Avaliar motilidade celular Neural Stem Usando um dispositivo Agarose Gel baseado microfluídicos

Olá, sou Kevin ganhou. Sou estudante de mestrado em engenharia no Laboratório de Biofluidos da Universidade de Cornell. E hoje vou falar sobre o uso de um dispositivo microfluídico baseado em agros para estudar o efeito do fator de crescimento epidérmico EGF nas células-tronco neuro Maureen.

O dispositivo consiste basicamente em três canais microfluídicos, cada um com 150 mícrons de largura. O EGF é bombeado para um dos canais laterais e o buffer é bombeado para o outro canal lateral. Basicamente, configura um gradiente químico linear estático através do canal central.

Como o EGF difuso se difunde facilmente através do agrogel, as células-tronco dos neurônios são semeadas no canal central e o progresso de sua migração é monitorado por meio de um microscópio. Portanto, os dispositivos são basicamente compostos por uma camada superior de plexiglass que possui todas as entradas e saídas para conexão com a tubulação. E embaixo disso está uma membrana de gel agrícola, que possui quatro dispositivos de padrão.

Isso é cercado por espaçador PDMS, o que garante que tenhamos espessura constante em todo o dispositivo. O PDMS e o gel são montados em uma lâmina de vidro, que é revestida com ect. Isso ajuda as células a aderir à lâmina de vidro.

Além disso, a placa de aço inoxidável é usada para montar todo o dispositivo e nós Sam sanduíche o dispositivo junto com parafusos. A linhagem celular do tipo selvagem foi transfectada com um vetor de retrovírus para expressar o receptor EGF do tipo selvagem e a linhagem celular delta foi transfectada com uma versão mutada do receptor EGF que permite que ela seja constituintemente ativa sem o ligante EGF. Ok, então vou começar explicando o processo de montagem do nosso dispositivo microfluídico.

Então, primeiro coloquei o espaçador PDMS em torno dos recursos de relevo dos microcanais de silício em nossos mestres. Então agora vou pesar 0,3 gramas de agros. Então agora vou trazer 10 mils de mídia independente de CO2 e adicionar isso aos agros.

E vou pipetar para cima e para baixo para misturar o pó de aros com a mídia independente de CO2. Agora estamos prontos para o microondas. Como você pode ver agora, o agros agora está liquefeito, mas ainda restam alguns grânulos.

Vou tentar girar isso para dissolver o grânulo e me livrar das bolhas de ar. Então, estou derramando os agros fundidos nas características de relevo do mestre de silício e agora vou pegar uma lâmina de vidro estéril e colocá-la sobre o espaçador PDMS. E eu coloquei em um ângulo para tentar forçar a maioria das bolhas de ar no gel agrícola para fora.

E apliquei pressão e continuarei aplicando pressão até que a casca do agros se solidifique. Então, depois de um a dois minutos, ele se solidificou. Agora vou remover o excesso de agros do slide.

O próximo passo é deslizar suavemente para fora da lâmina de vidro e esta lâmina de vidro pode ser descartada. Agora vou tentar transferir suavemente o padrão aros para uma lâmina de vidro que eu já revesti com fibronectina. Basicamente, uso esta folha estéril de plástico para me ajudar a levantar o padrão agros com o espaçador PDMM MS e transferirei o padrão agros com os canais para baixo em direção ao slide.

Agora que isso está firmemente na lâmina de vidro, vou fazer furos nos reservatórios individuais para que o coletor de plástico tenha acesso aos canais. Vou fazer isso usando um pequeno furador de metal. Agora terminamos de fazer furos no dispositivo.

Vou adicionar 500 microlitros de mídia independente de CO2 para evitar a dessecação dos microcanais e agora vou deixá-lo descansar por um a dois minutos. Ok, depois de um a dois minutos, tentarei drenar o excesso de mídia e agora alinharei os orifícios que perfuraram o padrão agros com os orifícios de entrada e saída do coletor de plexiglass. E uma vez que os orifícios foram alinhados, pressiono com firmeza para formar uma boa vedação.

Agora coloco o coletor de plexiglass sobre os suportes de aço inoxidável e agora vou encaixar suavemente o dispositivo usando parafusos. Tenho muito cuidado para não apertar demais os parafusos, pois isso esmagará os canais e coloco os parafusos no sentido horário para evitar que o gel Agros interno de um padrão se encaixe. Vou desenhar um milhão de mídia e usarei esta seringa para testar o dispositivo.

E como você pode ver, estou injetando fluido em cada microcanal e procurando fluido para sair de cada saída. Então, agora eu coloquei o dispositivo montado na câmara ambiental do microscópio. Isso é mantido a 37 graus Celsius, então isso aquecerá o dispositivo e o deixará pronto para quando precisarmos semear as células.

E como você pode ver, eu já enfiei os dois, a tubulação da bomba do guarda-sol na configuração. E atualmente estou lavando a tubulação com PBS em preparação para nossos experimentos. Então, agora vamos configurar a tubulação.

Vou enfiar a tubulação da bomba do guarda-sol nas tampas com os orifícios já perfurados nelas. E cada tubulação tem um número específico de entalhes para que eu possa identificar tanto a entrada quanto a saída da tubulação. Portanto, a tubulação com quatro entalhes receberá os 10 nanogramas por mil.

A solução EGF agora conectará a tubulação ao dispositivo. Então, vou anexá-lo a cada dispositivo de acordo com quantos entalhes ele possui. Portanto, corresponde à solução que está adotando.

E agora eu conecto a tubulação de saída. Usamos um tubo tigon transparente para garantir que a mídia esteja realmente fluindo através da tubulação de saída e que não haja bloqueios no canal. E agora vou ligar as bombas de guarda-sol.

Então, agora vou começar o procedimento para semear as células no canal central. Vou começar retirando o excesso de mídia no canal do sensor. Então agora vou ver as células.

As células já estão em suspensão em meios independentes de CO2. E eu estava vendendo, estava sentado 60 na entrada do canal central e estava sentado 20 microlitros na saída. E esperamos que as células sejam assentadas pelo fluxo impulsionado pela gravidade.

E vou repetir esse procedimento para os outros dois canais sensíveis e agora observaremos isso ao microscópio para ver se o assentamento da célula foi bem-sucedido. Portanto, agora as células aderiram à lâmina de vidro e em poucos minutos começarão a se espalhar e atingir sua morfologia única. Então, hoje cobrimos a montagem do dispositivo real, a preparação dos reagentes e as técnicas de microscópio que uso para obter imagens da migração celular dentro do dispositivo.

Em conclusão, esperamos que este dispositivo tenha uma abdicação muito mais ampla, especificamente no ambiente clínico. Então, imagine um horizontalmente. Ele mostra as trajetórias das células C 17.2 e o aumento das concentrações de EGF verticalmente.

Ele mostra as trajetórias das várias cepas das células C 17.2 que usamos em nossos experimentos com a mesma concentração de EGF. Os dados das células parentais mostram que há um pico de motilidade no gradiente de concentração de 10 nanogramas por mil EGF, indicando que os receptores ficaram saturados com ligante em uma concentração mais alta de EGF. E os dados do tipo selvagem mostram que há um aumento na motilidade na concentração de cem nanogramas por mil ou EGF.

Isso indica que os receptores não ficam saturados em concentrações mais altas de EGF. Isso faz sentido, pois eles foram projetados para superexpressar o receptor EGF. Finalmente, os dados da linhagem de células delta indicam que a motilidade das células é aproximadamente independente da concentração de EGF.

Isso também é esperado, uma vez que os receptores de EGF mutados foram projetados para serem ativados independentemente da presença de EGF.