Estabelecimento de um modelo de camundongo com hipersensibilidade à tosse por inalação de ácido cítrico
10 de janeiro de 2025
Este protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo de camundongo com hipersensibilidade à tosse, que pode servir como um modelo ideal para estudar os mecanismos da tosse crônica.
A tosse crônica prejudica significativamente a qualidade de vida, causando uma aparência premente e um fardo econômico substancial. Nós nos concentramos na pertinácia da tosse, especialmente no mecanismo de hipersensibilidade à tosse. Estabelecemos um modelo de camundongo com hipersensibilidade à tosse, que será utilizado para estudos posteriores sobre o mecanismo da tosse crônica. Em comparação com outros modelos animais, especialmente cobaias, mais fácil de manter, mais econômico e passível de manipulação genética. Nosso protocolo é simples de operar. O modelo é mais fácil de contrastar. MA é mais viável. Este modelo também será valioso para estudos adicionais sobre o mecanismo e possíveis novos tratamentos para a tosse crônica.
[Narrador] Para começar, coloque os ratos em duas câmaras independentes, cada uma conectada a um nebulizador ultrassônico. Exponha o grupo modelo a aerossol de ácido cítrico 0,1 molar e o grupo controle a aerossol salino normal a 0,9%. Defina a taxa de atomização para o valor máximo de três mililitros por minuto e ajuste a exposição para duas horas por dia durante duas semanas. Após cada sessão, devolva os ratos às suas respectivas gaiolas. Configure o sistema de pletismografia não invasiva de corpo inteiro para medir a sensibilidade à tosse. Conecte as câmaras, transdutores de fluxo, fluxo de polarização e outros componentes. Calibre o sistema clicando no botão Calibrar para garantir medições precisas. Em seguida, crie um novo estudo de tosse no software do sistema para camundongos. Configure os parâmetros do estudo para permitir um minuto para aclimatação, 10 minutos para tempo de resposta e 10 minutos para entrega de solução química. Depois disso, coloque cada rato consciente em câmaras individuais, garantindo apenas um rato por câmara. Em seguida, adicione um mililitro da solução química apropriada, como solução salina normal, ácido cítrico ou capsaicina ao nebulizador para registrar o número de eventos de tosse assim que o procedimento começar. Prepare os instrumentos para medição da hiper-responsividade das vias aéreas. Crie um estudo de resposta à dose no software do sistema para camundongos. Configure os parâmetros de medição e a sequência de tarefas. Um minuto para aclimatação, 30 segundos para administração de metacolina, três minutos para tempo de resposta e um minuto para recuperação. Coloque cada rato consciente em câmaras individuais, garantindo apenas um rato por câmara. Em seguida, adicione 50 microlitros de PBS ou metacolina ao nebulizador e inicie o estudo. Registre o valor de Penh, que indica broncoconstrição em resposta ao aumento das concentrações de metacolina. A sensibilidade à tosse aumentou significativamente no grupo modelo após uma semana e persistiu durante todo o período de exposição. Nenhuma mortalidade foi observada no grupo modelo ou controle durante o estudo. Após a exposição, o número de eventos espontâneos de tosse foi significativamente maior no grupo modelo do que no grupo controle. A sensibilidade à tosse induzida por solução salina normal, ácido cítrico e capsaicina também foi significativamente maior no grupo modelo após a exposição. A hiperresponsividade das vias aéreas permaneceu comparável entre os dois grupos, sem diferença significativa após a modelagem. Para começar, colete sangue do seio orbital do camundongo sacrificado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Coloque o tubo no gelo, centrifugue o sangue a 3000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Utilizar uma pipeta para recolher o sobrenadante e alíquota-lo. Em seguida, abra o tórax para expor a traqueia e insira uma agulha interna de calibre 22 na traqueia. Lave a traqueia três vezes com 0,5 mililitros de PBS pré-resfriado e colete o fluido de lavagem broncoalveolar. Em seguida, centrifugue o líquido recolhido a 500 G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Colete o sobrenadante, alicote e armazene-o a -80 graus Celsius. Ressuspenda o pellet em 100 microlitros de PBS. Abra o tórax para expor os pulmões e remova cuidadosamente os tecidos pulmonares. Coloque os tecidos pulmonares coletados em frascos criogênicos. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos na contagem total de células inflamatórias e diferenciais no lavado broncoalveolar.
