Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração

O escopo desta pesquisa é estudar a morfologia e a distribuição espacial dos parasitas na vasculatura da retina usando técnicas avançadas de imagem. A fim de fornecer uma visão detalhada para demonstrar as características morfológicas dos parasitas, o estudo descreveu uma nova abordagem combinando a injeção retroorbital de agente fluorescente, coloração imunofluorescente e tratamento de limpeza de tecidos para avançar na pesquisa em nosso campo.

Em comparação com o estado de pré-limpeza do tecido retiniano do camundongo, os sinais de fundo dos vasos sanguíneos e parasitas marcados com lactina fluorescente de tomate e PDGFR-beta são significativamente reduzidos após a limpeza do tecido, facilitando uma observação mais precisa de sua relação espacial.

Nossos resultados indicam que essas técnicas são altamente compatíveis para demonstrar os parasitas na vasculatura retiniana em toda a retina montada. A combinação dessas técnicas histológicas é uma abordagem eficaz para visualizar as características morfológicas dos parasitas em detalhes a partir de uma visão tridimensional.

[Instrutor] Para começar, coloque o mouse anestesiado em decúbito lateral direito com a cabeça voltada para a esquerda. Pressione suavemente dois dedos na área periorbital para expor o olho esquerdo do mouse. Usando uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 27, perfure suavemente cerca de dois a três milímetros no seio venoso orbital, garantindo que o chanfro da agulha esteja voltado para a frente em um ângulo de 45 graus. Injete 0,1 mililitros de lactina fluorescente de tomate no seio venoso orbital. Após cinco minutos de injeção retroorbital, eutanasiar o camundongo e usar uma tesoura cirúrgica para abrir a cavidade torácica. Insira uma agulha de calibre 24 dois milímetros no ventrículo cardíaco esquerdo através do ápice do ventrículo esquerdo. Realize a perfusão a uma taxa de três mililitros por minuto com 20 mililitros de solução salina fisiológica a 0,9%, seguida de 20 mililitros de solução salina fisiológica a 4%. Injete 0,1 mililitros de formaldeído a 0,9% em tampão fosfato molar 0,1. Em seguida, coloque o rato sacrificado de lado e remova a pele que cobre os olhos com uma tesoura. Enuclee os olhos com tesoura e fórceps. Corte o nervo óptico e os tecidos circundantes e levante o olho. Transfira o olho para uma placa de 12 poços para fixação em formaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1 molar por duas horas. Após a fixação, crioproteja o olho em sacarose a 25% em tampão fosfato 0,1 molar a quatro graus Celsius até que ele afunde no fundo da solução. Usando uma pipeta pastora de plástico, transfira o olho para uma placa de Petri contendo tampão fosfato 0,1 molar. Perfure a borda da córnea com uma tesoura afiada, corte ao redor da córnea e da íris e descarte-as. Usando uma pinça, remova a lente e o humor vítreo. Em seguida, use uma pinça fina para puxar a retina em forma de taça para longe do centro do olho. Enxágue a retina com tampão fosfato 0,1 molar em uma placa de Petri limpa. Depois de isolar a retina do camundongo em forma de xícara, incube-a em uma incubadora de 20 horas com uma solução Triton X-100 a 2% em tampão fosfato 0,1 molar durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, transfira a retina para a solução de bloqueio e gire a 72 RPM no agitador durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, coloque a retina em um tubo de microcentrífuga contendo os anticorpos primários de cabra anti-PDGFR beta em tampão de diluição. Gire o tubo no agitador por dois dias a quatro graus Celsius. Após dois dias, lave a retina duas vezes com tampão de lavagem em temperatura ambiente. Coloque a retina no tampão de lavagem e transfira-a para o agitador durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, transfira a retina para um tubo de microcentrífuga contendo uma solução de um miligrama por mililitro de anticorpo secundário de burro anti-cabra 488 e 0,2 nanogramas por mililitro de coloração nuclear fluorescente DAPI. Gire o tubo no agitador a 72 RPM por cinco horas a quatro graus Celsius. Lave a retina em uma placa de seis poços com tampão de lavagem por uma hora, duas vezes em temperatura ambiente. Incube a retina em tampão de lavagem no agitador durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, transfira a retina para o reagente de limpeza de tecidos e gire-a suavemente no agitador a 60 RPM por uma hora a 37 graus Celsius. Após a limpeza do tecido, enxágue a retina com tampão fosfato 0,1 molar em uma placa de Petri limpa. Usando uma tesoura de mola, faça quatro incisões radiais atingindo aproximadamente 2/3 do raio da retina para criar uma forma de pétala. Achate a retina e monte-a em uma lâmina de microscópio com a parte interna da retina voltada para cima. Use um pequeno pedaço de papel absorvente para remover qualquer excesso de tampão fosfato. Circule a retina montada com um espaçador. Preencha a lacuna com reagente de limpeza de tecido fresco e coloque uma lamínula por cima. Digitalize as visualizações de montagem da retina rotulada usando o scanner panorâmico de fatias de tecido. Tire as imagens de maior ampliação usando um sistema de imagem equipado com uma lente de 2X e 10X com aberturas numéricas de 0,40 e 0,95, respectivamente. Capture imagens de pilha 50Z da retina rotulada em quadros de dois micrômetros. Clique sequencialmente em Definir plano focal inicial, Definir plano focal final, Definir tamanho da etapa, escolha Padrão de profundidade, Captura de imagem e Série Z para integrar todas as imagens em uma única imagem em foco usando o modo de projeção e topografia. Em seguida, capture imagens usando a fluorescência verde em 499 e 519 nanômetros, fluorescência vermelha em 591 e 618 nanômetros e fluorescência azul em 401 e 421 nanômetros. Selecione sequencialmente Adicionar novas superfícies, escolha Configurações de volume, escolha Canal de origem, ajuste a exibição, ajuste o ângulo da superfície e o instantâneo para importar as imagens confocais Z-Stack para o software de análise e reconstruir as imagens no padrão tridimensional. A transparência do tecido de toda a retina do monte foi aumentada após o tratamento de limpeza do tecido em comparação com a retina sem limpeza do tecido. A vasculatura retiniana marcada com lectina de tomate e parasitas retinianos marcados com PDGFR-β foram visíveis antes e depois da limpeza do tecido, mas o ruído de fundo foi reduzido após a limpeza do tecido. Parasitas retinianos foram observados ao longo da árvore vascular, mostrando uma distribuição gradativa das regiões central para periférica da retina. As imagens tridimensionais do Z-Stack da retina limpa mostraram parasitas firmemente enrolados em torno de vasos retinianos de diâmetros variados com coloração PDGFR-β mais forte nos capilares.