Name: Imagem de cálcio de célula única para estudar a ativação de canais de íons de cálcio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Aprenda a técnica de imagem de cálcio em célula única usando o corante Fura-2/AM para monitorar canais de íons relacionados à temperatura e dor. Este método permite o estudo de mecanismos de sinalização celular em tempo real.

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<meta charset="utf8"></head><body>Imagem de cálcio de célula única para estudos de ativação de canal

<ol><li>Murthy, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+for+contraction+and+relaxation+in+smooth+muscle+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signaling for contraction and relaxation in smooth muscle of the gut.</a> Annu Rev Physiol. 68, 345-374 (2006).</li>
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<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF6+safeguards+organelle+homeostasis+and+cellular+aging+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discov%22%5BJournal%5D)">ATF6 safeguards organelle homeostasis and cellular aging in human mesenchymal stem cells.</a> Cell Discov. 4, 2(2018).</li>
<li>Jiang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanosensitive+piezo1+channel+mediates+heart+mechano-chemo+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The mechanosensitive piezo1 channel mediates heart mechano-chemo transduction.</a> Nat Commun. 12 (1), 869(2021).</li>
<li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Orai1-mediated+store-operated+Ca%282%2B%29+channel%2Fcalpain+signaling+contributes+to+high+glucose-induced+podocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced Orai1-mediated store-operated Ca(2+) channel/calpain signaling contributes to high glucose-induced podocyte injury.</a> J Biol Chem. 298 (6), 101990(2022).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+er+ion+homeostasis+maintained+by+an+er+anion+channel+clcc1+contributes+to+als-like+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Disruption of er ion homeostasis maintained by an er anion channel clcc1 contributes to als-like pathologies.</a> Cell Res. 33 (7), 497-515 (2023).</li>
<li>Gouin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trpv1+and+trpa1+in+cutaneous+neurogenic+and+chronic+inflammation%3A+Pro-inflammatory+response+induced+by+their+activation+and+their+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Trpv1 and trpa1 in cutaneous neurogenic and chronic inflammation: Pro-inflammatory response induced by their activation and their sensitization.</a> Protein Cell. 8 (9), 644-661 (2017).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+fura-2+am%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using fura-2 am.</a> J Vis Exp. (23), e1067(2009).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lever-like+transduction+pathway+for+long-distance+chemical-+and+mechano-gating+of+the+mechanosensitive+piezo1+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A lever-like transduction pathway for long-distance chemical- and mechano-gating of the mechanosensitive piezo1 channel.</a> Nat Commun. 9 (1), 1300(2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Câmera</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capsaicine</td><td>Sigma</td><td>211275</td><td></td></tr><tr><td>CL-100 controlador de temperatura</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido Ciclopiazônico (CPA)</td><td>Sigma</td><td>C1530</td><td></td></tr><tr><td>DG-4 light</td><td>Sutter Instrument Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagem de fluorescência (MetaFluor, software pago)&nbsp;</td>Microscópio de fluorescência <td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2/AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>HBSS buffer</td><td>Gibco</td><td>14175103</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>&nbsp; Beyotime</td><td>ST501</td><td></td></tr><tr><td>poli-D-lisina</td><td>&nbsp; Dispositivo</td> de aquecimento/resfriamento de circulação de líquidos Beyotime <td>ST508</td><td></td></tr><tr><td>SC-20&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz branca</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagem de cálcio de célula única para estudar a ativação de canais de íons de cálcio

