Name: A glicoproteômica guiada por glicômicos facilita o perfil abrangente do glicoproteoma em microambientes tumorais complexos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprenda a glicoproteômica guiada por glicômicos para mapear o glicoproteoma em microambientes tumorais complexos. Este método integrado oferece insights detalhados para pesquisa em câncer.

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<meta charset="utf8"></head><body>Perfil de tecidos de câncer colorretal usando glicoproteômica guiada por glicômicos

A glicosilação de proteínas é um tipo prevalente e complexo de modificação co- e pós-traducional de proteínas produzidas por espécies em toda a árvore filogenética da vida 1,2,3. Os glicanos ligados a proteínas são conhecidos por impactar uma ampla gama de processos biológicos importantes para a saúde humana, incluindo mediação e regulação de interações celulares e eventos de comunicação 4,5. Acredita-se que a glicosilação de proteínas aberrantes seja uma causa de transformação maligna, progressão tumoral e disseminação 6,7,8. Isso implica glicanos nos principais processos tumorigênicos no microambiente tumoral (TME) e oferece um potencial considerável e amplamente inexplorado para a descoberta de biomarcadores baseados em glicanos e aplicações terapêuticas. A glicobiologia está, portanto, recebendo cada vez mais atenção na pesquisa do câncer e nas ciências da vida9.
Impulsionados pelos principais desenvolvimentos em glicoanalítica e informática na última década 10,11,12,13,14,15,16,17, a glicômica e a glicoproteômica orientadas por cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) foram estabelecidas como ferramentas poderosas para o perfil de todo o sistema de glicanos liberados e glicopeptídeos intactos de misturas complexas de glicoproteínas extraídas diretamente de suas origens de amostras biológicas, como vários tipos de espécimes de pacientes com câncer (por exemplo, tecidos tumorais, populações de células, fluidos corporais)3,13,18,19,20.
A glicômica fornece informações sobre a estrutura e a quantidade do repertório de glicanos (o glicoma), que é produzido dinamicamente por células, tecidos e até organismos inteiros. Por outro lado, a glicoproteômica fornece informações quantitativas sobre os transportadores de proteínas e seu(s) sítio(s) de glicosilação, as taxas de ocupação do sítio (macroheterogeneidade), as composições de glicanos específicos do sítio e seu padrão de distribuição de sítios (microheterogeneidade) com informações estruturais limitadas de glicanos (muitas vezes limitadas à composição de glicanos)15,16,21. Assim, a glicômica e a glicoproteômica são abordagens complementares para o levantamento dos detalhes bioquímicos do glicoproteoma22.
Uma miríade de desenhos metodológicos e estratégias analíticas para glicômica e glicoproteômica foi desenvolvida e aplicada em todos os laboratórios, dependendo do glicoanalito de interesse (por exemplo, ligado a N-/O-/C, glicano/glicopeptídeo/glicoproteína, marcado/não marcado), a natureza da amostra (por exemplo, células, tecidos, fluidos corporais), quantidade (níveis de nanograma/micrograma/miligrama de proteína) e o instrumento analítico disponível23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32. Apesar dos benefícios reconhecidos de seu uso paralelo, a glicômica e a glicoproteômica não são comumente aplicadas juntas, mas sim como abordagens autônomas em estudos de pesquisa glicobiológica e de câncer devido à sua alta demanda por conhecimento analítico e instrumentação especializada.
Reconhecendo essa lacuna tecnológica, há mais de uma década, introduzimos o método glicoproteômico assistido por glicômica, que é capaz de integrar dados glicômicos e glicoproteômicos obtidos de espécimes biológicos complexos33. Em suma, a tecnologia glicoproteômica assistida por glicômica (ou guiada por glicômica como neste protocolo) traça o perfil dos N- e/ou O-glicanos por meio de um método LC-MS/MS de carbono grafitizado poroso (PGC) estabelecido34,35, que são então usados para a análise de dados intactos de N- e/ou O-glicopeptídeo adquiridos da(s) mesma(s) amostra(s), definindo os limites do espaço de busca de glicanos36. PGC-LC-MS / MS é um método glicômico particularmente poderoso, pois fornece informações quantitativas sobre o glicoma com alta sensibilidade e resolução estrutural, produzindo informações sobre topologia (sequência de monossacarídeos e padrão de ramificação) e ligações glicosídicas de glicanos, mesmo dentro de misturas complexas35 , 37 , 38. O fluxo de trabalho de glicoproteômica envolve geração de peptídeos, marcação opcional de peptídeos, multiplexação e pré-fracionamento, bem como enriquecimento antes da análise de LC-MS/MS de fase reversa que emprega idealmente diferentes métodos de fragmentação, incluindo energia de colisão escalonada/dissociação colisional de alta energia (sceHCD, para N-glicopeptídeos) e transferência de elétrons/dissociação colisional de alta energia (EThcD, para O-glicopeptídeos) para identificação de analitos. Para a análise de N-glicoproteoma, a de-N-glicoproteômica paralela pode orientar a análise de dados de N-glicopeptídeos intactos, definindo o espaço de busca de proteínas/peptídeos e fornecendo mais detalhes sobre os locais de N-glicosilação ocupados e sua taxa de ocupação do local, enquanto a análise paralela de peptídeos não modificados revela quaisquer alterações no nível de proteína entre as condições estudadas.
