Name: Teste de eficiência de tradução usando perfis polissômicos sob estresse térmico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprenda a realizar perfilamento polissômico em Arabidopsis thaliana para estudar eficiência de tradução sob estresse térmico. Este protocolo padronizado utiliza normalização spike-in para análises translatômicas precisas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Analisando a regulação translacional em Arabidopsis estressada pelo calor

<ol><li>Picard, F., Loubière, P., Girbal, L., Cocaign-Bousquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+translation+regulation+in+the+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">The significance of translation regulation in the stress response.</a> BMC genomics. 14, 1-11 (2013).</li>
<li>Yuan, S., Zhou, G., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+machinery%3A+the+basis+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genom%22%5BJournal%5D)">Translation machinery: the basis of translational control.</a> J Genet Genom. 51 (4), 367-378 (2024).</li>
<li>Dever, T. E., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elongation%2C+termination%2C+and+recycling+phases+of+translation+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (7), a013706(2012).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Dennis, M. D., Browning, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phosphorylation+of+plant+translation+initiation+factors+by+Arabidopsis+thaliana+CK2+holoenzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential phosphorylation of plant translation initiation factors by Arabidopsis thaliana CK2 holoenzymes.</a> J Biol Chem. 284 (31), 20602-20614 (2009).</li>
<li>Dennis, M. D., Person, M. D., Browning, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+plant+translation+initiation+factors+by+CK2+enhances+the+in+vitro+interaction+of+multifactor+complex+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of plant translation initiation factors by CK2 enhances the in vitro interaction of multifactor complex components.</a> J Biol Chem. 284 (31), 20615-20628 (2009).</li>
<li>Chen, G. H., Liu, M. J., Xiong, Y., Sheen, J., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOR+and+RPS6+transmit+light+signals+to+enhance+protein+translation+in+deetiolating+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">TOR and RPS6 transmit light signals to enhance protein translation in deetiolating Arabidopsis seedlings.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (50), 12823-12828 (2018).</li>
<li>Chang, H. H., Huang, L. C., Browning, K. S., Huq, E., Cheng, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphorylation+of+carboxyl-terminal+eIF2%CE%B1+by+SPA+kinases+contributes+to+enhanced+translation+efficiency+during+photomorphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">The phosphorylation of carboxyl-terminal eIF2α by SPA kinases contributes to enhanced translation efficiency during photomorphogenesis.</a> Nat Comm. 15 (1), 3467(2024).</li>
<li>Liu, M. J., Wu, S. H., Chen, H. M., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+translational+control+contributes+to+the+regulation+of+Arabidopsis+photomorphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Sys+Biol%22%5BJournal%5D)">Widespread translational control contributes to the regulation of Arabidopsis photomorphogenesis.</a> Mol Sys Biol. 8 (1), 566(2012).</li>
<li>Des Marais, D. L., Juenger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropy%2C+plasticity%2C+and+the+evolution+of+plant+abiotic+stress+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Pleiotropy, plasticity, and the evolution of plant abiotic stress tolerance.</a> Ann New York Acad Sci. 1206 (1), 56-79 (2010).</li>
<li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (10), 663-679 (2022).</li>
<li>Shulaev, V., Cortes, D., Miller, G., Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+for+plant+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Physio+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Metabolomics for plant stress response.</a> Physio Plantarum. 132 (2), 199-208 (2008).</li>
<li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+heat+stress+and+drought+stress+in+pearl+millet+based+on+Pacbio+full-length+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of heat stress and drought stress in pearl millet based on Pacbio full-length transcriptome sequencing.</a> BMC Plant Biology. 20, 1-15 (2020).</li>
<li>Wasternack, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+jasmonates+in+plant+stress+responses+and+development-applied+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Action of jasmonates in plant stress responses and development-applied aspects.</a> Biotechnol Adv. 32, 31-39 (2014).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+translational+induction+during+NLR-mediated+immunity+in+plants+is+dynamically+regulated+by+CDC123%2C+an+ATP-sensitive+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Global translational induction during NLR-mediated immunity in plants is dynamically regulated by CDC123, an ATP-sensitive protein.</a> Cell Host Microbe. 31 (3), 334-342 (2023).</li>
<li>Cho, H. Y., Chou, M. Y., Ho, H. Y., Chen, W. C., Shih, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+modulates+translation+dynamics+in+Arabidopsis+under+submergence+via+GCN2+and+EIN2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2.</a> Sci Adv. 8 (22), eabm7863(2022).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+TaHSFA6e+modulates+heat+shock+protein-mediated+translational+regulation+in+response+to+heat+stress+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat.</a> New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).</li>
