Name: Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprenda a visualizar pericitos vasculares retinianos em camundongos usando imunocoloração 3D. Este método combina injeção retro-orbital, clareamento tecidual e microscopia confocal para análise espacial detalhada.

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<meta charset="utf8"></head><body>Visualização de pericitos retinianos usando limpeza de tecidos e marcação fluorescente

<ol><li>Dreisig, K., Blixt, F. W., Warfvinge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+cryo-sections%2C+whole-mounts%2C+and+hypotonic+isolated+vasculature+preparations+for+immunohistochemical+visualization+of+microvascular+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes.</a> J Vis Exp. (140), e57733(2018).</li>
<li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> J Vis Exp. (77), e50546(2013).</li>
<li>Park, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+roles+of+pericytes+in+the+blood-retinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier.</a> Nat Commun. 8, 15296(2017).</li>
<li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (8), 2795-2806 (2004).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+New+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights.</a> Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).</li>
<li>Hutter-Schmid, B., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor+receptor-beta+is+differentially+regulated+in+primary+mouse+pericytes+and+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor receptor-beta is differentially regulated in primary mouse pericytes and brain slices.</a> Curr Neurovasc Res. 13 (2), 127-134 (2016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstrating+hairy+and+glabrous+skin+innervation+in+a+3d+pattern+using+multiple+fluorescent+staining+and+tissue+clearing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches.</a> J Vis Exp. (183), e63807(2022).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> J Vis Exp. (167), e61742(2021).</li>
<li>Batista, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normative+mice+retinal+thickness%3A+16-month+longitudinal+characterization+of+wild-type+mice+and+changes+in+a+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Normative mice retinal thickness: 16-month longitudinal characterization of wild-type mice and changes in a model of Alzheimer's disease.</a> Front Aging Neurosci. 15, 1161847(2023).</li>
<li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte-endothelial+interactions+in+the+retinal+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Pericyte-endothelial interactions in the retinal microvasculature.</a> Int J Mol Sci. 21 (19), 7413(2020).</li>
<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+delivery+of+an+anti-angiogenic+peptide+inhibits+pathological+retinal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated delivery of an anti-angiogenic peptide inhibits pathological retinal angiogenesis.</a> Theranostics. 11 (11), 5107-5126 (2021).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injection+of+fitc-dextran+is+an+effective+and+economical+method+for+observing+mouse+retinal+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels.</a> Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).</li>
<li>Riew, T. R., Jin, X., Kim, S., Kim, H. L., Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics+of+cells+expressing+ng2+and+platelet-derived+growth+factor+receptor-%CE%B2+in+the+fibrotic+scar+formation+after+3-nitropropionic+acid-induced+acute+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics of cells expressing ng2 and platelet-derived growth factor receptor-β in the fibrotic scar formation after 3-nitropropionic acid-induced acute brain injury.</a> Cell Tissue Res. 385 (3), 539-555 (2021).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+cubic+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced cubic protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubic+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cubic protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> J Vis Exp. (114), e54401(2016).</li>
<li>Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging the retinal vasculature.</a> Annu Rev Vis Sci. 7, 129-153 (2021).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+clarity+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced clarity for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nat Neurosci. 22 (2), 317-327 (2019).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Alarcon-Martinez, L., Yemisci, M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+morphology+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Pericyte morphology and function.</a> Histol Histopathol. 36 (6), 633-643 (2021).</li>
<li>Dessalles, C. A., Babataheri, A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+mechanics+and+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Pericyte mechanics and mechanobiology.</a> J Cell Sci. 134 (6), jcs240226(2021).</li>
<li>Alarcon-Martinez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+dysfunction+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Neurovascular dysfunction in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 97, 101217(2023).</li>
<li>Uemura, M. T., Maki, T., Ihara, M., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+microvascular+pericytes+in+vascular+cognitive+impairment+and+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Brain microvascular pericytes in vascular cognitive impairment and dementia.</a> Front Aging Neurosci. 12, 80(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td>Proteger da luz</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 burro anti-cabra IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>Proteger da luz</td></tr><tr><td>C57BL/6 rato</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.</td><td>SCXK (Jing) 2021-0006</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-PDGFR-&beta;</td><td>Pesquisa e Desenvolvimento</td><td>AF1042</td><td>25 &micro; g&nbsp;</td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Oxford Instruments</td><td>v.9.0.1</td><td></td></tr><tr><td>Lycopersicon esculentum(Tomato) lectina, DyLight594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L32471</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Soro de burro normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Scanner panorâmico de fatias de tecido</td><td>Olympus</td><td>VS120-S6-W</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop e&nbsp; Ilustração</td><td>Adobe</td><td>CS6</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.52 Solução</td><td>SunJin Lab</td><td>RC152001</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Placa de seis poços</td><td>Tesoura de mola Costar</td><td>3335</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Ferramentas de Fine Science</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus lâmina de microscópio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td>25 mm x 75 mm x 1 mm</td></tr></tbody></table>