Este artigo fornece um protocolo passo a passo detalhado e fácil de seguir para o método glicoproteômico guiado por glicômica (consulte a Figura 1 para obter uma visão geral do fluxo de trabalho). O protocolo fornece detalhes experimentais das etapas de preparação da amostra e dos experimentos de glicômica e glicoproteômica baseados em LC-MS / MS e apresenta resultados representativos que demonstram a aplicação do método a seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE) de tumores ressecados de pacientes com câncer colorretal (CRC), permitindo insights sobre a glicobiologia do TME em um valioso tipo de amostra que está arquivado em biobancos de câncer em todo o mundo. A análise e integração de dados glicômicos e glicoproteômicos também são brevemente discutidas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67405/67405fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Visão geral do método glicoproteômico guiado por glicômica. A visão geral mostra etapas experimentais detalhadas em fluxos de trabalho de glicômica (esquerda) e glicoproteômica (direita), com uma visão geral das informações obtidas (negrito) e como as duas abordagens são integradas por meio de análise e interpretação aprimoradas de dados. Inserir: Microcolunas SPE caseiras usadas para os fluxos de trabalho (i) glicômica e (ii-iii) glicoproteômica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67405/67405fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td><forte>Produtos Químicos</forte></td>Acetato de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>amônio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1542</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio, pureza &ge; 99.0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6141</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Acetonitrila anidra (ACN), grau LC-MS Sigma</td><td>Aldrich</td><td>34851</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Fetuin bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3004</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Ácido fórmico, grau LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>00940</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Iodoacetamida (IAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1775</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Peptídeo-N-glicosidase F (PNGase F)</td><td>Promega</td><td>V4831</td><td>Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/&mu; L) expresso recombinantemente em Escherichia coli;</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona 40 (PVP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PVP40</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio (KOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>484016</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Tripsina suína de grau de sequenciamento&nbsp;</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Borohidreto de sódio (NaBH4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213462</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Bicarbonato de trietilamônio (TEAB), grau LC-MS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA), grau LC-MS Sigma</td><td>Aldrich</td><td>T6508</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Ferramentas/Materiais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 discos</td><td>Empore</td><td>66883-U</td><td></td></tr><tr><td>Discos C8</td><td>Empore</td><td>66882-U</td><td></td></tr><tr><td>Placa de polipropileno de fundo plano de 96 poços&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3364</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-PSQ membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF)</td><td>Millipore</td><td>IPVH20200</td><td>Tamanho dos poros: 0,45 &mu; m&nbsp;</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5452000069</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Adaptadores de microcentrífuga&nbsp;</td><td>O Nest Group, Inc., MA</td><td>SS18V</td><td>MiniSpin Column Collar, vem com Microspin Columns</td></tr><tr><td>Oligo R3 resina</td><td>Thermo</td><td>1133903</td><td>Tamanho de partícula 30 &mu; m</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm M</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Protein LoBind 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030108450</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind tubos 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030108442</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Safe-lock 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Safe-lock 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>5382000066</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Furador de furo