Single-Cell Calcium Imaging for Studying the Activation of Calcium Ion Channels

Detecção de resposta de temperatura 
Queratinócitos primários Os queratinócitos primários foram isolados de camundongos recém-nascidos e preparados de acordo com protocolos estabelecidos10. Essas células foram semeadas em placas de 24 poços contendo lâminas de vidro. Após o carregamento da sonda Fura-2, o foco foi ajustado ao microscópio em um comprimento de onda de 380 nm para obter uma visualização clara da morfologia celular, conforme ilustrado na Figura 2A. Se a sonda não fosse carregada com sucesso durante o processo, as células não seriam visíveis. O tampão extracelular na câmara foi continuamente substituído por meio de um sistema de perfusão, garantindo condições ideais para as células. O sistema de controle de temperatura foi conectado ao sistema de perfusão, permitindo a detecção de respostas térmicas celulares por meio do controle das mudanças de temperatura no tampão extracelular. Esse processo envolveu o aquecimento gradual do tampão extracelular e, em seguida, o resfriamento gradual.
O sistema de imagem de Ca2+ de célula única foi utilizado para monitorar as mudanças na concentração intracelular de Ca2+ sob várias condições experimentais. Conforme mostrado na Figura 2B, os queratinócitos exibiram uma resposta térmica distinta quando submetidos ao aquecimento, bem como uma resposta perceptível durante a fase de resfriamento. Notavelmente, essa resposta à temperatura desapareceu quando o gene STIM1, que é o principal responsável por essa resposta, foi excluído (Figura 2C) 10 . A imagem de Ca2+ de célula única permite a observação de mudanças em tempo real na concentração intracelular de Ca2+ em resposta a vários estímulos externos, permitindo uma análise detalhada do comportamento e sinalização celular.
HEK293T células superexpressando os plasmídeos alvo HEK293T células foram semeadas em uma placa de 24 poços contendo lâminas de vidro de acordo com o método experimental. As células foram então superexpressas com STIM1 / Orai1, e sua resposta térmica mediada foi detectada usando o mesmo método descrito acima para células primárias. No caso de células que superexpressam o plasmídeo alvo, a transfecção bem-sucedida foi confirmada pela seleção de células que expressaram o plasmídeo correspondente, conforme indicado por proteínas fluorescentes vermelhas ou verdes transportadas pelo plasmídeo sob comprimentos de onda TRITC ou FITC. Para este experimento, foram utilizados plasmídeos STIM1-GFP/Orai1-DsRed, com GFP detectado sob FITC, emitindo fluorescência verde, e DsRed detectado sob TRITC, emitindo fluorescência vermelha. Células superexpressando mCherry vazias (TRITC) foram usadas como controles negativos. Conforme mostrado na Figura 3A, as células fluorescentes observadas sob o FITC indicaram a expressão bem-sucedida de STIM1, permitindo a seleção e o registro de sua resposta térmica durante os processos de aquecimento e resfriamento. As células que não foram transfectadas serviram como controle negativo. A Figura 3B demonstra que STIM1 / Orai1 exibiu uma resposta térmica significativa durante o processo de resfriamento, contrastando com o controle negativo mostrado na Figura 3C.
Detecção de resposta a medicamentos A tecnologia de imagem de Ca2+ de célula única também pode ser usada para detectar respostas celulares a compostos. A preparação da célula para detecção de resposta térmica é a mesma descrita acima. A diferença entre a resposta a medicamentos e a resposta térmica reside no fato de que a resposta térmica geralmente requer a ativação das células alterando a temperatura do tampão extracelular por meio de um sistema de perfusão, enquanto os compostos podem ser administrados por meio de perfusão ou adicionando-os diretamente usando uma pipeta. A adição direta com uma pipeta pode efetivamente conservar a quantidade de composto usado; no entanto, a curva resultante pode nem sempre ser tão visualmente atraente quanto a obtida por meio da perfusão.
Tomando a Figura 4 como exemplo, a Figura 4A mostra a resposta de entrada de cálcio operada por armazenamento (SOCE) de STIM1 / Orai1, onde a concentração extracelular de Ca2+ e o conteúdo de ácido ciclopiazônico (CPA) são alterados sequencialmente por meio de um sistema de perfusão para induzir SOCE. Na Figura 4B, o agonista TRPV1 capsaicina é adicionado diretamente usando uma pipeta às células que superexpressam o plasmídeo TRPV1. A capsaicina pode ativar o TRPV1 e induzir o influxo extracelular de Ca2+ .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig01.jpg">
Figura 1: Diagrama esquemático do Fura-2 AM. Fura-2 é uma sonda de fluorescência de Ca2+ comumente usada em biologia celular que se liga seletivamente a Ca2+ em uma proporção de 1:1 e emite fluorescência. Devido à sua natureza altamente polar como um composto ácido, o Fura-2 não pode entrar nas células. Para aumentar a permeabilidade celular, é conjugado com acetoximetil (AM) em seu grupo negativo para formar Fura-2 / AM. Esta modificação aumenta sua solubilidade de éster e elimina a carga negativa. Dentro das células, Fura-2 / AM é hidrolisado por esterases em Fura-2, que pode se ligar reversivelmente ao Ca2+ citoplasmático livre. Após a ligação, o comprimento de onda máximo de excitação muda de 380 nm para 340 nm (quando saturado com Ca2+). A intensidade de fluorescência emitida está quantitativamente relacionada à concentração de Ca2+ ligado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig02.jpg"> 
Figura 2: Detecção de resposta à temperatura dos queratinócitos primários. (A) Coloração Fura-2 de queratinócitos de camundongos recém-nascidos, observada sob uma lente objetiva de 20x. (B, C) Resposta à temperatura de queratinócitos WT (B) e queratinócitos knockout STIM1 (C) usando um sistema de imagem Ca2+ de célula única. Ampliação: 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig03.jpg"> 
Figura 3: Detecção de resposta à temperatura de STIM1-GFP/Orai1-Dsred superexpresso em células HEK293T. (A) Uma figura representativa mostrando células positivas expressando STIM1-GFP sob FITC. (B, C) Resposta à temperatura de HEK293T células que expressam o respectivo plasmídeo detectado por um sistema de imagem Ca2+ de célula única. Ampliação: 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67412/67412fig04.jpg"> 
Figura 4: Detecção de resposta a medicamentos usando imagens de Ca2+ de célula única. (A) Resposta SOCE de células HEK293T superexpressando STIM1 / Orai1. O tampão extracelular é alterado de contendo Ca2+ para livre de Ca2+ usando um sistema de perfusão. Na ausência de Ca2+, o CPA é adicionado para esgotar o Ca2+ do retículo endoplasmático. O tampão extracelular é então substituído por um tampão contendo Ca2+ para induzir o influxo extracelular de Ca2+ , representando a entrada de Ca2+ operada por armazenamento. A imagem de Ca2+ de célula única é utilizada para registrar dinamicamente as alterações na concentração citosólica de Ca2+ induzidas por esses processos. (B) HEK293T células que superexpressam TRPV1-mRuby, onde mRuby é uma proteína fluorescente usada para verificar a condição de transfecção da proteína TRPV1. A capsaicina é adicionada usando uma pipeta, enquanto o influxo de Ca2+ é registrado por imagens de Ca2+ de célula única. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67412/67412fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Imagem de cálcio de célula única para estudar a ativação de canais de íons de cálcio