visualização 3d de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração 

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining

Das vistas externas da retina de montagem total, a transparência do tecido da retina de montagem total foi aumentada usando o tratamento de limpeza de tecido em comparação com a da retina sem limpeza de tecido (Figura 1).
Para o exame histológico da retina de montagem total, a vasculatura retiniana foi marcada em vermelho com lectina fluorescente de tomate por meio da injeção retro-orbital, e os pericitos retinianos são mostrados em verde com PDGFR-β (Figura 2, Figura 3 e Figura 4). Embora essa marcação pudesse ser observada na amostra antes e depois da limpeza do tecido, como comparação, o ruído de fundo da amostra da retina foi reduzido pelo tratamento de limpeza do tecido (Figura 2). O tratamento também tornou os pericitos e a vasculatura da retina marcados mais claros sob o scanner panorâmico de corte de tecido (Figura 2) e o microscópio confocal de varredura a laser (Figura 3).
A distribuição gradativa dos pericitos retinianos também é demonstrada aqui ao longo da árvore vascular da retina (Figura 3). Da parte central da retina até sua região periférica, os pericitos estão localizados na membrana basal da vasculatura retiniana, incluindo o tronco e ramos vasculares e os capilares (Figura 3).
Com base na observação acima, a correlação espacial dos pericitos e da vasculatura retiniana foi avaliada com as imagens de pilha Z mais ampliadas da amostra retiniana limpa (Figura 4). Com o auxílio do sistema de processamento de imagem, fornecemos ainda as visualizações 3D para demonstrar que os pericitos estavam firmemente enrolados ao redor da vasculatura retiniana em diferentes diâmetros (Figura 4). A Figura 4A0-D0 representa a ramificação hierárquica dos vasos da retina do mais alto para o mais baixo. Como os pericitos são mais abundantemente distribuídos nos capilares, a coloração PDGFRβ na Figura 4D0 mostra intensidade e sinal mais fortes em comparação com a Figura 4A0-C0.
Em contraste com a retina de camundongos sem tratamento de limpeza de tecidos (Figura 1A, Figura 2A, Figura 3A0-D0), a presente abordagem reduziu efetivamente os sinais de fundo da retina para demonstrar a relação espacial entre pericitos e vasos sanguíneos da retina de montagem total (Figura 1B, Figura 2B, Figura 3A1-D1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67436/67436fig01.jpg"> 
Figura 1: Comparação da transparência óptica de toda a retina de montagem sem e com tratamento de limpeza de tecido. (A, B) As vistas externas de toda a retina de montagem antes (A) e depois (B) do tratamento de limpeza de tecido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67436/67436fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67436/67436fig02.jpg"> 
Figura 2: Comparação das características de marcação dos pericitos e vasculaturas da retina de toda a retina de montagem sem e com tratamento de limpeza de tecido. (A, B) Visualizações de montagem representativas de toda a retina de montagem antes (A) e depois (B) do tratamento de limpeza de tecido foram tiradas sob o Virtual Slide System. A vasculatura está em vermelho (lectina fluorescente do tomate), os pericitos estão em verde (PDGFR-β) e o núcleo celular está em azul (DAPI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67436/67436fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67436/67436fig03.jpg"> 
Figura 3: Comparação da resolução de imagem dos pericitos retinianos gradativamente ao longo da árvore vascular retiniana antes e depois do tratamento de limpeza de tecidos. (A-D) As imagens representativas da retina marcada antes do tratamento de limpeza de tecidos (A0-D0) e após o tratamento de limpeza de tecidos (A1-D1) mostram a distribuição de pericitos ao redor da vasculatura retiniana em ordem de tronco vascular (A0, A1), os ramos de primeira ordem (B0, B1), os ramos de segunda ordem (C0, C1) e o capilar (D0, D1). A vasculatura está em vermelho (lectina fluorescente do tomate), os pericitos estão em verde (PDGFR-β) e o núcleo celular está em azul (DAPI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67436/67436fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67436/67436fig04.jpg"> 
Figura 4: Correlação espacial dos pericitos com a vasculatura retiniana em diferentes diâmetros. (A-D) Imagens representativas de alta resolução da retina marcada ao longo da árvore vascular da retina mostrando a distribuição de pericitos ao redor da vasculatura retiniana em diferentes diâmetros, incluindo tronco vascular (A0, A1), ramos de primeira ordem (B0, B1), ramos de segunda ordem (C0, C1) e capilar (D0, D1). A1-D1: As imagens correspondentes dos painéis A0-D0 foram reconstruídas para mostrar a correlação espacial dos pericitos com a vasculatura retiniana em diferentes diâmetros nas incidências tridimensionais e ainda demonstrar as incidências ampliadas das regiões locais nos painéis A1-D1 (setas) com inserções. A vasculatura está em vermelho (lectina fluorescente do tomate), os pericitos estão em verde (PDGFR-β) e o núcleo celular está em azul (DAPI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67436/67436fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

