preparação de fatias organotipicas do córtex-hipocampo rhinal. Sob uma privação gradual e controlada de soro, essas fatias retratam eventos epilépticos em evolução e podem ser consideradas um modelo ex vivo de episetogênese. Este sistema representa uma excelente ferramenta para monitorar a dinâmica da atividade espontânea, bem como para avaliar a progressão das características neuroinflamatórias ao longo do curso da epipesogênese.

Um Modelo de Epipetogênese em Culturas de Fatia Organotipica Do Cortex-Hipocampo Rhinal

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Estabelecimento de uma plataforma eletrofisiológica para modelagem da ELA com astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas regionalmente específicas

Aqui, empregamos HD-MEA para nos aprofundarmos na dinâmica computacional de conjuntos neuronais de grande escala, particularmente em hipocampo, circuitos de bulbos olfativos e redes neuronais humanas. A captura da atividade espaço-temporal, combinada com ferramentas computacionais, fornece insights sobre a complexidade do conjunto neuronal. O método melhora a compreensão das funções cerebrais, potencialmente identificando biomarcadores e tratamentos para distúrbios neurológicos.

Gravação e Análise da Dinâmica Multimodal de Conjuntos Neuronais em Larga Escala em Microeletrodos de Alta Densidade Integrados CMOS

Aprenda a modelar epilepsia usando matrizes de múltiplos eletrodos com assembloídes cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes humanas. Este método permite investigar mecanismos patológicos e respostas a drogas in vitro.

Uma plataforma de matriz de múltiplos eletrodos para modelagem de epilepsia usando conjuntos cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes humanas (Vídeo) | JoVE Journal

Uma plataforma de matriz de múltiplos eletrodos para modelagem de epilepsia usando conjuntos cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes humanas

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