Caracterização de espectros de absorção biológica abrangendo o visível ao infravermelho de ondas curtas

Nosso laboratório desenvolve ferramentas baseadas em luz que fornecem informações de diagnóstico para aplicações de saúde materna. Costumamos usar a espectroscopia óptica devido à infinidade de informações relacionadas à saúde que ela pode fornecer de forma não invasiva, como monitorar a oxigenação do sangue e a concentração de hemoglobina, ambos parâmetros fisiológicos importantes a serem monitorados durante a gravidez. Alguns solventes em água particulada têm forte absorção que pode ofuscar os solutos de interesse.

Além disso, os espectros que abrangem a região VIS-SWIR geralmente têm grandes diferenças na absorção em diferentes faixas de comprimento de onda, e temos que alterar as configurações experimentais para diferentes regiões para obter altos espectros SNL. A dificuldade em adquirir espectros biológicos VIS-SWIR contribuiu para espectros de absorção biológica publicados limitados, e pretendemos simplificar esse processo. Além disso, uma melhor compreensão das características espectrais específicas de cada componente biológico ajudará a escolher comprimentos de onda otimizados que podem minimizar o viés de pigmentação da pele causado pela forte absorção de melanina.

Esperamos que nosso protocolo permita que os pesquisadores expandam a atual biblioteca VIS-SWIR de absorvedores biológicos. Esses resultados também destacam o impacto da melanina em dispositivos ópticos em função do comprimento de onda e podem ser usados para projetar sistemas com viés mínimo de pigmentação da pele, como no SWIR. Para preparar a amostra de hemoglobina oxigenada com sangue humano heparinizado total, pipetar 1,8 mililitros de sangue em um tubo de microcentrífuga.

Centrifugue o tubo a 9,6 g por 10 minutos e descarte aproximadamente 850 microlitros de sobrenadante sem perturbar o pellet. Reconstitua o pellet em aproximadamente 850 microlitros de água deuterada e centrifugue novamente a 9,6g por 10 minutos. Após a última centrifugação, para lisar os glóbulos vermelhos, reconstitua os grânulos vermelhos com 4,5 mililitros de água deuterada.

Se o pellet estiver aderido ao tubo, enxágue com uma porção de água deuterada para soltá-lo. Usando uma agulha de ponta romba e uma seringa, remova a solução de sangue lisada do tubo. Em seguida, retire a agulha de ponta romba da seringa e descarte-a em um recipiente para objetos cortantes de risco biológico.

Em seguida, conecte um filtro de seringa de 0,22 micrômetro à seringa e filtre o conteúdo em um comprimento de caminho de 10 milímetros, vidro de 3,5 mililitros ou uma cubeta de quartzo. Prenda a cubeta com uma rolha hermética para evitar contaminação. Enrole o Parafilm ao redor da rolha para garantir uma vedação completamente hermética.

Prepare uma referência enchendo uma cubeta limpa com o mesmo caminho, comprimento e volume, com água deuterada para medições de linha de base e referência. Para preparar a amostra de hemoglobina desoxigenada, adicione ditionito de sódio à solução sanguínea na cubeta. Prenda a cubeta com uma rolha hermética e enrole o Parafilm ao redor da rolha para garantir uma vedação hermética.

Incline cuidadosamente a cubeta de um lado para o outro até que o ditionito de sódio esteja completamente dissolvido. Observe a mudança de cor da solução sanguínea de vermelho para um vermelho roxo mais escuro. Para começar, ligue a lâmpada do espectrômetro e os detectores, permitindo que o sistema aqueça por 5 a 20 minutos.

Limpe as cubetas com etanol usando um Kimwipe. Para um espectrômetro de feixe duplo, coloque cubetas cheias de água deuterada como solução de referência nas câmaras de amostra e de referência. Selecione a faixa de comprimento de onda apropriada e o detector com base na região espectral a ser medida.

Obtenha medições de referência usando os parâmetros padrão. Em seguida, substitua a cubeta na câmara de amostra pela cubeta contendo a hemoglobina oxigenada. Mude para o modo ao vivo para view absorbância continuamente à medida que os parâmetros de medição são ajustados.

Começando com os parâmetros padrão do espectrômetro, ajuste as leituras por datum e largura de banda para obter um espectro de absorção qualitativamente limpo sem saturação. Se a modificação da potência da luz incidente, largura de banda, tempo de exposição e leituras por datum não resultar em um espectro de alta relação sinal-ruído, altere a concentração da amostra, colocando a cubeta de referência na amostra ou na câmara de referência ou no comprimento do caminho da amostra e na referência para obter um espectro de alta relação sinal-ruído. Depois que as configurações forem otimizadas para a amostra, documente as configurações para cada espectro adquirido.

Usando as configurações otimizadas, meça novamente usando as mesmas configurações com a solução de referência nas câmaras de referência e de amostra para obter a medição de referência otimizada. Em seguida, substitua a cubeta de referência na câmara de amostra pela cubeta de amostra de hemoglobina oxigenada e faça uma medição de amostra otimizada. Salve as medidas de referência e de amostra separadamente.

Usando a seguinte equação, calcule a absorbância A tratando a medição de referência como I0 e a medição da amostra como I. Para pós-processamento, abra o software de análise de dados, como o MATLAB, e carregue as medições de absorbância adquiridas de diferentes regiões do espectro. Aplique um fator de multiplicação a uma região espectral para unir diferentes regiões com diferentes concentrações de amostra ou comprimentos de caminho. O espectro da hemoglobina oxigenada mostrou uma forte correlação com um espectro publicado por Prahl, com picos de absorção distintos em 415 nanômetros e um gibão entre 540 a 575 nanômetros na região visível, juntamente com uma ampla característica de absorção entre 800 e 1.100 nanômetros no infravermelho próximo.

Na região do infravermelho de ondas curtas. O espectro da hemoglobina oxigenada apresentou baixa absorção, provavelmente devido ao teor de água residual. O espectro da hemoglobina desoxigenada exibiu uma forte correlação com o espectro de Prahl, apresentando picos proeminentes em 430 nanômetros, 560 nanômetros e 760 nanômetros, e picos menores em torno de 1.200 nanômetros e entre 1.400 a 1.600 nanômetros.