único</td><td>Swingline</td><td>74005</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador SpeedVac</td><td>Martin Christ</td><td>RVC 2-25 CDplus</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Supelclean ENVI-Carb Resina SPE</td><td>Supelco</td><td>57088</td><td>Tamanho de partícula 120-400 mesh. A resina pode ser extraída manualmente dos cartuchos e pode ser armazenada a longo prazo em 50% (v/v) de metanol em água MilliQ</td></tr><tr><td>Seringa 5 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z116866</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Incubadora com temperatura controlada</td><td>Thermoline</td><td>E7.30</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Banho ultrassônico</td><td>Unisonics</td><td>FXP</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Resina ZIC-HILIC</td><td>Merck</td><td>150455</td><td>Tamanho da partícula/poro, 5 &mu; m/200 &Aring;. A resina pode ser extraída manualmente da coluna LC e pode ser armazenada a longo prazo em 50% (v/v) de metanol em</td></tr><tr><td>micro-colunas de extração em fase sólida (SPE) ZipTip C18 da MilliQ water&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td>Alternativamente, as micro-colunas C18-SPE caseiras podem substituir o produto comercial</td></tr><tr><td>LC-MS/MS Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1260 Sistema de HPLC Capilar Infinito&nbsp;</td><td>Agilent</td><td></td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Coluna LC analítica pré-embalada com resina ReproSil-Pur C18 AQ</td><td>Dr. Maisch, Ammerbuch-Entringen, Alemanha</td><td>r13.aq.s2570</td><td>Tamanho da partícula/poro: 3 &mu; m/120 &Aring;, comprimento/diâmetro interno: 25 cm/75 &mu;m. Colunas comerciais C18 nano-LC também disponíveis/&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC&nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td>Alternatives disponíveis</td></tr><tr><td>HyperCarb KAPPA PGC coluna capilar LC&nbsp;</td>Tamanho de partícula/poro <td>descontinuado termicamente</td><td></td><td>, 3 &mu; m/250 &Aring;; comprimento da coluna, 30 mm; diâmetro interno, 0,180 mm. Geometrias maiores das colunas HyperCarb PGC-LC, produzindo dados de qualidade semelhantes, estão disponíveis comercialmente (por exemplo, Thermo # 35003-031030). Coluna SupelTMCarb LC da Merck com tamanho de partícula/poro, 2,7 &mu; m/200 e com diferentes comprimentos de coluna e diâmetro interno também estão disponíveis (por exemplo, Merck #59994-U).&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetonitrila de grau LCMS</td><td>LiChrosolv</td><td>100029</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Armadilha linear quadrupolo (LTQ) Espectrômetro de massa de armadilha de íons Velos Pro (glicômica)&nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Espectrômetro de Massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (glicoproteômica)</td><td>Thermo</td><td></td><td>Outros sistemas MS de alta resolução com ou sem ETD (necessários apenas para O-glicoproteômica) também estão disponíveis (por exemplo, Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker ou espectrômetros de massa de alto desempenho semelhantes de outros fornecedores)</td></tr><tr><td>Frascos de parafuso de vidro transparente de recuperação total 0,9 mL</td><td>Thermo</td><td>THC11093563</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Total Recovery Frascos de parafuso de vidro transparente tampas correspondentes</td><td>Thermo</td><td>THC09150869</td><td>Alternativas disponíveis</td></tr><tr><td>Coluna Trap LC embalada internamente com resina ReproSil-Pur C18 AQ&nbsp;</td><td>Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Alemanha</td><td>r15.aq.s0202</td><td>Tamanho da partícula/poro: 5 &mu; m/120 &Aring;, comprimento/diâmetro interno: 2 cm/100 &mu;m. Colunas LC de armadilha C18 comerciais também estão disponíveis.</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Byonic</td><td>Protein Metrics Inc</td><td>v2.6.46 ou superior</td><td>Motor de busca comercial de glicopeptídeos e PTM, aceitando dados brutos LC-MS/MS da maioria dos fornecedores de MS</td></tr><tr><td>Byos</td><td>Protein Metrics Inc</td><td>v3.9-7 ou superior</td><td>Software comercial para inspeção manual de candidatos a glicopeptídeos e anotação automática de espectros de glicano MS/MS</td></tr><tr><td>GlycoMod</td><td>Expasy</td><td></td><td>Software de acesso aberto, auxiliando na anotação de dados glicômicos (https://web.expasy.org/glycomod/)</td></tr><tr><td>GlycoWorkBench</td><td>EUROCarbDB</td><td>v2.1</td><td>Software de acesso aberto, auxiliando na anotação de dados glicômicos e no desenho de desenhos animados de glicanos</td></tr><tr><td>RawMeat</td><td>VAST Scientific</td><td>v2.1</td><td>Software de acesso aberto, extraindo m/z de íons precursores de glicanos a partir de dados espectrais brutos</td></tr><tr><td>Skyline</td><td>Brendan X. MacLean</td><td>v21.2 ou superior</td><td>Software de acesso aberto para quantificação relativa de glicanos</td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>Thermo</td><td>v2.2 ou superior</td><td>Para navegar em dados brutos de LC-MS/MS</td></tr></tbody></table>

