Isolamento de microrganismos do solo usando a tecnologia iChip

Estamos tentando descobrir novos tipos de química para combater patógenos agrícolas. Usando a tecnologia iChip, isolamos novos organismos, que esperamos que levem a uma nova química. Testar esses organismos e/ou seus produtos naturais contra patógenos agrícolas potencialmente leva à descoberta de novos organismos e/ou compostos candidatos a biopesticidas.

O método iChip nos permite isolar microrganismos que não são cultiváveis em condições convencionais, proporcionando um período de domesticação e contato com seu ambiente natural. Nossa construção iChip modificada é simples, barata e reduz o risco de contaminação microbiana, tornando-a facilmente acessível para uma variedade de objetivos de pesquisa. Nossos resultados do iChip abrem questões como quais mecanismos impulsionam a supressão de patógenos por novos micróbios?

Esses compostos bioativos podem ter um desempenho confiável em testes do mundo real? Como os fatores ambientais influenciam sua eficácia? Abordar essas questões orientará o desenvolvimento sustentável de biopesticidas, transformando o manejo de doenças de plantas e reduzindo a dependência de fungicidas sintéticos.

O laboratório aplicará a tecnologia iChip para isolar novas bactérias de solos supressores de doenças produzidos por meio de culturas de cobertura, identificando novos micróbios e compostos bioativos. Estes serão testados em estudos controlados de doenças de plantas para desenvolver alternativas inovadoras e sustentáveis aos fungicidas sintéticos para o manejo de doenças agrícolas. Para construir um iChip modificado usando uma ferramenta de perfuração de ágar de 5 milímetros, remova o fundo dos poços de uma placa de 96 poços.

Corte membranas de policarbonato de 0,05 micrômetro em retângulos, garantindo que as dimensões correspondam à área inferior de uma placa de 96 poços. Aplique um selante de silicone para aderir a membrana de policarbonato ao fundo da placa de 96 poços. Certifique-se de que o adesivo vede os poços, mas não cobre totalmente as aberturas dos poços.

Deixe as placas secarem por 24 horas. Adicione 4,5 mililitros de água estéril a cada um dos tubos de centrífuga de 15 mililitros rotulados de A a D e a cada um dos tubos de 50 mililitros rotulados de E a H. Adicione 1 grama de solo em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Em seguida, adicione 10 mililitros de água ao tubo e vortex a mistura por 10 minutos.

Deixe a suspensão do solo assentar por 10 minutos. Em seguida, pipete 0,5 mililitros do sobrenadante do solo no tubo A e misture bem. Agora, transfira 0,5 mililitros da suspensão celular do tubo A para o tubo B e misture bem.

Repita para todos os tubos de centrífuga restantes, completando uma série de diluições dez vezes nos oito tubos. Para começar, mergulhe os iChips completamente em 95% de etanol. Após 15 minutos, retire as placas do etanol e coloque-as sobre uma toalha de papel estéril na capela de fluxo laminar.

Deixe o etanol evaporar enquanto liga o esterilizador ultravioleta na capela de fluxo laminar por 15 minutos. Pipete 360 microlitros de sais mínimos de succinato estéril ou meio SMS na primeira coluna da placa para servir como controle. Adicione 45 mililitros de SMS à suspensão celular no tubo E.Misture bem para combinar a suspensão celular com o ágar.

Pipete 360 microlitros da mistura de células de ágar em todos os poços restantes da placa de 96 poços. Assim que a mídia estiver definida, sele a parte superior da placa com uma tampa de placa PCR. Encher as placas com os tubos F, G e H para preparar um total de quatro placas com diferenças de concentração dez vezes maiores.

Coloque as placas em um recipiente contendo aproximadamente 1 polegada de solo com o lado da membrana voltado para baixo. Incube as placas dentro do recipiente coberto no escuro a 25 graus Celsius. Após seis semanas, examine os iChips quanto ao crescimento microbiano.

Enxágue o iChip modificado três vezes com água estéril para remover todas as partículas de sujeira. Limpe a parte superior e as laterais da placa com etanol a 95%, evitando o lado com a membrana semipermeável. Usando uma lâmina estéril, corte a tampa da placa ao redor de um poço contendo uma colônia e remova o quadrado com uma pinça estéril.

Usando uma ferramenta de estrias estéreis, perfure a colônia e listre na placa de ágar SMS com o método de quatro quadrantes. Incube as placas a 25 graus Celsius por uma semana ou até que o crescimento da colônia seja observado. Após a incubação, examine as colônias para confirmar o isolamento das culturas.