Name: Isolamento de microrganismos do solo usando a tecnologia iChip (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Aprenda o método iChip para isolar microrganismos do solo não cultiváveis em condições convencionais. Esta técnica simples e acessível permite descobrir novas espécies com potencial aplicação como biopesticidas sustentáveis.

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<meta charset="utf8"></head><body>Método iChip avançado para cultura de novos microrganismos

<ol><li>Newman, D. J., Cragg, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+products+as+sources+of+new+drugs+over+the+nearly+four+decades+from+01%2F1981+to+09%2F2019%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nat+Prod%22%5BJournal%5D)">Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019.</a> J Nat Prod. 83 (3), 770-803 (2020).</li>
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<li>Vitorino, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopirellula+aestuarii+sp.+Nov.%2C+a+novel+member+of+the+genus+rhodopirellula+isolated+from+brackish+sediments+collected+in+the+tagus+river+estuary%2C+Portugal%5BTitle%5D)+AND+%22Syst+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rhodopirellula aestuarii sp. Nov., a novel member of the genus rhodopirellula isolated from brackish sediments collected in the tagus river estuary, Portugal.</a> Syst Appl Microbiol. 45 (6), 126360(2022).</li>
<li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hanstruepera+marina+sp.+Nov.+and+Hanstruepera+flava+sp.+Nov.%2C+two+novel+species+in+the+family+flavobacteriaceae+isolated+by+a+modified+in+situ+cultivation+technique+from+marine+sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hanstruepera marina sp. Nov. and Hanstruepera flava sp. Nov., two novel species in the family flavobacteriaceae isolated by a modified in situ cultivation technique from marine sediment.</a> Front Microbiol. 13, 957397(2022).</li>
<li>Ling, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+antibiotic+kills+pathogens+without+detectable+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance.</a> Nature. 517 (7535), 455-459 (2015).</li>
<li>Qi, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+synthesis%2C+and+optimization+of+teixobactin%2C+a+novel+antibiotic+without+detectable+bacterial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Discovery, synthesis, and optimization of teixobactin, a novel antibiotic without detectable bacterial resistance.</a> J Pept Sci. 28 (11), e3428(2022).</li>
<li>Piddock, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teixobactin%2C+the+first+of+a+new+class+of+antibiotics+discovered+by+ichip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Teixobactin, the first of a new class of antibiotics discovered by ichip technology.</a> J of Antimicrob Chemother. 70 (10), 2679-2680 (2015).</li>
<li>Gong, L., Wong, C. H., Idol, J., Ngan, C. Y., Wei, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-long+read+sequencing+for+whole+genomic+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ultra-long read sequencing for whole genomic DNA analysis.</a> J Vis Exp. (145), e58954(2019).</li>
<li>Covington, B. C., Xu, F., Seyedsayamdost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+natural+product+chemist%27s+guide+to+unlocking+silent+biosynthetic+gene+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">A natural product chemist's guide to unlocking silent biosynthetic gene clusters.</a> Annu Rev Biochem. 90, 763-788 (2021).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,1-20 &micro; Ponteiras de pipeta L</td><td>VWR</td><td>76322-158</td><td>Pacote de 768</td></tr><tr><td>tubos PCR de 0,2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0337</td><td>Caixa de 1000</td></tr><tr><td>pipetas monocanal de 0,5-5 mL</td><td>VWR</td><td>CA11020-004</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro de 1 L</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS13951L</td><td>Deve ser autoclavável.