Modelo de biofilme agregado de fibrose cística para estudar a expressão gênica relevante para infecção

Nossa pesquisa desenvolve um modelo de biofilme agregado em escarro artificial para replicar infecções pulmonares em pacientes com fibrose cística. Este modelo nos permite analisar as mudanças na expressão gênica e entender por que as bactérias se tornam mais resistentes à terapêutica nessas condições em comparação com os ambientes padrão de teste de drogas. O desenvolvimento de um modelo de biofilme complexo destacou os desafios de recapitular o ambiente pulmonar hostil, tornando difícil prever se os efeitos antimicrobianos in vitro se alinham com os resultados in vivo.

A natureza específica do paciente das infecções pulmonares da FC complica ainda mais o desenvolvimento de modelos laboratoriais eficazes para testar antimicrobianos. Ao longo desta pesquisa, criamos com sucesso um modelo de biofilme agregado polimicrobiano, que fornece uma plataforma para testar antimicrobianos em um ambiente realista, mostra o nível de resistência que pode ser observado nesses biofilmes e destaca o potencial de terapias antivirulência direcionadas a componentes como o alginato. Ter um modelo de teste antimicrobiano projetado para imitar o ambiente pulmonar da FC preencherá a lacuna que existe entre os testes in vivo e in vitro.

Além disso, avaliar o viroma de bactérias em um ambiente que imita mais de perto um pulmão de FC permitirá o desenvolvimento e teste de terapias antivirulência. Para começar, coloque uma única conta de pseudomonas aeruginosa PAO1 de culturas de estoque de contas congeladas em uma broca de caldo de lisogenia. Incube a placa por 24 horas a 37 graus Celsius.

Para a preparação de biofilme de uma única espécie, prepare culturas noturnas de pseudomonas aeruginosa PAO1 com uma única colônia da placa estrial e incube durante a noite por 18 horas. Em seguida, dilua a cultura para uma densidade óptica de 0,05 a 600 nanômetros, equivalente a 1 vezes 10 elevado a 8 unidades formadoras de colônias por mililitro. Além disso, dilua esta cultura de 1 a 100 em meio SCFM2.

Em seguida, adicione 180 microlitros do inóculo aos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços de fundo redondo. Incubar a placa a 37 graus Celsius agitando a 75 rotações por minuto durante 24 horas. Reviva pseudomonas aeruginosa PAO1 e staphylococcus aureus SH1000 de culturas de estoque de grânulos congelados, conforme demonstrado anteriormente.

Reviva candida albican CAF 2.1 como uma única faixa de contas no ágar sabouraud dextrose e incube as placas por 24 horas a 37 graus Celsius. Prepare culturas noturnas de staphylococcus aureus e candida albicans com colônias únicas de suas respectivas placas de estrias em 5 mililitros de caldo de lisogenia. Diluir as culturas padronizadas para formar um único inóculo contendo ambas as espécies nas concentrações necessárias em SCFM2.

Em seguida, adicione 162 microlitros do inóculo misto aos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius agitando a 75 rotações por minuto durante 24 horas para permitir a formação de biofilmes multiespécies. Em seguida, adicione 14,2 microlitros da cultura preparada durante a noite de pseudomonas aeruginosa aos poços da placa de microtitulação de 96 poços e incube a placa novamente para permitir a formação de biofilme polimicrobiano.

Para começar, obtenha biofilmes de uma e várias espécies em placas de microtitulação de 96 poços. Para interromper o biofilme, adicione 8,81 microlitros de estoque de DNase 1 diretamente aos poços que contêm os biofilmes, atingindo uma concentração final de 50 microgramas por mililitro. Incube a placa por uma hora a 37 graus Celsius enquanto agita a 75 rotações por minuto.

Obtenha uma solução estoque de antibiótico de meropeném a 2,56 miligramas por mililitro. Realize diluições seriadas por um fator de dois para atingir uma faixa de concentração de 0,01 miligramas por mililitro a 2,56 miligramas por mililitro. Agora, adicione 20 microlitros de cada diluição de miropenem aos biofilmes, atingindo uma faixa de dosagem de 1 micrograma por mililitro a 256 microgramas por mililitro.

Sele a placa de microtitulação de 96 poços com filme transparente e incube-a a 37 graus Celsius por 24 horas enquanto agita 75 rotações por minuto. Os biofilmes de pseudomonas de uma única espécie não mostraram diminuição significativa nas células viáveis quando tratados com meropenem em qualquer dosagem de até 256 microgramas por mililitro. A recuperação de Pseudomonas aeruginosa foi 0,74 log 10 unidades formadoras de colônias por mililitro maior em ambientes de espécie única do que em ambientes polimicrobianos sem antibióticos.

Para começar, prepare os biofilmes de uma e várias espécies para extração de RNA. Após a incubação, transfira os biofilmes de cada poço para um tubo de microcentrífuga de um mililitro, agrupando as réplicas de biofilme para cada amostra. Centrifugar o tubo a 16 000 g durante cinco minutos.

Se a extração de RNA for realizada posteriormente, remova o sobrenadante e armazene o pellet em 250 microlitros de solução de estabilização de RNA a 80 graus Celsius. Em seguida, descongelar o tubo com pellets à temperatura ambiente e centrifugar a 16 000 g durante cinco minutos. Ressuspenda o pellet em 600 microlitros de reagente TRIzol e interrompa-o manualmente usando uma agulha de 0,2 milímetro presa a uma seringa de dois mililitros, aspirando de 5 a 10 vezes, ou até que o pellet esteja completamente rompido.

Siga as diretrizes do fabricante para purificar o RNA dos biofilmes interrompidos. Para quantificar o RNA purificado, prepare a solução de trabalho com 199 microlitros de tampão e um microlitro de reagente para cada amostra. Misture 190 microlitros da solução de trabalho e 10 microlitros do padrão um e do padrão dois em tubos separados.

Em seguida, adicione 199 microlitros da solução de trabalho e 1 microlitro da amostra de RNA em tubos individuais. Vórtice por 30 segundos e armazene em um local escuro por cinco minutos. Em seguida, no fluorímetro, selecione RNA, seguido de RNA de ampla faixa e siga as instruções na tela.

Depois de fazer a leitura em branco, pipetar um microlitro de RNA para o suporte de amostra do espectrofotômetro e medir a absorbância em 260 por 280 nanômetros. Para síntese de DNA complementar, prepare a mistura de reação em tubos. Coloque os tubos em um termociclador e execute o programa.

Use o CDNA imediatamente ou armazene-o a 80 graus Celsius. A expressão de algD em biofilmes de pseudomonas aeruginosa de uma única espécie não variou significativamente entre as concentrações de meropeném. Em biofilmes polimicrobianos, a expressão de algD foi significativamente maior em 256 microgramas por mililitro, indicando aumento da produção de alginato na presença de organismos co-colonizadores.