Geração de esferoides a partir de vários condrócitos usando condições de baixa aderência sob gravidade e mini-biorreatores caseiros

O reparo da cartilagem na doença articular crônica exige terapias avançadas baseadas em células para regenerar os tecidos danificados com eficiência. Este protocolo fornece um método passo a passo para diferenciar células-tronco pluripotentes induzidas em esferoides baseados em condrócitos, apoiando aplicações de engenharia de tecidos e terapia celular. O reparo da cartilagem na doença articular crônica exige terapias avançadas baseadas em células para regenerar suficientemente o tecido danificado.

Este protocolo fornece um método passo a passo para diferenciar células-tronco pluripotentes induzidas em esferoides baseados em condrócitos, apoiando aplicações de engenharia de tecidos e terapia celular. Os principais desafios são minimizar a expressão de colágeno tipo um em células derivadas de iPSC para prevenir a cartilagem fibrosa, criar condições para a formação de cartilagem highline madura, melhorar os métodos de cultura 3D para estabilidade esferóide e desenvolver abordagens escaláveis para produzir volumes clínicos de material celular. O protocolo oferece uma vantagem ao usar iPSCs como fonte alternativa de condrócitos, permitindo uma produção escalável sem procedimentos invasivos.

Ele garante uma melhor manutenção do fenótipo de condrócitos por meio de cultura 3D e imita o desenvolvimento natural da cartilagem, resultando em células muito semelhantes aos condrócitos nativos com alta expressão de marcadores específicos da cartilagem. Desenvolver métodos eficazes para melhorar a maturidade e a funcionalidade dos condrócitos derivados de iPSC, garantir a estabilidade a longo prazo in vivo, criar materiais de cultura tridimensionais fibrosados e desenvolver a produção escalável de material celular para aplicação clínica. Para começar, esterilize a tesoura em uma autoclave ajustada para 121 graus Celsius a 15 libras por polegada quadrada por 30 minutos.

Depois que a tesoura secar, corte os tubos da centrífuga em anéis de sete a oito milímetros de altura. Agora esmague placas de Petri de baixa adesão, não tratadas ou microbiológicas em pedaços pequenos usando uma ferramenta de britagem apropriada. Dissolva aproximadamente um grama de partículas de plástico em 10 mililitros de clorofórmio durante a noite dentro de uma capela de exaustão.

Verifique a viscosidade da solução de plástico líquido para garantir que ela seja adequada para pipetagem. Se a solução for muito fina, adicione um a três gramas de partículas plásticas adicionais. Se ficar muito grosso, dilua-o com cerca de cinco mililitros de clorofórmio.

Coloque um anel de plástico de autoclave no centro de uma placa de Petri de 60 milímetros. Em seguida, aplique plástico líquido dentro do anel para formar um botão de plástico. Deixe a louça secar descoberta em uma capela de fluxo laminar por duas a três horas.

Após a secagem, exponha a loiça à radiação ultravioleta durante 20 a 30 minutos. Para começar, obtenha as placas de Petri modificadas contendo botões de plástico. Dois dias após a colheita da cartilagem, lave os pedaços de cartilagem na solução de Hank usando placas de Petri de 60 milímetros.

Em seguida, corte a cartilagem em fragmentos de aproximadamente um a dois milímetros de diâmetro usando uma tesoura de autoclave. Transfira os pedaços de cartilagem para um tubo de 15 mililitros e digeri-los em uma solução de 0,01% de colagenase tipo dois em DMEM por oito a 12 horas em uma incubadora agitadora orbital. Após a digestão, adicionar os fragmentos de cartilagem com DMEM e centrifugar o tubo a 300 G durante 10 minutos.

Depois de descartar a solução de lavagem, ressuspender os fragmentos em um meio de cultura de condrócitos e semeá-los em um frasco adesivo T25 pré-revestido com solução de gelatina a 0,1% e incubar. Em seguida, cultive células-tronco pluripotentes induzidas em placas de seis poços pré-revestidas com uma matriz contendo proteínas extracelulares. Para iniciar a diferenciação em direção à linhagem condrocítica, cultive iPSCs em meio A nos primeiros dois dias.

No terceiro dia, substitua o meio A por uma solução que exclua o CHIR-99021 e o inibidor da rho-quinase, mantendo todos os outros componentes inalterados. No dia 10, transfira células semelhantes a condrócitos para o meio B formulado para facilitar a condrogênese e, em seguida, derreta 1,5% de argarose no micro-ondas por cerca de 60 a 90 segundos a 700 watts. Depois de liquefeito, adicione 75 microlitros de agarose a cada poço de uma placa de cultura de suspensão de células de 96 poços e deixe endurecer à temperatura ambiente.

Em seguida, adicione 150 microlitros de DMEM a cada poço e incube a placa em uma incubadora de dióxido de carbono por pelo menos 12 horas. No dia 12, observe as alterações fenotípicas associadas à androgênese para prosseguir com a iniciação esferoide. Separe as células a 80% de confluência da placa usando uma solução de tripsina a 0,05%.

Depois de adicionar volumes iguais de DMEM com 10% de FBS, transfira as células para um tubo de 15 mililitros e centrifugue a 200 G por cinco minutos. Ressuspenda as células em um mililitro de meio B e transfira-as para um frasco de cultura de células de 75 centímetros quadrados pré-revestido com solução de gelatina a 0,1%. Quando as células atingirem 80% de confluência como monocamada, separe-as novamente com tripsina e resuspenda-as em meio B.Agora dispense as células em uma placa de 96 poços revestida com 1,5% de agarose a uma densidade de 100.000 células por poço, juntamente com 150 microlitros de meio B.Incube as células por no mínimo um dia e no máximo três dias até que os esferóides sejam formados.

Em seguida, transfira os esferóides dos poços usando uma ponta de pipeta de um mililitro com uma extremidade aparada para um tubo de 15 mililitros. Deixe os esferóides assentarem por dois a três minutos e remova o sobrenadante. Agora mergulhe os esferóides em uma solução de matriz de membrana basal recém-descongelada e não diluída, temperada a quatro graus Celsius.

Após 30 minutos, centrifugar o tubo a 100 G durante um minuto para recolher os esferóides. Finalmente, transfira os esferóides para os mini biorreatores preparados e adicione seis mililitros de meio B. Coloque o mini biorreator dentro de uma incubadora de dióxido de carbono. Após 19 dias de diferenciação, 99% das células expressaram marcadores condrogênicos agrecan, colágeno tipo um, colágeno tipo dois e SOX9.

Foram identificadas condrosferas de alta qualidade aquelas com pelo menos 90 a 95% de expressão de marcadores gênicos condrocíticos, avaliadas por meio da análise da expressão gênica no dia 30 de diferenciação. Os esferoides maduros exibiram morfogênese consistente, crescendo até um diâmetro típico de um a dois milímetros após dois meses, com esferoides maiores mostrando zonas centrais com cavidades ou necrose.