Uma plataforma de matriz de múltiplos eletrodos para modelagem de epilepsia usando conjuntos cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes humanas
27 de setembro de 2024
Este protocolo visa colocar de forma estável assembleias dorsais-ventrais fundidas em matrizes de múltiplos eletrodos para modelagem de epilepsia in vitro.
Nas últimas décadas, uma explosão de descoberta de genes identificou centenas de genes que causam ou estão associados à epilepsia. No entanto, os mecanismos patogênicos não são tão bem explorados. Nosso laboratório estuda como as mudanças genéticas afetam o desenvolvimento inicial do cérebro e resultam em malformações cerebrais e epilepsia, uma doença debilitante caracterizada por convulsões crônicas.
As epilepsias genéticas têm sido tipicamente estudadas usando modelos animais, incluindo camundongos, peixes-zebra, drosófilos e coelhos. As células-tronco humanas têm sido usadas mais recentemente para modelar epilepsias genéticas, à medida que as técnicas para diferenciar células-tronco em tecido neurológico avançaram. Com o advento dos organoides cerebrais, você pode recapitular os aspectos estruturais do desenvolvimento do cérebro.
Medir a atividade eletrofisiológica e determinar biomarcadores da atividade relacionada à epilepsia a partir de organoides cerebrais e assemblóides é um desafio. Em parte, essa técnica é limitada porque os organoides cerebrais não podem ter convulsões como um animal intacto. No entanto, encontrar diferenças eletrofisiológicas neste modelo in vitro e respostas a tratamentos medicamentosos pode ajudar a determinar mecanismos patológicos e respostas terapêuticas em epilepsias genéticas.
A atividade eletrofisiológica pode ser avaliada usando gravações tradicionais de escalada de patch, gravações de campo locais com eletrodos e técnicas ópticas como imagens de cálcio e tensão de memória. O uso de gravações de matriz de vários eletrodos tem a vantagem de poder lançar duas gravações ao longo do tempo e gravar de vários locais de um assembloide simultaneamente.
Visão Geral
Este protocolo detalha o plaqueamento estável de assembloides fundidos dorsoventrais em arranjos de múltiplos eletrodos (MEAs) para modelar epilepsia in vitro. Ele aborda os desafios na medição da atividade eletrofisiológica e na compreensão dos mecanismos patológicos das epilepsias genéticas utilizando organoides cerebrais derivados de células-tronco humanas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Pesquisa em epilepsia
- Neurodesenvolvimento
Antecedentes
- Descobertas de genes identificaram inúmeros genes associados à epilepsia.
- Os mecanismos patogênicos permanecem pouco explorados, apesar dos avanços nos modelos.
- Células-tronco humanas e organoides cerebrais surgiram como modelos para o estudo das epilepsias genéticas.
- A medição da atividade neuronal em organoides é limitada em comparação com modelos animais intactos.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um protocolo para o plaqueamento estável de assembloides em MEAs.
- Investigar as diferenças eletrofisiológicas observadas nos modelos in vitro.
- Avaliar as respostas aos tratamentos farmacológicos na modelagem de epilepsias genéticas.
Métodos Utilizados
- Utilização de matrizes multieletrodos (MEAs) para gravações eletrofisiológicas.
- Modelagem com assembloides fundidos dorsoventrais derivados de células-tronco humanas.
- Passos críticos incluem o pré-tratamento da superfície da MEA, preparação dos poços e posicionamento dos assembloides.
- Observação da maturação neuronal ao longo do tempo com avaliações da atividade em rede.
Principais Resultados
- Observou-se aumento da duração das rajadas em rede conforme os neurônios amadureciam.
- A atividade celular e em rede foi monitorada ao longo do tempo, desaparecendo eventualmente até o dia 125.
- A avaliação das respostas a medicamentos pode ajudar a revelar os mecanismos patológicos da epilepsia.