&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de Petri de 100 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>Caixa de 500</td></tr><tr><td>selantes 100% silicone</td><td>Marineland</td><td>31003</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L ponteiras de pipeta multicanal</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>9401113</td><td>Caixa de 960</td></tr><tr><td>100-1000 &micro; Ponteiras de pipeta L</td><td>VWR</td><td>76322-164</td><td>Pacote de 768</td></tr><tr><td>100-1000 &micro; L pipeta monocanal</td><td>VWR</td><td>76169-240</td><td></td></tr><tr><td>100-1200 &micro; L pipeta multicanal</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46300800</td><td>Deve ter 360 &micro; L capacidade de volume.&nbsp;</td></tr><tr><td>1-10 &micro; L pipeta monocanal</td><td>VWR</td><td>76169-232</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta de 1-5 mL</td><td>VWR</td><td>CA11020-008</td><td>Pacote de 500</td></tr><tr><td>tubos de centrífuga estéreis de 15 mL</td><td>VWR</td><td>CA21008-918</td><td>Caixa de 500</td></tr><tr><td>primer rRNA-F de 16s (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) &ndash; 10mM</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>51-01-19-06</td><td>10 &micro; g</td></tr><tr><td>16s rRNA-R primer (ACGGCTACCTTGTTACGACTT) &ndash; 10mM</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>51-01-19-07</td><td>10 &micro; g</td></tr><tr><td>Broca de cortiça de 4 mm</td><td>VWR</td><td>470121-860</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga estéreis de 50 mL</td><td>VWR</td><td>CA21008-940</td><td>Caixa de 500</td></tr><tr><td>etanol a 95%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A412-500</td><td>Placa de 500 mL</td></tr><tr><td>com 96 poços</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>Caixa de 100</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Cole-Parmer</td><td>UZ-01850-34</td><td>8 L, 115 VAC</td></tr><tr><td>Ágar bacteriológico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>443570010</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>recipiente</td><td>Thomas Scientific</td><td>1216H91</td><td>5 recipientes por embalagem</td></tr><tr><td>Casamino ácidos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>223120</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Caseína digest</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>211610</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Eletrofluorese grau agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J66501.30</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Sistema de Imagem iBright FL1500</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A44115</td><td></td></tr><tr><td>Capa de fluxo laminar</td> Sequenciador de nanoporos <td>Minion CleanTech</td><td>1000-6-A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>MinIon Mk1C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One/One Microvolume UV-Vis Espectrofotômetro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Água Livre de Nuclease</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9937</td><td>10 x 50 mL</td></tr><tr><td>Nucleobond HMW DNA kit</td><td>Takara</td><td>740160.2</td><td></td></tr><tr><td>Toalha de papel</td><td>VWR</td><td>89402-824</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Green Hot Start II PCR de alta fidelidade Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F566L</td><td>500 reações</td></tr><tr><td>Amido de batata</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>419690025</td><td>2,5 kg</td></tr><tr><td>QIAGEN CLC Genomics Workbench Software ou similar</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rapid Barcoding 24 Kit</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-RBK114.24</td><td></td></tr><tr><td>Ciclador térmico SimpliAmp</td>Lâminas de inoculação estéreis <td>A24811</td><td></td>da <td>Applied Biosystems</td></tr><tr><td>com agulha</td><td>VVWR</td><td>76534-512</td><td>Caixa de 1000</td></tr><tr><td>lâminas cirúrgicas estéreis</td><td>VWR</td><td>76457-444</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe, ou similar&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33101</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>76549-928</td><td>Deve acomodar tubos de centrífuga de 15 e 50 mL</td></tr><tr><td>VWR Microscópio Trinocular Stereo Zoom</td><td>VWR</td><td>89404-476</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp; Nuclepore&nbsp; Membranas Gravadas em Trilho</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA113502</td><td>L x W 8&nbsp; em. x 10&nbsp; pol., tamanho do poro 0,03&nbsp; &mu; m</td></tr></tbody></table>