3d-visualization-retinal-vascular-pericytes-mice

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Fonte: Wang, Z., et al. Imagem in vivo de dois fótons transpupilares da retina de camundongos. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demonstra uma técnica para imagens de retina in vivo usando microscopia de dois fótons. Os camundongos anestesiados são preparados para a imagem prendendo suas cabeças, aplicando lubrificante ocular e colocando uma lamínula sobre o olho. As células ganglionares da retina (RGCs) que expressam proteínas fluorescentes são visualizadas pela primeira vez usando...

Imagem in vivo de dois fótons da retina de camundongos

A retina de murino neonatal fornece um modelo fisiológico bem caracterizado da angiogénese, que permite investigações dos papéis dos diferentes genes ou drogas que modulam a angiogénese...

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

A microscopia intravital pode ser usada em animais para visualizar e medir diâmetros vasculares da retina, velocidades da corrente sanguínea e fluxo sanguíneo total da retina.

Medições de microscopia de vídeo intravital do fluxo sanguíneo retiniano em camundongos

A retina de roedores tem sido reconhecida como uma janela de acesso para o cérebro. Neste documento técnico que proporcionam um protocolo que utiliza o modelo de ratinho de retinopatia induzida por oxigénio para estudar os mecanismos que levam à insuficiência de regeneração vascular dentro do sistema nervoso central após a lesão isquémica. O sistema descrito também pode ser aproveitada para explorar estratégias para promover o crescimento de vasos sanguíneos funcionais dentro da retina e do...

Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

Vamos demonstrar três técnicas de preparação de tecidos diferentes para visualização de imuno-histoquímica de pericitos microvascular da retina do rato, ou seja, crio-seções, todo-montagens e hipotônica isolamento da rede vascular.

Cryo-seções da retina, todo-montagens e hipotônica vasculatura isolada preparações para visualização de imuno-histoquímica de pericitos Microvascular

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia na saúde e na doença. Este protocolo descreve imagens transpupilares da retina de camundongos com um microscópio padrão de dois fótons. Também demonstra diferentes métodos de imagem in vivo para marcar fluorescentemente múltiplas coortes celulares da retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

Este protocolo descreve um método detalhado para a preparação e a coloração da imunofluorescência de montagem e análise plana de retina de camundongos. O uso de fluoresceína fundus angiography (FFA) para filhotes de camundongos e processamento de imagem também são descritos em detalhes.

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Um ensaio para detectar a proteção da vasculatura retiniana contra a morte relacionada ao diabetes em camundongos

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para isolar células gliais de Müller da retina de olhos de camundongos. O protocolo começa com a enucleação e dissecção dos olhos de camundongos, seguida de isolamento, semeadura e cultura de células de Müller.

Isolamento de células primárias de Müller glial da retina de camundongo

Aprenda a visualizar pericitos vasculares retinianos em camundongos usando imunocoloração 3D. Este método combina injeção retro-orbital, clareamento tecidual e microscopia confocal para análise espacial detalhada.

Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração

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