a glicoproteômica guiada por glicômicos facilita o perfil abrangente do glicoproteoma em microambientes tumorais complexos 

Glycomics-Guided Glycoproteomics Facilitates Comprehensive Profiling of the Glycoproteome in Complex Tumor Microenvironments

Os resultados representativos do método glicoproteômico guiado por glicômica aplicado a uma lâmina de tecido FFPE de um paciente que sofre de CCR no estágio II são fornecidos nesta seção.
Para obter material de partida proteico suficiente para o protocolo, extratos de proteínas de duas lâminas (pilhas z) foram combinados do mesmo bloco de tecido FFPE seguindo um protocolo publicado e uma abordagem de marcação TMT foi aplicada para aumentar a sensibilidade do experimento de glicoproteômica (vej...

A glicoproteômica guiada por glicômicos facilita o perfil abrangente do glicoproteoma em microambientes tumorais complexos 

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven ...

glycomics-guided-glycoproteomics-facilitates-comprehensive-profiling

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Neste estudo, nós descrevemos um protocolo melhorado para um microarray anticorpo multiplexado de alto rendimento com o método de detecção de lectina que pode ser usado em perfil de glicosilação de proteínas específicas. Este protocolo apresenta novos reagentes fiáveis ​​e reduz significativamente o tempo, custo e requisitos de equipamento de laboratório, em comparação com o procedimento anterior.

Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas

Profiling glicana de Polímeros da planta da parede celular usando Microarrays

As proteínas de superfície são biologicamente importantes e amplamente glicosilada. Apresentamos aqui uma abordagem de captura de glycopeptide para solubilizar, enriquecer e deglycosylate estas proteínas para análise proteômica baseada LC-MS fáceis.

Captura de glicopeptídeos de Superfície Celular Proteômica

Análises aprofundadas de proteomas de células cancerígenas facilitam a identificação de novos alvos de drogas e biomarcadores diagnósticos. Descrevemos um fluxo de trabalho experimental para análise quantitativa de (fosfo-)proteomas em subpopulações de células cancerígenas derivadas de tumores líquidos e sólidos. Isso é conseguido combinando estratégias de enriquecimento celular com espectrometria de massa quantitativa baseada em Super-SILAC.

Quantitative Mass Spectrometric Profiling de proteomas de células do cancro da derivadas do líquido e tumores sólidos

Este artigo apresenta uma forma aprimorada de uma nova técnica de glicômica de baixo para cima projetada para analisar o perfil de composição agrupado de glicanos em biofluidos não fracionados por meio da decomposição química de glicanos em seus monossacarídeos específicos de ligação constituinte para detecção por GC-MS. As aplicações potenciais incluem a detecção precoce de câncer e outros distúrbios afetivos glicanos.

Glicanos Análise Node: uma abordagem de baixo para cima para Glycomics

Este artigo descreve um método para preparar as amostras de tecido para análise MS cardiovasculares que permite (1) a análise da composição de proteínas de ECM, (2) a identificação de locais de glicosilação, e (3) a caracterização da composição de formas de glicano. Esta metodologia pode ser aplicada, com pequenas modificações, para o estudo da ECM em outros tecidos.

Glicoproteômica da matriz extracelular: um método de análise GLICOPï¿½TIDOS Intact Usando Espectrometria de Massa

Um ensaio de microarrays de sialoglicano pode ser usado para avaliar anticorpos anti-Neu5Gc em soros humanos, tornando-se um possível ensaio de diagnóstico de alto rendimento para câncer e outras doenças crônicas causadas por inflamação mediada por doenças humanas.

Perfis Anti-Neu5Gc IgG em Sera Humana com um Ensaio de Microarray de Sialoglicano

Este protocolo ilustra como explorar, comparar e interpretar as proteínas humanas com recursos on-line.

Recursos bioinforáticos para o estudo de interações proteicas mediadas por glicanos

Este protocolo detalha uma metodologia para detecção de mRNA multiplex com citometria de massa de imagem de proteína em seções de tecido embebidas em parafina fixada em formalina.

Cartografia Molecular de Modalidade Dupla: Integrando a Detecção de RNA Multiplex com a Citometria de Massa por Imagem de Proteínas

Esse protocolo preparou com sucesso tecido neovascular de alta qualidade suficiente a partir de amostras de glioma usando microdissecação por captura a laser para análise proteômica quantitativa da angiogênese tumoral, superando as limitações de estudos que tradicionalmente focam principalmente em fatores angiogênicos e fornecendo um perfil proteômico em larga escala da angiogênese do glioma.

Preparação de tecidos neovasculares de tecidos de glioma humanos para análise proteômica quantitativa da angiogênese tumoral

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