Desenvolvimento de um sistema de protoplastos de repolho para estudo da tolerância à hipóxia em brássicas
20 de setembro de 2024
Este protocolo descreve um sistema eficiente de protoplastos de mesofilo de repolho. Vários tratamentos deficientes em oxigênio foram testados, e o sistema mostrou uma alta ativação de genes responsivos à hipóxia, facilitando estudos dos mecanismos genéticos e moleculares de tolerância ao alagamento em vegetais de Brassicaceae .
Estamos estudando como os repolhos reagem ao baixo oxigênio em nível molecular. Como os repolhos são difíceis de obter, estamos desenvolvendo um sistema usando células isoladas de repolho. Ao expor essas células sobressalentes, também conhecidas como protoplastos, a condições de baixo oxigênio, podemos investigar facilmente sua resposta ao estresse.
Trabalhar com protoplastos suspensos em solução para estudar respostas de baixo oxigênio é complicado. O grande desafio é manter oxigênio suficiente para nossas amostras de controle. Descobrimos uma maneira de bombear o oxigênio do líquido.
Validamos o método por meio de ensaios repórter de marcadores de hipóxia. Verificamos diferentes métodos para lidar com baixo oxigênio e descobrimos que o pacote absorvedor de oxigênio funciona melhor. É fácil de usar e eficaz, tornando-o ótimo para estudar como os protoplastos se comportam em condições de baixo oxigênio.
Estudar o mecanismo molecular em culturas folhosas sob condições de hipóxia tem sido um desafio devido à limitação das ferramentas disponíveis, mas com os avanços recentes, fizemos um grande progresso usando um sistema de protoplastos de repolho com tratamento de hipóxia. Este novo método está nos ajudando a entender como o baixo oxigênio afeta essas plantas em nível molecular. No futuro, planejamos combinar o sistema de protoplastos com ensaios de imunoprecipitação e repórter para ilustrar a via regulatória molecular envolvida no repolho durante o estresse por inundação.
Nosso objetivo é identificar os principais reguladores da tolerância a inundações, que esperamos ajudar na criação de uma nova cultivar de repolho com melhor tolerância a inundações. Para começar, preencha os orifícios redondos em forma de quadrado de uma bandeja de 48 poços com substrato de planta comercial e semeie Fuyudori e 228 sementes de repolho com aproximadamente um centímetro de profundidade no meio de cultivo. Para preparar 12,5 mililitros de solução enzimática, pré-aqueça uma solução contendo 10 milimolares MES e 0,6 molar manitol a 55 graus Celsius.
Em seguida, adicione 1,5% de celulase R-10 e 0,75% de macerozima R-10. Mexa a solução e continue aquecendo a 55 graus Celsius por 10 minutos. Deixe a solução enzimática esfriar até a temperatura ambiente.
Em seguida, adicione 10 milimolares de cloreto de cálcio e 0,1% de albumina de soro bovino. Usando um filtro de seringa de 0,22 micrômetro, esterilize a solução enzimática em uma placa de Petri de nove centímetros. Após duas a três semanas de crescimento, colete mudas de repolho no estágio da segunda folha para isolamento do protoplasto do mesofilo.
Colete as segundas folhas verdadeiras recém-expandidas de cinco a oito mudas de repolho. Usando uma lâmina de barbear afiada, corte as folhas em tiras de 0,5 a 1,0 milímetro. Transfira imediatamente as tiras de folhas para a solução enzimática recém-preparada.
Sujeite as tiras de folhas de repolho à infiltração de vácuo no escuro por 30 minutos. Após a infiltração a vácuo, mantenha as tiras de folhas imersas na solução enzimática no escuro por quatro a 16 horas. No dia seguinte, diluir a solução contendo protoplastos com um volume igual de solução W5 para interromper a digestão enzimática.
Para liberar a suspensão dos protoplastos, gire suavemente a mistura em um agitador orbital. Em seguida, filtre a suspensão celular através de um filtro de célula de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar a solução de protoplastos a 150 g durante dois minutos a quatro graus Celsius.
Adicione 10 mililitros de solução W5 ao longo da parede do tubo a uma taxa de fluxo de aproximadamente um mililitro por segundo para lavar os protoplastos peletizados. Após a última centrifugação, ressuspender os protoplastos na solução W5 e colocar o tubo no gelo durante 30 minutos. Em seguida, remova um mililitro de sobrenadante de cada vez até que todo o sobrenadante seja removido.
Ressuspenda os protoplastos em uma solução MMG pré-resfriada com gelo. Meça a concentração de protoplastos usando um hemocitômetro. Ajuste a concentração final para 4 vezes 10 elevado à potência de 5 protoplastos por mililitro usando a solução MMG.
Após o isolamento e digestão durante a noite, o rendimento dos protoplastos foi de 1,04 vezes 10 elevado a 7 para Fuyudori e 4,00 vezes 10 elevado a 6 protoplastos por grama de peso fresco para 228. A eficiência de transfecção de protoplastos foi superior a 40% nas cultivares Fuyudori e 228, conforme demonstrado pelo gene repórter GFP. Depois de isolar o protoplasto de repolho, misture 100 microlitros de 4 vezes 10 à potência de 4 protoplastos com 10 microlitros de plasmídeo e coloque a mistura no gelo por 10 minutos.
