Name: Usando pinças ópticas para a geração de esferoides híbridos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Aprenda a construir esferoides híbridos de linfoma usando pinças ópticas para controle preciso da formação celular em três dimensões. Este método permite estudar interações célula-célula em nível individual.

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1. Fabricação de micromoldes à base de gel de agarose
NOTA: Técnicas assépticas adequadas são essenciais ao manusear todas as culturas de células. Todos os reagentes utilizados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais. Prepare três géis com MSCs para um único experimento, conforme mostrado na Figura 1A.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67422/67422fig01.jpg"> 
Figura 1: Preparação de esferóides de células estromais mesenquimais (MSC). (A) Ilustração que descreve a etapa de preparação dos micromoldes de agarose. (B) Semeadura de células estromais mesenquimais (MSCs) e cultivo de esferóides mesenquimais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67422/67422fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol>
	<li>Comece preparando os micromoldes de agarose. Enxágue a placa de Petri 3D micromolde (consulte a Tabela de Materiais) com água deionizada (3x) e coloque sob a lâmpada UV por 30 min para realizar a esterilização.</li>
	<li>Primeiro, prepare uma solução de agarose a 2%. Meça 1 g de pó de agarose estéril puro de alta qualidade (consulte a Tabela de Materiais) e coloque-o em um tubo cônico estéril de 50 mL. Adicione 50 mL de solução estéril de cloreto de sódio a 0,9% (consulte a Tabela de Materiais) à agarose e misture bem. Aparafuse a tampa do tubo cônico até que esteja firme, mas ainda solto.</li>
	<li>Use o forno de micro-ondas para ferver e dissolver completamente o pó de agarose. Pare de micro-ondas a cada 10 s e gire cuidadosamente o tubo cônico para garantir que a agarose se dissolva. Evite criar bolhas ao misturar ou pipetar agarose. Resfrie a agarose a aproximadamente 70 °C. NOTA: Certifique-se de que não haja restos de pó não dissolvido translúcido. CUIDADO: A agarose derretida é extremamente quente e pode causar queimaduras graves na pele.</li>
	<li>Trabalhe no gabinete de fluxo laminar usando técnicas assépticas. Prepare os hidrogéis preenchendo micro-moldes previamente esterilizados com 500 μL de agarose. Aspire todas as bolhas que possam estar presas nas pequenas características do micromolde usando uma pipeta.</li>
	<li>Após 15 min de incubação em temperatura ambiente, quando a agarose estiver solidificada, remova cuidadosamente os géis dos micromoldes para uma placa estéril de 6 poços. Não danifique a estrutura do gel. Antes de prosseguir para a próxima etapa, verifique ao microscópio se os micromoldes foram preparados corretamente e certifique-se de que as bordas estejam intactas. Verifique se há lacunas pelas quais o meio pode vazar.</li>
	<li>Adicione 1x tampão fosfato salino (PBS) suficiente para cobrir completamente os micromoldes antes de colocar a placa sob uma lâmpada UV por 30 min para esterilização. NOTA: Os micromoldes de agarose podem ser armazenados antes do uso por até 2 semanas em um tubo cônico coberto com 1x PBS em condições de geladeira (4 °C).</li>
	<li>Antes de usar os micromoldes para produzir esferoides, equilibre o gel cobrindo-o completamente em meio RPMI (4,0 mL/poço para uma placa de 6 poços) e incube por no mínimo 15 min.</li>
</ol>
2. Preparação de esferoides de células estromais mesenquimais (MSCs)
<ol>
	<li>Cultive a linhagem celular HS-5 (ver Tabela de Materiais), uma linhagem celular estromal mesenquimal humana, em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina (ver Tabela de Materiais) em condição padrão, garantindo uma troca de meio a cada 48 h.</li>
