Análise por citometria de massa das respostas imunes sistêmicas e locais no carcinoma hepatocelular

A citometria de massa nos permite analisar as respostas imunes sistemáticas e locais no carcinoma hepatocelular. Ao traçar o perfil das células imunes no nível de uma única célula, identificamos subconjuntos únicos e os estados funcionais ligados à progressão do tumor, oferecendo insights sobre os mecanismos de evasão imunológica e os potenciais alvos terapêuticos para tratamentos personalizados. Nosso protocolo usa citometria de massa para analisar mais de 14 marcadores simultaneamente no nível de célula única, evitando a sobreposição espectral observada na citometria de fluxo tradicional. Isso envolve a identificação precisa de populações de células reais e fornece dados de alta dimensão para perfis imunológicos detalhados e a descoberta de biomarcadores.

[Narrador] Para começar, descongele as suspensões de células mononucleares congeladas do sangue periférico e das células do hepatocarcinoma. Após a recuperação celular, ressuspenda as células em um mililitro de PBS sem cálcio e magnésio. Adicione cisplatina a uma concentração final de 0,5 micromolar, misture bem e incube em temperatura ambiente por dois minutos. Para interromper a reação, centrifugue os tubos a 500 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e adicione um mililitro de tampão de coloração celular a cada tubo. Depois de centrifugar novamente, descarte cuidadosamente o sobrenadante. Para realizar o bloqueio do receptor FC, primeiro prepare uma mistura de blocos de 50 microlitros para cada amostra, combine 48 microlitros de tampão de coloração celular com dois microlitros de solução de bloqueio de FC. Ressuspenda o pellet celular na mistura de blocos e incuba. Em seguida, adicione 1,1 microlitros de cada anticorpo por amostra em um tubo marcado para preparar a mistura de anticorpos da proteína de membrana. Aumente o volume para 55 microlitros com tampão de coloração celular. Transfira 50 microlitros da mistura de anticorpos preparada para cada tubo de amostra, elevando o volume total para 100 microlitros. Em seguida, gire suavemente as amostras para misturar antes de incubar em temperatura ambiente por 15 minutos. Adicione um mililitro de tampão de coloração celular a cada tubo de amostra. Centrifugar a 500 g durante cinco minutos à temperatura ambiente e rejeitar o sobrenadante. Após a lavagem final, subtraia brevemente o líquido restante com o pellet celular para ressuspender completamente as células. Para coloração de proteínas do núcleo, adicione 500 microlitros da solução de fixação mista às células ressuspensas. Misture delicadamente as amostras antes de incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação, centrifugue a 500 G durante cinco minutos à temperatura ambiente e elimine o sobrenadante. Em seguida, pipete 1000 microlitros de tampão de permeabilização para cada tubo para lavar as células. Em seguida, centrifugue os tubos a 1000 g por cinco minutos à temperatura ambiente. Adicione 50 microlitros da mistura de anticorpos em cada tubo após descartar o sobrenadante. Pipete suavemente as células para misturar bem antes de incubar. Em seguida, pipete 1000 microlitros de tampão de permeabilização para cada tubo, centrifugue novamente e descarte o sobrenadante. Para fixar as células, adicione um mililitro de formaldeído a 1,6% preparado em PBS em cada tubo de amostra e vórtice para misturar bem o conteúdo. Depois de incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos, centrifugar as amostras e rejeitar o sobrenadante. Para coloração de intercalação nuclear, primeiro dilua o Cell-ID Intercalator Iridium com correção e tampão de permeabilização. Pipetar um mililitro da solução de intercalação em cada amostra. Misture delicadamente e vortex. Coloque as amostras a quatro graus Celsius durante a noite e centrifugue como antes. Quando a incubação estiver completa, pipete 1000 microlitros de tampão de coloração celular no tubo. Centrifugar os tubos a 800 G durante cinco minutos e rejeitar o sobrenadante. Finalmente, ressuspenda as células em 450 a 900 microlitros de água deionizada. Manchar as células com azul de tripano para contagem de células antes de uma análise mais aprofundada. Para começar, ligue o citômetro de massa e inicie o programa. Analise as amostras no sistema CyTOF e adquira os dados citométricos de massa das células mononucleares do sangue periférico e das amostras de células do hepatocarcinoma. Inicie o software de processamento de dados no instrumento e pré-processe a população de células CD45+ no arquivo FCS. Em seguida, elimine as células mortas usando coloração de viabilidade, como exclusão de cisplatina. Gate a população CD45 + para se concentrar em células imunológicas e exportar a população fechada para análise posterior. Transforme os dados com um cofator de cinco. Em seguida, inicie o software de clustering e identifique os principais clusters com base no algoritmo SPADE, agrupando células com perfis de expressão de marcadores semelhantes em clusters. Aplique a incorporação hierárquica de vizinhos estocásticos, ou HSNE, para redução de dimensionalidade e identificação de clusters distintos. Em seguida, use o pacote do kit CyTOF em nosso software para realizar o reagrupamento dos principais clusters. Use o programa PhenoGraph para identificar subclusters com parâmetros padrão. Um total de 14 tipos distintos de células foram identificados nas amostras de células mononucleares do sangue periférico. Os padrões de expressão de marcadores para cada um dos 14 tipos de células foram detalhados no mapa de calor, mostrando perfis de expressão únicos para populações de células distintas. A distribuição desses tipos de células variou entre as amostras, com a amostra D apresentando uma proporção maior de células T CD4, as amostras A e B mostrando enriquecimento significativo de células B e CD141+, células dendríticas convencionais, predominantemente presentes na amostra C. Oito tipos de células foram identificados nas amostras de tecido, incluindo monócitos, células T, neutrófilos, células natural killer, Células B, células dendríticas plasmocitoides, eosinófilos e células dendríticas mieloides. Os perfis de expressão de marcadores para os tipos de células teciduais indicam padrões distintos para cada população de células. As amostras de tecido mostraram uma proporção consistente de tipos de células em todos os pacientes, refletindo características imunológicas compartilhadas com o carcinoma hepatocelular.