<li>Maruri-López, I., Figueroa, N. E., Hernández-Sánchez, I. E., Chodasiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stress+granules%3A+trends+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Plant stress granules: trends and beyond.</a> Front Plant Sci. 12, 722643(2021).</li>
<li>Hamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+formation+is+induced+by+a+threshold+temperature+rather+than+a+temperature+difference+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress granule formation is induced by a threshold temperature rather than a temperature difference in Arabidopsis.</a> J Cell Sci. 131 (16), jcs216051(2018).</li>
<li>Jang, G. J., Jang, J. C., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+functions+of+stress+granules+and+processing+bodies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Dynamics and functions of stress granules and processing bodies in plants.</a> Plants. 9 (9), 1122(2020).</li>
<li>Ostberg, S., Schewe, J., Childers, K., Frieler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+crop+yields+and+their+variability+at+different+levels+of+global+warming%5BTitle%5D)+AND+%22Earth+Sys+Dyn%22%5BJournal%5D)">Changes in crop yields and their variability at different levels of global warming.</a> Earth Sys Dyn. 9 (2), 479-496 (2018).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+TaHSFA6e+modulates+heat+shock+protein-mediated+translational+regulation+in+response+to+heat+stress+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat.</a> New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).</li>
<li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (87), e51164(2014).</li>
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<li>Cheng, M. C., Liao, P. M., Kuo, W. W., Lin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+ETHYLENE+RESPONSE+FACTOR1+regulates+abiotic+stress-responsive+gene+expression+by+binding+to+different+cis-acting+elements+in+response+to+different+stress+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis ETHYLENE RESPONSE FACTOR1 regulates abiotic stress-responsive gene expression by binding to different cis-acting elements in response to different stress signals.</a> Plant Physiol. 162 (3), 1566-1582 (2013).</li>
<li>Van den Broeck, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+network+to+phenotype%3A+the+dynamic+wiring+of+an+Arabidopsis+transcriptional+network+induced+by+osmotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Sys+Biol%22%5BJournal%5D)">From network to phenotype: the dynamic wiring of an Arabidopsis transcriptional network induced by osmotic stress.</a> Mol Sys Biol. 13 (12), 961(2017).</li>
<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((detection+and+identification+of+newly+synthesized+proteomes+with+bioorthogonal+non-canonical+amino-acid+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">detection and identification of newly synthesized proteomes with bioorthogonal non-canonical amino-acid tagging.</a> Nat Protoc. 2 (3), 532-540 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+de+novo+protein+synthesis+in+starvation-induced+autophagy+using+bioorthogonal+noncanonical+amino+acid+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Acad+Press%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of de novo protein synthesis in starvation-induced autophagy using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging.</a> Acad Press. 588, 41-59 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubo eppendorf de 1,5 mL</td><td>Labcon</td><td>3012-870-000-9</td><td>Extração de RNA</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 13,2 mL</td><td>Ultracentrifugação</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol Honeywell</td><td></td><td>32712</td><td>Perfil de polissomo</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Honeywell</td><td>32211</td><td>Extração de RNA</td></tr><tr><td>Cicloheximida (CHX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-C7698</td><td>Perfil polissômico</td></tr><tr><td>Dietil pirocarbonato (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>Extração de RNA</td></tr><tr><td></td><td>Etanol Sigma-Aldrich</td><td>32221</td><td>Extração de RNA</td></tr><tr><td>GeneChip Eucariótico Poli-A Kit de Controle de RNA</td><td>Invitrogen</td><td>900433</td><td>Normalização</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Honeywell</td><td>15523</td><td>Normalização</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-H3149</td><td>Perfil de polissoma</td></tr><tr><td>HiScript III RT SuperMix para kit qPCR</td><td>Vazyme</td><td>R323-01</td><td>Normalização</td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T.Baker</td><td>&nbsp; 3040-01 Perfil de</td><td>polissoma</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-M8266</td><td>Perfil de polissoma</td></tr><tr><td>MS meio basal</td><td>Phyto</td><td>M524</td><td>Cultura vegetal</td></tr><tr><td>Gráfico de picos Bomba de seringa</td><td>Brandel</td><td>SYN4007LS</td><td>Perfil de polissoma</td></tr><tr><td>Polioxietileno-10-Tridecil-Éter (PTE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2393</td><td>Perfil</td></tr> <tr><td>de polissomaRNasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td>Perfil de polissoma</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio (DOC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-D6750</td><td>Perfil de polissoma</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td>Perfil de polissoma</td></tr><tr><td>SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>BP170-8882</td><td>Normalização</td></tr><tr><td>TRI reagente</td><td>MRC</td><td>TR118</td><td>Extração de RNA</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>J.T.Baker</td><td>&nbsp; 4109-06</td><td>Perfil de polissoma</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Beckman</td><td>Coulter</td><td>Optima L-100K</td><td>ultracentrifugação</td></tr><tr><td>UV/VISDETECTOR</td><td>Brandel</td><td>UA-6</td><td>Perfil de polissoma</td></tr></tbody></table>