	<li>Quando as células HS-5 estiverem aproximadamente 90% confluentes, execute a passagem celular da seguinte forma:<ol>
		<li>Remover os meios de cultura com uma pipeta serológica.</li>
		<li>Lave as células adicionando 1x PBS e girando e aspirando para remover qualquer mídia restante.</li>
		<li>Separar as células do fundo do balão de cultura adicionando 2 ml de solução de tripsina-EDTA (ver Tabela de Materiais) ao balão de cultura de células e incubando a 37 °C para facilitar o desprendimento das células.</li>
		<li>Pare a tripsinização adicionando 2 mL de meio de cultura completo.</li>
		<li>Usando uma pipeta de 5 mL, suspenda suavemente as células e transfira-as para um tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Centrifugue a suspensão celular a 300 x g por 7 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de meio de cultura fresco.</li>
		<li>Pegue 10 μL do pellet celular e transfira-o para um tubo de 0,5 mL. Em seguida, adicione 10 μL de solução de azul de tripano a 0,4% (consulte a Tabela de Materiais) e conte as células em um contador automático de células (consulte a Tabela de Materiais).</li>
		<li>Com base na densidade celular obtida acima, dilua as células para 2 x 105 células/mL de meio.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Remova o meio de cultura celular do micromolde de agarose.</li>
	<li>Semear cuidadosamente 190 μL da suspensão celular mencionada acima (etapa 2.2.8) na câmara de semeadura celular do micromolde de agarose. Um único poço conterá aproximadamente 150 células (38.000 células/gel).</li>
	<li>Incubar as células em micromofo de agarose em uma incubadora (5% CO2, 37 ° C, atmosfera úmida) por 30 min até que as células se assentem no fundo do gel. Após 30 min, remova a placa contendo micromofo da incubadora e adicione lentamente um meio adicional à parte externa dos géis, cobrindo-os inteiramente (por exemplo, 4,0 mL / poço para a placa de 6 poços). NOTA: Não adicione o meio diretamente no micromolde de agarose em gel, mas na placa de cultura, evitando danificar os esferóides recém-formados.</li>
	<li>Colocar o gel numa incubadora a 37 °C numa atmosfera húmida de CO2 a 5% durante 72 h até formarem esferóides uniformes. (Figura 1B). NOTA: Recomenda-se observar a formação do esferóide pelos 3 dias seguintes sob um microscópio invertido. Em geral, as células estromais mesenquimais começam a formar esferoides em 24 horas, mas esse processo pode ser mais rápido ou mais lento com diferentes passagens e densidades celulares. Após 72 h de incubação em micromolde de agarose, as células estromais mesenquimais formam esferoides relativamente uniformes; no entanto, vale a pena notar que eles podem variar em tamanho e forma, apesar de serem incubados em condições idênticas. O meio precisa ser substituído quando muda de uma cor vermelho-púrpura para amarelo.</li>
</ol>
3. Cultura de células de linfoma e preparação para aprisionamento óptico
NOTA: As linhagens celulares hematológicas, incluindo as células do linfoma, crescem flutuando livremente nos meios de cultura em frascos concebidos para cultura em suspensão, sem qualquer fixação à placa ou recipiente de cultura. Para manter as propriedades celulares ideais, recomenda-se iniciar a preparação da amostra não antes de 30 minutos antes do procedimento de montagem dos esferóides híbridos usando a pinça óptica. É importante ressaltar que o protocolo descrito nesta seção é para a linha celular de linfoma humano Ri-1, mas um protocolo semelhante se aplica a outras linhas de células de câncer hematológico.