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and ...

single-cell-calcium-imaging-for-studying-activation-calcium-ion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Atividade espontânea de desenvolvimento de redes neuronais podem ser medidos utilizando-AM éster formas de corantes de cálcio sensível indicador. Alterações de cálcio intracelular, o que indica a ativação neuronal, são detectados como alterações transitórias na fluorescência indicador com um ou dois fótons de imagem. Este protocolo pode ser adaptada para uma série de developmentally dependentes de redes...

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Aqui nós apresentamos um protocolo ao cálcio imagem sinalização em populações de tipos de células individuais na junção neuromuscular murino.

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Os métodos atuais descrevem uma abordagem não-ratiométrica para imagens subcompartimentais de cálcio de alta resolução in vivo em Caenorhabditis elegans usando indicadores de cálcio codificados geneticamente prontamente disponíveis.

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Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECI) permitem uma análise robusta em nível populacional da sinalização de neurônios sensoriais. Aqui, desenvolvemos uma nova abordagem que permite a visualização in vivo do GECI da atividade dos neurônios dos gânglios trigeminais de ratos.

In-Vivo Imagem de cálcio de neurônios sensoriais no gânglio trigeminal de ratos

Aqui, fornecemos um protocolo abrangente para resolver sinais locais iniciais de Ca2+ , conhecidos como microdomínios de Ca2+ , em células T murinas e humanas primárias usando microscopia de fluorescência. Este protocolo serve como um recurso valioso para pesquisadores que examinam as vias de sinalização de Ca2+ dentro das células imunes e para desvendar ainda mais sua função.

Imagem de microdomínios iniciais de Ca2+ em células T primárias

Aprenda a técnica de imagem de cálcio em célula única usando o corante Fura-2/AM para monitorar canais de íons relacionados à temperatura e dor. Este método permite o estudo de mecanismos de sinalização celular em tempo real.

Imagem de cálcio de célula única para estudar a ativação de canais de íons de cálcio

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