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Visão Geral
Este protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo murino com hipersensibilidade à tosse, que pode servir como um modelo ideal para o estudo dos mecanismos da tosse crônica. O modelo é mais fácil de manter e mais econômico em comparação com outros modelos animais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Fisiologia respiratória
- Modelos animais
Contexto
- A tosse crônica compromete significativamente a qualidade de vida.
- Compreender a hipersensibilidade da tosse é essencial para o desenvolvimento de tratamentos.
- Modelos de camundongos oferecem vantagens para manipulação genética.
- Este estudo tem como objetivo estabelecer um modelo confiável para pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo murino com hipersensibilidade à tosse.
- Investigar os mecanismos subjacentes à tosse crônica.
- Avaliar tratamentos potenciais para tosse crônica.
Métodos Utilizados
- Exposição de camundongos ao aerossol de ácido cítrico e solução salina normal.
- Medição da sensibilidade da tosse utilizando plestimografia de corpo inteiro.
- Avaliação da hiperreatividade das vias aéreas com metacolina.
- Coleta de lavado broncoalveolar e tecidos pulmonares para análise.
Resultados Principais
- A sensibilidade à tosse aumentou significativamente no grupo modelo.
- Nenhuma mortalidade foi observada em nenhum dos grupos durante o estudo.
- O grupo modelo apresentou eventos de tosse espontânea mais frequentes.
- A hiperreatividade das vias aéreas permaneceu comparável entre os grupos.
Conclusões
- O modelo murino estabelecido é eficaz para o estudo da tosse crônica.
- Os achados apoiam pesquisas adicionais sobre os mecanismos da tosse.
- Esse modelo pode auxiliar no desenvolvimento de tratamentos inovadores.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de um modelo reprodutível de hipersensibilidade à tosse em camundongos por inalação de ácido cítrico preenche uma lacuna crítica na pesquisa de doenças respiratórias, permitindo estudos mecanicistas com manipulação genética. Este modelo reforça a confiança preditiva na validação de alvos e na redução de riscos na descoberta precoce de fármacos respiratórios. Sua simplicidade operacional e escalabilidade facilitam a adoção em larga escala para investigações de tosse crônica e hipersensibilidade das vias aéreas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação dos mecanismos de hipersensibilidade à tosse em um sistema geneticamente manipulável.
- Apóia a validação funcional de alvos ao quantificar as respostas de tosse a estímulos definidos.
- Facilita a desconsideração biológica de alvos para tosse crônica antes da otimização da molécula líder.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece uma plataforma padronizada e reproduzível in vivo para avaliação de candidatos antitussígenos.
- Fornece leituras quantitativas de eventos de tosse adequadas para avaliação comparativa de compostos.
- Permite escalabilidade do ensaio e reprodutibilidade entre estudos por meio da pletismografia não invasiva.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Alinha-se com pontos finais relevantes para doenças como tosse crônica e hipersensibilidade das vias aéreas.
- Permite a continuidade da descoberta mecanicista à avaliação pré-clínica de eficácia.
- Permite a integração da análise de biomarcadores e tecidos para obter insights translacionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo situa-se dentro da fase inicial de descoberta até a pré-clínica, conectando estudos mecanicistas e validação translacional para indicações respiratórias.
- Biologia da Descoberta: Permite testes de hipóteses sobre vias da tosse e remodelação de nervos sensoriais.
- Triagem: Fornece medições reprodutíveis e quantitativas da sensibilidade à tosse para triagem de compostos.
- Análise: Permite comparação estatística de episódios de tosse e resposta das vias aéreas entre grupos.
- Pesquisa Translacional: Facilita a coleta de biomarcadores e tecidos para análises posteriores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma escalável e geneticamente passível de adaptação para diversos programas de pesquisa respiratória.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa da tosse crônica.
- Valor Operacional: Fornece ensaios padronizados, reprodutíveis e com custo-efetivos in vivo.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção e a alocação de capital em portfólios respiratórios.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e candidatos para tosse crônica.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em manejo de animais e fisiologia respiratória.
- Requer acesso a sistemas de pletismografia e instrumentação para entrega de aerossóis.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de exposição e medição.
- Adaptável a manipulações genéticas e farmacológicas em camundongos.
- Limitado aos pontos finais e estímulos validados dentro do sistema modelo.