<ol>
	<li>Cultive a linha celular de linfoma Ri-1 (ver Tabela de Materiais) em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Manter as células do linfoma na incubadora em condições de cultura padrão, incluindo 37 °C e ar humidificado com 5% de CO2. Mantenha culturas entre 3-5 x 105 células/mL na fase logarítmica, passando a cada 2-3 dias.</li>
	<li>Recolha as células e transfira a suspensão para um tubo de poliestireno de 15 ml. Centrifugue as células a 300 x g por 7 min em temperatura ambiente para obter um pellet de célula. Remova o sobrenadante e adicione 10 mL de meio fresco, pipete suavemente até obter uma suspensão homogênea.</li>
	<li>Aspirar 10 μL de suspensão celular para um novo tubo de centrífuga e adicionar 10 μL de azul de tripano. Pipetar bem a suspensão antes de transferir 10 μL para a câmara de contagem para determinar a densidade e viabilidade celular (normalmente superior a 95%).</li>
	<li>Diluir a suspensão celular até atingir uma densidade final de 1 x 104 células/ml. Manter as células do linfoma a 37 °C até manipulações ópticas.</li>
</ol>
4. Configurando o sistema de pinças ópticas
NOTA: O protocolo abaixo foi desenvolvido especificamente para as pinças ópticas personalizadas36 (Figura 2A). No entanto, este ensaio pode ser usado com outros sistemas de captura disponíveis comercialmente. Independentemente do tipo de equipamento disponível, as etapas básicas para a preparação do sistema (por exemplo, iniciar o laser e o software de computador, montar a amostra e testar a possibilidade de mover a célula em uma armadilha óptica) permanecem as mesmas. Todos os experimentos foram realizados em temperatura ambiente, ou seja, 25 °C.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67422/67422fig02.jpg"> 
Figura 2: Um esquema ilustrando o mecanismo de trabalho da geração de esferóides híbridos por pinças ópticas. (A) Configuração de pinças ópticas personalizadas. (B) O processo de anexar células individuais de linfoma à superfície de MSCs esferóides. Uma única célula de linfoma foi opticamente aprisionada e ligada à superfície de um esferóide estromal até que uma conexão estável fosse formada. Esse processo continuou até que toda a superfície do esferóide estromal fosse coberta por células de linfoma. (C) Uma imagem representativa da coloração imuno-histoquímica da seção esferóide híbrida foi obtida usando um anticorpo monoclonal de camundongo anti-CD20 contra CD20. A imunomarcação foi realizada usando um anticorpo monoclonal anti-humano de camundongo contra CD20 em um autocorador (ver Tabela de Materiais), seguindo as instruções do fabricante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67422/67422fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol>
	<li>Ligue a fonte de luz do microscópio.</li>
	<li>Use um vidro protetor seguro para laser.</li>
	<li>Ligue o laser e defina a potência para obter uma rigidez de armadilha de aproximadamente 50 pN/μm no sistema de pinças ópticas. Antes de prosseguir, aguarde 10 min, permitindo que o feixe de laser se estabilize. NOTA: No sistema personalizado, a rigidez da armadilha é alcançada para a potência do laser de 100 mW na entrada da objetiva do microscópio medida para esferas de poliestireno de 3 μm. Sua mínima invasividade nas células do linfoma foi previamente confirmada32,33, mantendo a capacidade de manipular células vivas.</li>
	<li>Enquanto isso, inicie o software do computador. Na janela do software, uma imagem da amostra do microscópio aparecerá. Use os marcadores visíveis na tela para mover a armadilha óptica na direção desejada.</li>
	<li>Quando o sistema estiver pronto, adicione 30 μL de água deionizada ao centro da objetiva inferior. NOTA: O sistema personalizado usa uma objetiva de imersão em água; no entanto, a mídia de imersão pode diferir dependendo da configuração do usuário.</li>
	<li>Coloque uma placa de cultura de células de 35 mm (consulte Tabela de Materiais) com fundo de vidro na platina do microscópio. Estabilize o prato com os suportes.</li>
	<li>Levante a objetiva usando o parafuso micrométrico do microscópio até que a gota de água toque o fundo de vidro do prato.</li>
