Nocaute de gene mediado por CRISPR-Cas9 baseado em eletroporação em células THP-1 e isolamento de clone de célula única

Minha atividade de pesquisa se concentra na compreensão dos mecanismos que tornam os macrófagos resistentes à infecção pelo HIV, o vírus responsável pela pandemia de AIDS. Em particular, nos concentramos na atividade da enzima chamada HT-1 que degrada os NTPs, os blocos de construção dos genomas virais. Mas essa enzima também tem outras atividades que tentamos elucidar.

Estabelecemos um protocolo para engenharia genética de células THP1. Essas células são um substituto bem estabelecido para os macrófagos humanos estudarem. Por exemplo, a replicação do HIV-1.

Essas células são difíceis de transfectar para manipular seu conteúdo proteico. Portanto, estabelecemos métodos para manipular seu genoma usando a tecnologia CRISPR-Cas9. Desde o desenho de RNAs SG até a validação de populações policlonais e monoclonais.

Nosso protocolo visa alcançar a edição de alta eficiência de um gene de interesse em células THP1 que serão eletroporadas com complexos ribonucleoproteicos pré-montados feitos pelos RNAs de energia da nuclease Cas9. Nessa abordagem, a atividade do Cas9 é limitada no tempo. Isso reduz a possibilidade de gerar efeitos-alvo que geralmente surgem quando os vetores lenti são empregados.

E, neste caso, de fato a expressão de Cas9 está prolongando o tempo e, portanto, pode ser prejudicial para a célula. Para começar, encha cada poço de uma placa de cultura de 24 poços com 500 microlitros de meio RPMI 1640 sem antibiótico e suplementado com 20% de FBS filtrado e inativado por calor. Coloque a placa em uma incubadora umidificada durante a noite.

Para reidratar o guia único seco ou sgRNAs até uma concentração final de 100 micromolares, adicione 10 microlitros de tampão TE por um nano mol de sgRNA. Vortex a solução por 30 segundos e incube a quatro graus Celsius durante a noite para garantir a reidratação completa. No dia seguinte, para preparar a solução de sgRNA de trabalho de 30 micromolares, primeiro homogeneizar brevemente a solução de sgRNA estoque de 100 micromolares com uma pipeta e, em seguida, diluir o pedúnculo em água livre de nuclease.

Vortex a solução por 30 segundos e incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Dilua um microlitro de cada uma das três soluções de trabalho de 30 sgRNAs micromolares e 0,5 microlitros de solução Cas9 20 micromolares em 3,5 microlitros de tampão de ressuspensão R, para montar as ribonucleoproteínas Cas9 sgRNA adicione uma proporção de um a nove molares. Vortex brevemente e incubar por cinco minutos em temperatura ambiente.

Para preparar um controle não editado, adicione 0,5 microlitros de solução Cas9 20 micromolar a 6,5 microlitros de tampão de ressuspensão R.Vortex brevemente e incube por cinco minutos em temperatura ambiente, adicione cinco microlitros de tampão de ressuspensão R às amostras para atingir um volume final de 12 microlitros por condição de eletroporação. Para preparar as células THP-1 após a contagem de células, colete um volume equivalente a 0,2 vezes 10 elevado à potência de seis células THP-1 e centrifugue-as a 336G por cinco minutos a 20 graus Celsius, aspire o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de PBS. Centrifugue novamente e ressuspenda o pellet celular nos 12 microlitros de solução de ribonucleoproteína.

Para configurar o sistema de eletroporação, coloque a estação de pipeta sob um gabinete de biossegurança e posicione um tubo de eletroporação dentro do gabinete, adicione três mililitros de tampão E do kit de eletroporação ao tubo de eletroporação. Ligue o dispositivo de eletroporação e use a tela sensível ao toque para definir os parâmetros de eletroporação, voltage para 1.500 volts. Duração de 10 milissegundos.

E número para três. Equipe a pipeta de eletroporação com uma ponta e aspire 10 microlitros da solução de ribonucleoproteína THP-1. Insira a pipeta no tubo de eletroporação e pressione start na tela do dispositivo de eletroporação.

Aguarde até que a mensagem concluída apareça e remova a pipeta do tubo. Transfira as células THP-1 para um poço da placa de cultura pré-aquecida de 24 poços e homogeneize suavemente a amostra. Coloque a placa de volta na incubadora umidificada e deixe as células descansarem sem serem perturbadas por 72 horas.

Após eletroporação e contagem de células, retire um volume equivalente a 0,1 vezes 10 elevado a seis células THP-1 em um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugue as células a 336G por cinco minutos a 20 graus Celsius e aspire o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em 500 microlitros de PBS. Mais uma vez, centrifugue as células, aspire o máximo de sobrenadante possível sem perturbar o pellet e quebre, congele o pellet.

Para a extração de DNA genômico, ressuspenda o pellet com 50 microlitros de solução de extração de DNA. Homogeneizar e transferir todo o volume para um tubo de PCR de 0,2 mililitros. Vortex o tubo e centrifugue-o brevemente por um pulso de três segundos.

Coloque o tubo em um termociclador e aqueça a 65 graus Celsius por 15 minutos, seguido de 98 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, dilua o DNA extraído com 90 microlitros de água ultrapura, vórtice e centrifugue brevemente a 5000G por três segundos. Diluir o primer de PCR em água ultrapura até uma concentração final de 10 micromoles.

Preparar a mistura de PCR num tubo de PCR de 0,2 ml. Coloque os tubos de PCR no termociclador e execute o programa com as configurações especificadas. Para populações editadas policlonais em um novo tubo de 0,2 mililitro.

Misture 17,5 microlitros do amplicon PCR com dois microlitros de tampão E dois para um volume final de 19,5 microlitros. Vortex a solução e centrifugue brevemente, alternativamente, para triagem de clones de células únicas, misture os produtos de PCR das células de controle editadas e não editadas em uma proporção de um para um. Para a formação heteroduplex, coloque os tubos em um termociclador e execute o programa fornecido.

Após a formação do hetero duplex, adicione 0,5 microlitros de T sete endonuclease, uma solução ao tubo e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Para preparar as amostras para eletroforese em gel, misture cinco microlitros da endonuclease T7 um produto de digestão ou produto de PCR não digerido com cinco microlitros de água e dois microlitros de seis corantes de carga de xDNA, carregue as amostras e a escada de tamanho no gel e execute o gel a 80 volts por 45 minutos. A edição gênica mediada por CRISPR Cas9 do locus EGFP resultou em um declínio acentuado de células positivas para GFP, atingindo mais de 90% de redução no sétimo dia após a eletroporação.

No terceiro dia após a eletroporação, o número de células caiu pela metade devido ao estresse induzido pela eletroporação, mas se recuperou totalmente no sétimo dia em meio RPMI completo. A endonuclease T7 one say e a eletroforese em gel de agarose demonstraram a perda de aproximadamente 75 fragmentos de pares de bases em células editadas, confirmando a edição CRISPR do local alvo do EGFP.