teste de eficiência de tradução usando perfis polissômicos sob estresse térmico

Translation Efficiency Test Using Polysome Profiles Under Heat Stress

O tipo selvagem de Arabidopsis, Col-0, foi cultivado em meio MS sob fotoperíodo de luz de 16 h:8 h. Para o controle, foram utilizadas mudas com 5 dias de idade, sem tratamento por estresse térmico. O grupo de estresse térmico foi submetido a 1 h de tratamento térmico a 40 °C em banho-maria pré-aquecido, enquanto o grupo de recuperação foi colocado a 22 °C por 2 h imediatamente após o tratamento térmico. Ao empregar diferentes condições de tratamento térmico e condições de recuperação, podemos utilizar etapas subsequentes para medir sua eficiência translacional.
Antes da extração do RNA, o gradiente de sacarose deve ser preparado primeiro. Para separar o RNA não polissômico e polissômico com base em sua diferença de densidade, preparamos uma solução gradiente com concentrações de sacarose de 12,5%, 24,4%, 36,3%, 48,1% e 60%. Em seguida, carregamos as soluções de gradiente de alta para baixa concentração, começando pela parte inferior (Figura 1A). Posteriormente, podemos utilizar esse gradiente para separar o RNA não polissômico de baixa densidade na camada superior, enquanto o RNA polissômico de alta densidade será distribuído na camada inferior com maiores concentrações de sacarose. O RNA não polissômico e polissômico foi extraído do Col-0 tratado ou não tratado. Para evitar que as partículas na solução afetem os resultados da análise de perfil de polissomas, a solução contendo RNA deve ser filtrada através de um filtro de células para obter uma solução de extração livre de partículas. O sobrenadante filtrado foi carregado em um gradiente de sacarose pré-preparado e equilibrado. Após a ultracentrifugação das amostras carregadas com gradiente de sacarose, o RNA não polissômico e polissômico foi distribuído de acordo com a densidade dentro do gradiente de sacarose. Posteriormente, o perfil do polissomo foi realizado usando um fracionador de gradiente de densidade (Figura 1B). O fracionador de gradiente de densidade é controlado usando um software inicialmente calibrado com água deionizada. Após a calibração, as amostras são carregadas no fracionador após a ultracentrifugação. Operando no modo de controle de software, a bomba de seringa de microvolume injeta solução de sacarose com concentrações superiores ao gradiente de sacarose no gradiente, empurrando a amostra. Isso permite que a medição comece do topo do gradiente de sacarose, onde a densidade é menor, e prossiga em direção ao fundo, onde a densidade é maior. Posteriormente, as configurações do software são ativadas para iniciar a aquisição dos dados, gerando o gráfico do perfil do polissomo por meio da medição do OD254 (Figura 1B). Quando observamos uma maior intensidade de sinal na fração polissomal, isso indica que a amostra apresenta maior eficiência de tradução.
As parcelas de perfil polissômico para mudas Col-0 de 5 dias de idade sob diferentes tratamentos são mostradas na Figura 2. Os resultados do grupo controle demonstram uma clara separação entre a fração não polissômica e a fração polissômica (Figura 2A). No entanto, após 1 h de estresse térmico a 40 °C, a intensidade do sinal da fração polissomal diminuiu significativamente (Figura 2B). Quando as mudas tratadas termicamente foram recuperadas a 22 ° C por 2 h, a intensidade do sinal da fração polissômica se recuperou para um nível semelhante ao grupo controle ( Figura 2C ). Nossos resultados demonstraram que o tratamento por estresse térmico de 1 h reduziu significativamente a eficiência de tradução de mudas de Arabidopsis. No entanto, as plantas necessitaram de 2 h de recuperação para restaurar a eficiência da tradução a níveis comparáveis aos de mudas que não sofrem de estresse térmico.