isolamento de microrganismos do solo usando a tecnologia ichip

Isolation of Soil Microorganisms Using iChip Technology

Uma visão geral do protocolo é mostrada na Figura 1. Um experimento iChip modificado bem-sucedido resulta em pelo menos uma placa contendo crescimento em menos de 25% dos poços, sem que ocorra crescimento nos poços de controle. Esse número de poços com crescimento geralmente garante que colônias únicas sejam isoladas em poços. Além disso, o número de colônias, ou o número de poços contendo colônias, deve diminuir dez vezes com cada placa subsequente preparada a partir da série de diluições. Os resultados representativos são mostrados na Figura 2. onde as placas 7 e 8 são iChips bem-sucedidos, pois contêm crescimento em menos de 25% dos poços, e a porcentagem de poços contendo colônias diminui a cada placa, conforme mostrado na Tabela 1. Se todas as placas em um teste contiverem mais de uma colônia por poço ou nenhuma colônia em nenhum poço, isso constitui um resultado negativo.
<img alt="Fluxo de trabalho de isolamento microbiano; placas revestidas de silicone, tubos de centrífuga, pipetagem, cultura." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67426/67426fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Visão geral esquemática do uso de um iChip modificado para cultivar micróbios do solo. (A,B) Construção da placa (Etapa 2). (C) Preparação do inóculo (Etapa 3). (D,E) Configuração do iChip (Etapa 4). (F) Incubação do iChip (Etapa 5). (G-I) Transferência dos isolados para meios convencionais (Etapa 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67426/67426fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ichip</td>
			<td>Concentração de solo em suspensão de ágar</td>
			<td>Poços com colônias</td>
			<td>Unidades Formadoras de Colônias</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E</td>
			<td>5,0 x 10-6 g/mL</td>
			<td>Todo</td>
			<td>Muitos para contar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td>5,0 x 10-7 g/mL</td>
			<td>Todo</td>
			<td>Muitos para contar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td>5,0 x 10-8 g/mL</td>
			<td>22</td>
			<td>22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td>5,0 x 10-9 g/mL</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Dados representativos de um experimento iChip bem-sucedido em que o número de poços contendo colônias diminui a cada diluição em série.
<img alt="Diagramas de ensaio de microplacas; Layout experimental para análise bioquímica utilizando placas multipoços." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67426/67426fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Resultados exemplares de dois iChips modificados com sucesso. Os iChips foram do mesmo experimento em que (A) a placa preparada a partir da mistura célula-ágar G contém 22 colônias e (B) a placa preparada a partir da mistura célula-ágar H contém seis colônias, consistente com a diferença de diluição de 10 vezes entre as misturas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67426/67426fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Pode-se visualizar colônias a olho nu ou microscopia, como mostrado na Figura 3A-G. As colônias podem estar crescendo na superfície do ágar, como visto na Figura 3B ou embutidas no ágar, como a colônia na Figura 3F. Pode haver casos em que existem duas colônias no mesmo poço em um iChip modificado bem-sucedido, como na Figura 3G. Em alguns casos, as colônias estão distantes o suficiente para que possam ser perfuradas com uma agulha separadamente e subcultivadas; no entanto, é improvável que aqueles na Figura 3G possam ser facilmente cultivados como microrganismos axênicos. Exemplos de colônias transferidas do iChip para mídia SMS convencional são mostrados na Figura 4.
<img alt="Experimento em placa de Petri analisando o crescimento bacteriano em cultura; Colônias de realce de imagem de microscópio." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67426/67426fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Visão microscópica representativa das colônias crescendo em um iChip após 6 semanas de incubação. (AF) Colônias únicas são observadas, que devem ser subcultivadas, e em (G) duas colônias são observadas em estreita proximidade, que são difíceis de obter como culturas axênicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67426/67426fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Crescimento de colônias bacterianas em placa de ágar, experimento de microbiologia, análise de placa de Petri." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67426/67426fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Resultado representativo de uma bactéria isolada do iChip modificado uma vez crescendo em uma placa de ágar SMS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67426/67426fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A capacidade de isolar colônias do iChip modificado em placas de ágar convencionais também determina o sucesso do experimento. Nem todas as colônias que crescem no iChip modificado sobreviverão à transferência para placas convencionais. Em um iChip, as colônias são expostas a fatores de crescimento e nutrientes do solo, aumentando sua capacidade de cultivo. Para alguns microrganismos, um período de domesticação não é suficiente para torná-los cultiváveis em condições convencionais. A taxa de recuperação de colônias de um iChip para placas varia de experimento para experimento, mas algumas devem crescer em placas, pois esse método também cultiva microrganismos facilmente cultiváveis. Por exemplo, os iChips modificados na Figura 2 continham 28 colônias no total, e o número de colônias que cresceram em placas de ágar após a subcultura foi de 16, enquanto 12 não sobreviveram à transferência. Os isolados podem ser identificados e usados para estudos posteriores, uma vez cultivados em placas de ágar de tamanho normal, conforme mostrado na Figura 4.
Um experimento iChip modificado bem-sucedido deve resultar no isolamento de microrganismos que diferem de microrganismos conhecidos no nível da espécie. O grau de similaridade de cada isolado com microrganismos conhecidos é encontrado comparando-se o DNA isolado com os genomas de microrganismos conhecidos. Os escores tetra Z dos microrganismos relacionados mais próximos de cada isolado descrevem a porcentagem de similaridade. A Figura 5 mostra que das doze bactérias isoladas, quatro eram novas espécies ou mais, duas provavelmente eram novas cepas e seis eram microrganismos conhecidos. A recuperação de várias novas espécies ou cepas é consistente com experimentos iChip publicados anteriormente, indicando que esta construção modificada do iChip não impede o aumento na recuperação de novas espécies11.
<img alt="Gráfico de pizza de análise de novidade taxonômica; 6 espécies conhecidas, 2 possíveis, 4 novas espécies de isolados de ichip." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67426/67426fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: O nível de classificação taxonômica dos isolados recuperados de um experimento iChip. A similaridade percentual foi determinada com base nos escores tetra Z, que descrevem a semelhança dos isolados com bactérias conhecidas, onde &gt;99,9% de similaridade indica uma correspondência de espécie, 98,9%-99,9% de similaridade indica uma possível nova espécie e &lt;98,9% de similaridade indica uma nova espécie ou superior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67426/67426fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Isolamento de microrganismos do solo usando a tecnologia iChip

The iChip isolation technique uses an in-situ isolation device that increases the cultivability of previously unculturable microorganisms. Microorganisms ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Isotachophoresis (ITP) é uma separação eletrocinética robusto e técnica de pré-concentração com aplicações que vão desde a detecção da toxina da preparação da amostra. Revemos os princípios físicos de ITP ea metodologia de aplicar esta técnica para dois exemplos de aplicações específicas: separação e detecção de moléculas pequenas e purificação de ácidos nucleicos a partir de lisados ​​de cultura de células.