Conclusões
- Este estudo fornece um método robusto para modelar epilepsia in vitro utilizando assembloides em MEAs.
- Os achados permitem investigações detalhadas sobre a patologia e as respostas ao tratamento das epilepsias genéticas.
- Os conhecimentos obtidos podem aprimorar a compreensão dos mecanismos neurais associados à epilepsia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Assembloides cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes humanas cultivados em matrizes multieletrodo (MEAs) permitem a medição longitudinal e não destrutiva da atividade de redes neurais relevante para a epilepsia. Esta plataforma supera a lacuna translacional entre a descoberta genética e a compreensão mecanicista, fornecendo um sistema escalonável e específico ao ser humano para interrogatório funcional e perfilagem da resposta a fármacos. A abordagem reforça a confiança preditiva na validação precoce de alvos e orienta decisões de portfólio ajustadas ao risco no desenvolvimento de neuroterapêuticas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a avaliação funcional de variantes genéticas implicadas na epilepsia utilizando circuitos neurais derivados de humanos.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao revelar fenótipos em nível de rede e padrões de atividade aberrantes.
- Facilita a investigação orientada por hipóteses sobre a integração neuronal excitatória e inibitória.
- Oferece uma plataforma para avaliar o impacto de intervenções candidatas sobre a dinâmica de rede relevante para a doença.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece um ensaio eletrofisiológico robusto e longitudinal para quantificar a atividade de rede ao longo de períodos prolongados.
- Permite a medição reprodutível de potenciais de campo, potenciais de ação e padrões de rajadas em múltiplos assembloides.
- Permite a preparação padronizada de sistemas neurais complexos tridimensionais para triagem de compostos posteriores.
- Facilita a aquisição escalável e multiplexada de dados para análise comparativa de respostas a fármacos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha fenótipos de redes in vitro com biomarcadores relevantes para doenças na pesquisa de epilepsia.
- Oferece continuidade da descoberta genética à validação pré-clínica em um contexto específico ao ser humano.
- Apoia o avanço ajustado ao risco de candidatos a neuroterápicos com base em leituras funcionais.
- Permite avaliação mecanicista de intervenções terapêuticas em um sistema controlado e escalonável.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Esta plataforma de assembloide baseada em EPM conecta a descoberta inicial e a pesquisa pré-clínica, permitindo a validação funcional de alvos, o desenvolvimento de ensaios e o alinhamento translacional de biomarcadores na modelagem da epilepsia.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a redução de riscos mecanicistas ao quantificar os efeitos em nível de rede decorrentes de perturbações genéticas ou farmacológicas.
- Triagem: Fornece saídas eletrofisiológicas quantitativas e reprodutíveis, adequadas para avaliação de compostos e padronização de ensaios.
- Análises: Permite a medição longitudinal de surtos em rede, maturação e resposta a fármacos para análises comparativas.
- Pesquisa Translacional: Alinha fenótipos in vitro com mecanismos de doenças, apoiando decisões pré-clínicas orientadas por biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável e adaptável para modelar diversas regiões cerebrais e condições neurológicas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de epilepsia.
- Valor Operacional: Padroniza ensaios neurais complexos para reprodutibilidade e escalabilidade entre equipes de P&D.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção de projetos e a eficiência do capital ao fornecer dados funcionais humanos precocemente na fase de desenvolvimento.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de ativos neuroterapêuticos com base em evidências funcionais robustas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em diferenciação de células-tronco, cultivo de organoides e configuração de ensaios eletrofisiológicos.
- Exige acesso a instrumentação de matriz de múltiplos eletrodos e infraestrutura analítica para aquisição de dados de alto conteúdo.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de semeadura, manutenção e análise de dados.
- Adaptável a organoides específicos de diversas regiões cerebrais, mas pode exigir otimização para diferentes tipos de tecido.
- A estabilidade do cultivo e da gravação em longo prazo é fundamental para estudos longitudinais confiáveis.