Para reunir mais evidências comparando a eficiência de tradução de plântulas de Col-0 sob diferentes condições de tratamento, isolamos e extraímos as frações de RNA não polissômica e polissomal. A coleta das frações de RNA não polissômicas e polissomais foi guiada pelos resultados das medidas do perfil polissômico. Para extração de RNA não polissômico e polissomal, usamos o reagente tiocianato de fenol/guanidínio para extrair as amostras isoladas de RNA não polissômico e polissomal. Com o método de extração de RNA que usamos, podemos obter RNA estável e de alta qualidade para nossa análise a seguir (Tabela 1). Posteriormente, normalize o RNA extraído com o Kit de Controle de RNA Poli-A Eucariótico GeneChip para mitigar erros causados por perdas de extração variáveis. Em seguida, a PCR em tempo real foi usada para quantificar a expressão dos genes DAP , que estão incluídos nos genes de B. subtilis adicionados ao kit. A análise comparativa dos níveis de expressão gênica do DAP entre os grupos de RNA não polissômico e polissômico foi realizada para estimar o conteúdo de RNA em condições de perda proporcional (Figura 3A). Calculamos a razão entre o RNA polissômico normalizado e o RNA total para esclarecer a eficiência da tradução entre eles (Figura 3B). Finalmente, a proporção de RNA nos polissomos foi calculada usando o conteúdo de RNA normalizado (Figura 3C). Os resultados da razão de RNA em polissomos sob diferentes tratamentos de Col-0 exibiram um padrão consistente com os resultados do perfil de polissomos mostrados na Figura 2A. Ambos os resultados indicam que o estresse térmico reduz significativamente a razão de RNA na fração polissomal, e esse efeito pode ser revertido após uma recuperação de 2 h a 22 ° C (Tabela 1).
A partir deste método, podemos obter toda a fração de RNA não polissômica ou polissômica com alta qualidade, em vez de separar o RNA em frações adicionais23. Nossos resultados também demonstram que tanto os perfis de polissomos quanto a porcentagem de RNA em polissomos podem efetivamente refletir a eficiência da tradução em Arabidopsis com diferentes condições tratadas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama de fluxo de trabalho de perfil de polissomo. (A) Ilustração esquemática da preparação do gradiente de sacarose em um tubo de centrífuga de 13 mL. (B) O fluxograma ilustra o processo experimental de perfil de polissomos. Em primeiro lugar, o translatômio é extraído. Posteriormente, o RNA não polissômico e polissômico é separado com base em suas diferenças de densidade usando ultracentrifugação em gradientes de sacarose de densidades variadas. O OD254 é medido usando um fracionador de gradiente de densidade para obter o gráfico de resultados de perfil de polissomo abaixo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig02.jpg"> Figura 2: Perfil polissômico de Col-0 sob diferentes condições. (A, B, C) O perfil polissômico resulta de Col-0 sob condições de (A) sem tratamento térmico (controle), (B) tratamento térmico a 40 ° C por 1 h e (C) recuperação a 22 ° C por 1 h após o tratamento térmico. O RNA não polissômico e polissômico foi fracionado usando um gradiente de sacarose de 12,5% a 60%. As posições do RNA não polissômico (NP) e polissômico (PL) são indicadas nos perfis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig03.jpg"> Figura 3: Diagrama de fluxo de trabalho de extração de RNA não polissômico e polissomal. (A) Uma ilustração da normalização do RNA por spike in. (B) Uma ilustração da separação de RNA não polissômico e polissômico e o cálculo da porcentagem de RNA polissomal. (C) A porcentagem de RNA polissômico em Col-0 tratado com diferentes condições. As barras de erro indicam a média ± DP (n = 3 repetições biológicas). *Valor de p &lt; 0,01, teste t de Student. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>Conteúdo (ng)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Controle</td>
			<td>RNANP</td>
			<td>758.3</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.16</td>
		</tr><tr><td>RNAPL</td>
			<td>302.3</td>
			<td>2.21</td>
			<td>2.13</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Estresse térmico</td>
			<td>RNANP</td>
			<td>821.5</td>
			<td>2.2</td>
			<td>2.15</td>
		</tr><tr><td>RNAPL</td>
			<td>174.3</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.21</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Recuperação</td>
			<td>RNANP</td>
			<td>797.2</td>
			<td>2.17</td>
			<td>2.16</td>
		</tr><tr><td>RNAPL</td>
			<td>300.9</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.18</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Conteúdo e qualidades de RNA não polissômico e polissomal. Esta tabela mostrou que os conteúdos e qualidades de RNA foram analisados. O conteúdo de RNA foi normalizado após a extração usando métodos modificados.