On-chip Isotachophoresis para separação dos íons e purificação de ácidos nucléicos

Filmes plásticos rotulados como "biodegradável" estão disponíveis comercialmente para uso agrícola como coberturas. Preparo representa um método de eliminação atraente, mas a degradação sob condições de campo é mal compreendida. O objetivo deste estudo foi desenvolver métodos para isolar fungos de solo nativo e bactérias que colonizam filmes mulch plástico após o enterro de campo.

Isolamento de microrganismos do solo nativas com potencial para romper as biodegradáveis ​​Palha filmes plásticos usados ​​na agricultura

As bactérias produzem compostos secretados que têm o potencial de afetar a fisiologia de seus vizinhos microbianas. Aqui nós descrevemos uma tela de co-cultura, que permite a detecção de tais quimicamente mediadas entre espécies interações misturando os micróbios do solo com cepas repórter transcrição fluorescentes de Bacillus subtilis em meios sólidos.

Usando Coculture detectar quimicamente mediada interespécies Interações

Colônias fúngicas entomopatômicas são isoladas de amostras de solo tropical usando isca tenebrio , isca de Galleria , bem como meio artificial seletivo, ou seja, ágar de dextrose de batata enriquecido com extrato de levedura suplementado com clorofenicol, tiaabzolendae e ciclohexmida (meio CTC).

Comparação de métodos para isolar fungos entomopatômicos de amostras de solo

Este protocolo é um método eficaz e rápido de cultivo de leveduras e o molde Aspergillus fumigatus de grandes conjuntos de amostras de solo em apenas 7 dias. Os métodos podem ser facilmente modificados para acomodar uma gama de mídias de incubação e temperaturas conforme necessário para experimentos.

Isolamento de Leveduras culturais e moldes de solos para investigar estrutura populacional fúngica

Aqui, apresentamos um protocolo de triagem da biodiversidade do solo para procurar cepas fúngicas envolvidas na degradação de materiais recalcitrantes. Primeiro, as cepas fúngicas capazes de crescer em ácidos húlicos ou lignocelulose são isoladas. Sua atividade é então testada tanto em ensaios enzimáticos quanto em poluentes como hidrocarbonetos e plásticos.

Isolamento e Triagem da Biodiversidade do Solo para Fungos Envolvidos na Degradação de Materiais Recalcitrantes

Este protocolo descreve o projeto e o uso de um chip de isolamento (iChip) para o cultivo in situ de micróbios recalcitrantes do solo em seu ambiente natural. Também descreve o cultivo in situ de bactérias do solo produtoras de antimicrobianos. O protocolo pode ser adaptado para recuperar bactérias de diversos nichos com outras propriedades desejáveis.

In situ Isolamento e Cultura de Bactérias Recalcitrantes do Solo usando um Chip de Isolamento (iChip)

Este manuscrito descreve uma abordagem para isolar RNPs cognatos selecionados formados em células eucarióticas por meio de um enriquecimento direcionado a oligonucleotídeos específicos. Demonstramos a aplicabilidade dessa abordagem isolando um RNP cognato ligado à região retroviral 5' não traduzida que é composta por DHX9/RNA helicase A.

Isolamento de complexos de ARN-proteína a partir de células Cognate usando eluição Oligonucleotide-directed

Como as mitocôndrias são apenas uma pequena percentagem da célula vegetal, eles precisam ser purificado para uma gama de estudos. Mitocôndrias podem ser isoladas em uma variedade de órgãos da planta por homogeneização, seguida de centrifugação gradiente diferencial e densidade para obter uma fração mitocondrial altamente purificada.

Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana

Aqui, apresentamos um protocolo para obter dados de três cores de smFRET e sua análise com um ensemble 3D Hidden Markov modelo. Com esta abordagem, cientistas podem extrair informações cinéticas de sistemas complexos proteína, incluindo cooperatividade ou interações correlacionadas.

Usando três cores único-molécula FRET para estudar a correlação de interações da proteína

Aprenda o método iChip para isolar microrganismos do solo não cultiváveis em condições convencionais. Esta técnica simples e acessível permite descobrir novas espécies com potencial aplicação como biopesticidas sustentáveis.

Isolamento de microrganismos do solo usando a tecnologia iChip

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