	<li>Usando o parafuso do micrômetro, ajuste suavemente o microscópico stage até ver o feixe de laser nitidamente focado em um único ponto brilhante na tela. Uma imagem da amostra do microscópio estará presente na janela do software. Use os marcadores visíveis na tela para mover a armadilha óptica em qualquer direção desejada.</li>
	<li>Adicionar 100 μL de suspensão de células de linfoma previamente preparada (ver ponto 3.5) ao centro da placa com fundo de vidro. Deixe-os afundar no fundo do prato por aproximadamente 5 min.</li>
	<li>Usando os movimentos do estágio do microscópio, encontre uma célula de linfoma flutuante. Permita que a armadilha óptica atinja a amostra clicando no cursor da armadilha na tela. Tente mover a célula para o local desejado. Uma célula, para ser útil para manipulação, precisa ser capaz de se mover facilmente na direção dada. NOTA: De acordo com nossa observação, entre 5 a 10% das células de linfoma adicionadas ao prato de vidro se fixarão permanentemente no fundo após o período de incubação. Essa porcentagem aumentará com a duração da manipulação e pode chegar a 30% após 60 min. No entanto, apesar dessas perdas, o número de células inicialmente adicionadas ao prato permitirá a calibração eficaz do sistema e a cobertura do esferóide com células de linfoma.</li>
</ol>
5. Geração de esferoides híbridos usando pinças ópticas
<ol>
	<li>Remova cuidadosamente um único esferóide estromal de um poço do molde de agarose com uma ponta de pipeta (100-1000 μL) e coloque-o em um prato de fundo de vidro de microscopia de 35 mm.</li>
	<li>Adicionar 2 ml de meio de cultura RPMI e incubar durante 10 min a 37 °C em condições normais. Durante esse tempo, o esferóide grudará suavemente no vidro, o que impede o movimento durante a manipulação.</li>
	<li>Coloque o prato contendo o esferóide no microscópio stage e estabilize o prato no microscópico stage com os suportes.</li>
	<li>Adicione cuidadosamente 100 μL de solução de células de linfoma a uma densidade final de 1 x 104 células/mL (etapa 3.5). Deixe-os afundar no fundo do prato por aproximadamente 5 min.</li>
	<li>Usando os movimentos do estágio do microscópio, encontre uma célula de linfoma flutuante. Permita que a armadilha óptica atinja a célula selecionada clicando no cursor da armadilha na tela. Uma vez que a célula esteja presa e móvel, mova o estágio do microscópio para colocar a célula em contato com a superfície esferóide estromal.</li>
	<li>Comece anexando a célula do linfoma à superfície do esferóide estromal por 10 s. Em seguida, verifique se a célula está permanentemente ligada com três tentativas repetidas de desprender a célula do linfoma usando a pinça óptica.</li>
	<li>Se o contato celular for interrompido, prenda a célula do linfoma à superfície do esferóide mais uma vez usando a armadilha óptica; no entanto, desta vez por um período de tempo mais longo, aproximadamente 20 s. NOTA: É essencial determinar intervalos de tempo específicos para captura de célula única para cada linha celular separadamente. Em manipulações preliminares, foi estabelecido que as células de linfoma da linhagem celular Ri-1 exibem uma forte propriedade adesiva aos esferoides estromais, fixando-se predominantemente em 10-20 s à sua superfície. Assim, os intervalos de tempo de contato específicos para o aprisionamento de células Ri-1 únicas foram de 10, 20 e 30 s. Devido à natureza demorada do procedimento, recomenda-se o uso de linhagens celulares com um tempo mínimo de adesão não superior a 30 s para a formação de esferóides com pinças ópticas.</li>
	<li>Repita o procedimento com células de linfoma subsequentes até que toda a superfície do esferóide estromal seja coberta por células de linfoma.</li>
	<li>Para cobrir uniformemente a superfície disponível do esferóide estromal com células de linfoma, é necessário alterar a posição da armadilha óptica no volume da amostra microscópica. Ao alterar o plano de imagem usando o parafuso micrométrico do microscópio, pode-se alterar a posição da armadilha óptica, o que permite um movimento mais profundo dos objetos presos na amostra.</li>