Teste de eficiência de tradução usando perfis polissômicos sob estresse térmico

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Este protocolo descreve um método fácil de extrair e fracionar transcritos de tecidos vegetais com base no número de ribossomos ligados. Permite uma estimativa global da atividade de tradução e a determinação do status translacional de mRNAs específicos.

Um método fácil para a planta polysome Profiling

O objectivo geral da técnica de criação de perfil de polysome é análise da actividade translacional de mRNAs individuais ou mRNAs transcriptome durante a síntese de proteína. O método é importante para estudos de regulamento de síntese de proteínas, ativação de tradução e repressão em saúde e várias doenças humanas.

Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato

Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar polysome de criação de perfil em coração isolado de rato perfundido. Nós descrevemos os métodos para análise das frações no que diz respeito a mRNAs, miRNAs e o proteome polysome polysome, polysome de criação de perfil e perfusão do coração.

Dinâmica proteómica e miRNA análise de polissomos de coração de rato isolado após Langendorff perfusão

Apresentamos uma técnica para estabilizar rapidamente complexos translacionais (biossíntese de proteínas) com formaldeído interligando em leveduras vivas e células mamíferas. A abordagem permite dissecar intermediários transitórios e interações dinâmicas de RNA:protein. Os complexos interligados podem ser usados em vários aplicativos a jusante, como em métodos de perfil baseados em sequenciamento profundo, microscopia e espectrometria de massa.

Correção rápida in Vivo e isolamento de complexos translacionais de células eucarióticas

Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo sem usar fabricantes automatizados de gradientes ou sistemas de fracionamento de gradiente.

Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

Transformação do DNA plasmidial em E. coli Usando o método de choque térmico

Neste vídeo vamos descrever um método para avaliar a reação psicofisiológica pessoa ao estresse usando biofeedback. Nós também irá apresentar as diretrizes gerais para o planejamento de tratamento.

Avaliação do estresse psicofisiológico Usando Biofeedback

Aprenda a realizar perfilamento polissômico em Arabidopsis thaliana para estudar eficiência de tradução sob estresse térmico. Este protocolo padronizado utiliza normalização spike-in para análises translatômicas precisas.

Teste de eficiência de tradução usando perfis polissômicos sob estresse térmico

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