Adicione um volume igual de solução de PEG recém-preparada à solução de protoplasto e misture delicadamente. Incube a mistura de protoplastos em temperatura ambiente no escuro por 10 minutos. Em seguida, adicione 440 microlitros de solução W5 para encerrar a reação.
Centrifugue os protoplastos transfectados a 150 G por dois minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenda o pellet em 750 microlitros de solução W5 enriquecida com oxigênio. Transfira os protoplastos ressuspensos para uma placa de cultura de tecidos de seis poços pré-codificada com albumina de soro bovino a 1%.
Para hipóxia induzida por bolsa que consome oxigênio, coloque uma placa contendo solução de protoplasto W5 em um frasco anaeróbico de 3,5 litros. Em seguida, adicione dois pacotes de absorvedores de oxigênio no frasco para criar um ambiente hipóxico. Após o tratamento, centrifugar os protoplastos a 150 G durante dois minutos a quatro graus Celsius.
Rejeitar o sobrenadante e congelar os protoplastos recolhidos em azoto líquido antes de proceder ao ensaio de luciferase dupla. O pacote absorvedor de oxigênio induziu um aumento de 7,0 vezes na atividade do promotor BoADH1 em comparação com o controle, demonstrando a maior resposta hipóxica. A atividade do promotor BoSUS1L aumentou mais de 5,6 vezes, com o tratamento com pacote absorvedor de oxigênio apresentando a maior indução entre os tratamentos.
Visão Geral
Este estudo investiga as respostas moleculares dos protoplastos de repolho a condições de baixo oxigênio, que simulam o estresse de inundação. Ao desenvolver um novo sistema de protoplastos que melhora o estudo de genes responsivos à hipóxia, a pesquisa visa elucidar os mecanismos genéticos subjacentes à tolerância à inundação em vegetais da família Brassicaceae.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Respostas ao estresse em plantas
- Tolerância à inundação em vegetais
- Mecanismos genéticos e moleculares
Fundo
- Repolhos são difíceis de obter, necessitando a necessidade de um sistema celular como os protoplastos.
- A pesquisa sobre respostas à hipóxia em plantas é limitada pelas técnicas disponíveis.
- Compreender os mecanismos moleculares pode melhorar os esforços de melhoramento para uma melhor tolerância à inundação.
Métodos Utilizados
- Desenvolvimento de um sistema de protoplastos de repolho isolado usando digestão enzimática.
- Exposição dos protoplastos a condições controladas de baixo oxigênio para imitar a hipóxia.
- Utilização de ensaios reporter para validar a ativação de genes responsivos à hipóxia.
Principais Resultados
- Estabelecimento bem-sucedido de um sistema de protoplastos com alta eficiência de transfecção.
- Protoplastos expostos a tratamentos de absorção de oxigênio mostraram aumentos significativos na expressão gênica responsiva à hipóxia.
- Indução de marcadores-chave de hipóxia validada por ensaios de dupla luciferase.
Conclusões
- O estudo destaca um método eficaz para analisar as respostas moleculares dos repolhos ao baixo oxigênio.
- Os achados podem facilitar o desenvolvimento de cultivares de repolho com tolerância aprimorada ao estresse de inundação.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Flooding-induced hypoxia is a major threat to Brassica crop yields, demanding robust early-stage tools for dissecting stress tolerance mechanisms. The cabbage protoplast system with controlled hypoxia induction enables rapid, quantitative interrogation of gene function in a transformation-recalcitrant species. This platform advances predictive confidence in target validation and accelerates the identification of molecular regulators for breeding resilient cultivars.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of hypoxia-responsive genes in a physiologically relevant plant system.
- Supports mechanistic de-risking by isolating and quantifying promoter activation under defined oxygen conditions.
- Facilitates rapid hypothesis testing for candidate gene roles in stress adaptation pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, high-yield protoplast isolation and transfection workflow for downstream assays.
- Delivers reproducible, quantitative dual-luciferase readouts for promoter activity under hypoxia.
- Enables scalable screening of genetic constructs or chemical modulators affecting hypoxia response.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular findings with physiological stress responses relevant to crop improvement.
- Supports continuity from gene discovery to trait validation in breeding pipelines.
- Reduces translational risk by modeling stress adaptation in a commercially important species.
Pipeline & Workflow Integration
This protoplast-based system bridges early discovery and pre-breeding, enabling functional genomics, target validation, and quantitative screening in a single workflow.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for gene function in hypoxia tolerance pathways.
- Screening: Provides validated, reproducible quantitative assays for promoter activation.
- Analytics: Enables statistical comparison of gene activation across treatments and controls.
- Translational Research: Connects molecular responses to phenotypic outcomes relevant for cultivar development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse gene function and stress response studies in Brassica.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target gene selection for stress tolerance.
- Operational Value: Standardizes protoplast isolation and hypoxia induction for reproducible results.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for candidate genes in breeding pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets for crop resilience.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant cell isolation, transfection, and reporter assays.
- Needs access to controlled hypoxia induction equipment and dual-luciferase analytics.
- Demands cross-team standardization of protoplast preparation and assay conditions.
- Adaptation to other Brassica species may require protocol optimization.
- Potential limitations include protoplast viability and scalability for high-throughput studies.