	<li>Para melhor representar o esferóide formado espontaneamente, cubra o núcleo das células estromais com 2-3 camadas de células de linfoma.</li>
	<li>Transferir a placa com fundo de vidro que contém o esferóide para uma incubadora durante 1 h de incubação em condições normais. NOTA: O esferóide híbrido pode ser cultivado a longo prazo em 20 μL de meio RPMI em uma gota suspensa.</li>
</ol>
6. Determinação da viabilidade esferóide
<ol>
	<li>Avalie a viabilidade do esferóide celular usando um kit de coloração vivo/morto (consulte a Tabela de Materiais). Remova suavemente o meio de cultura e lave diretamente o esferóide com 100 μL de 1x PBS.</li>
	<li>Incubar o esferóide em 100 μL de solução 1x PBS contendo 1 μM de calceína-AM e 2 μM de homodímero de etídio-1 por 20 min a 37 ° C.</li>
	<li>Observe os esferóides usando um microscópio de fluorescência (consulte a Tabela de Materiais) e capture as imagens (consulte a Tabela de Materiais). NOTA: Não há necessidade de lavar o esferóide após a coloração. Os níveis de fluorescência de fundo são inerentemente baixos com este ensaio porque os corantes são praticamente não fluorescentes antes de interagir com as células.</li>
	<li>Usando o programa ImageJ (consulte a Tabela de Materiais), determine a viabilidade do esferóide calculando a proporção entre a área corada em verde (células vivas) e a área total corada em vermelho (células mortas) e verde.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&micro;-Prato 35 mm, fundo de vidro alto</td><td>IBIDI</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>12-256 micro-molde 3D PetriDish&nbsp;</td><td>Microtissues Inc., RI, EUA</td><td>12-256TR</td><td></td></tr><tr><td>3 &micro; m microesferas de poliestireno</td><td>Polysciences</td><td>17134-15</td><td></td></tr><tr><td>anti CD20 anticorpo (clone L26)</td><td>Dako</td><td>IS604</td><td></td></tr><tr><td>Contador de Células Automatizado, EVE</td><td>NanoEntek</td><td>EVE/ EVE-MC</td><td></td></tr><tr><td>Autostainer Link 48</td><td>Dako</td><td>D09634</td><td></td></tr><tr><td>Câmera&nbsp;</td><td>Incubadora de CO2 Olympus</td><td>U-TV0.63XC</td><td></td></tr><tr><td>CelCulture</td><td>Esco Technologies, Inc.</td><td></td> Lâminas de Contagem de Células CCL<td></td></tr><tr><td>, EVE</td><td>NanoEntek</td><td>NE-EVS</td><td></td></tr><tr><td>Linha Celular HS-5</td><td>ATCC</td><td>CRL-3611</td><td></td></tr><tr><td>Linha Celular Ri-1&nbsp;</td><td>DSMZ&nbsp;</td><td>ACC 585</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gibco</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Fluorescência&nbsp;</td><td>Programa Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td> National <td>Institutes of Health, MD, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reagentes vivos/mortos&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Médio</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloreto de sódio 0,9%, estéril</td><td>Reagentes ITW ReITW, S.R.L.agents, S.R.L.</td><td>A1671</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Azul de Tripano, 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express (1X), sem vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25300096</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td><forte>Configuração de pinças ópticas</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espelhos dicróicos</td><td>Thorlabs</td><td>DMSP805R</td><td></td></tr><tr><td>Câmera digital</td><td>Mikrotron GmbH</td><td>MC1362</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de varredura XY de espelho Galvano</td><td>Thorlabs</td><td>GVS002</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido&nbsp;</td><td>Lente Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>1</td><td>Lente Thorlabs</td><td>AC254-050-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>2</td><td>Lente Thorlabs</td><td>AC508-200-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG 1064 nm laser</td><td>Laser Quantum</td><td>Ventus</td><td></td></tr></tbody></table>

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