Name: Geração de esferoides a partir de vários condrócitos usando condições de baixa aderência sob gravidade e mini-biorreatores caseiros (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprenda a gerar esferoides condrocíticos a partir de células iPSC usando condições de baixa aderência e mini-biorreatores caseiros. Este método avança terapias celulares para reparo de cartilagem em doenças articulares crônicas.

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O estudo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética do LOPUKHIN FRCC PCM (protocolo nº 2019/02 de 9 de abril de 2019). Todas as amostras de doadores foram obtidas de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes e/ou seus responsáveis legais.
NOTA: Mantenha a técnica estéril durante todo o protocolo. Aquecer todos os meios de cultura e soluções a 37 °C antes de os aplicar nas células ou esferoides. Cultive células em uma incubadora de CO2 a 37 °C, com 5% de CO2 a 80% de umidade. O esquema do protocolo é mostrado na Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67481/67481fig1.jpg"> 
Figura 1: Protocolo para produção de condrosferas a partir da linha iPSC IPSRG4S. (A) Inicialmente, as iPSCs são cultivadas em meio de células-tronco pluripotentes até que 80% de confluência seja atingida. (B) Para induzir a diferenciação em direção à linhagem condrocítica, as iPSCs são então cultivadas em meio A por 2 dias. O meio é posteriormente substituído por uma formulação sem Chir 99021 e inibidor de Rho quinase, e as células são cultivadas por mais 6 dias com trocas de meio a cada 2 dias. (C) As células são então transferidas para o meio B para promover a condrogênese pelos próximos 10 dias. (D) Uma vez que um número de células suficiente é alcançado, o processo avança para o estágio de produção de esferoides. (E) As células são agregadas em esferóides em condições de baixa aderência sob gravidade. (F) Os esferóides resultantes são cultivados em mini-biorreatores com meio B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67481/67481fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
1. Transformação de placas de Petri em mini-biorreatores
NOTA: Detalhes em um artigo anterior5.
<ol>
	<li>Corte os tubos da centrífuga em anéis de 7-8 mm de altura usando uma tesoura de autoclave estéril (configurações de autoclave: 121 ° C (250 ° F) a 15 psi, 30 min e secagem pós-autoclave por 20 min).</li>
	<li>Esmague placas de Petri de baixa adesão, não tratadas ou microbiológicas em pedaços pequenos. Dissolva aproximadamente 1 g de partículas de plástico em 10 mL de clorofórmio durante a noite para criar uma solução plástica líquida. Efectue este procedimento numa hotte.</li>
	<li>Verifique se o plástico líquido é suficientemente viscoso para pipetagem. Certifique-se de que as gotículas mantenham uma forma esférica em vez de se espalharem na superfície. Se a solução for muito fina, adicione mais partículas de plástico, geralmente exigindo 1-3 g. Se for muito grosso, adicione clorofórmio adicional, geralmente exigindo até 5 mL.</li>
	<li>Forme um botão de plástico no centro de uma placa de Petri estéril e de adesão ultrabaixa de 60 mm usando um dos dois métodos eficazes descritos abaixo.<ol>
		<li>Opção 1: Coloque o anel de plástico autoclavado no centro da placa de Petri e, em seguida, aplique plástico líquido dentro do anel; uma gota exigirá cerca de 100-200 μL de plástico líquido.</li>
		<li>Opção 2: Aplique o mesmo número de gotas de plástico líquido diretamente no centro da placa de Petri sem usar o anel de plástico.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deixe a loiça secar descoberta durante 2-3 h numa coifa de fluxo laminar. Após a secagem, exponha a louça à radiação ultravioleta por 20-30 min.</li>
</ol>
2. Tratamento de placas de cultura com gelatina
<ol>
	<li>Prepare uma solução de gelatina a 0,1% dissolvendo a gelatina em pó em água destilada a 95 °C. Passar a solução sequencialmente através de filtros de membrana de 0,45 μm e 0,25 μm e, em seguida, armazenar o filtrado a 4 °C.</li>
	<li>Imediatamente antes da nova semeadura de condrócitos, aplique 3 mL de solução de gelatina no frasco de 25 cm2 (recomenda-se até 15 g de tecido cartilaginoso por frasco T25). Incube em temperatura ambiente (RT) por 30 min, remova a gelatina, enxágue duas vezes com PBS e prossiga com a semeadura celular.</li>
</ol>
3. Isolamento e cultivo de condrócitos
NOTA: Os condrócitos são isolados de regiões de cartilagem sem suporte de peso de pacientes submetidos à artroplastia total do joelho. Colha todas as amostras em condições estéreis e armazene-as em tubos estéreis cheios de DMEM contendo 200 U / mL de solução de penicilina / estreptomicina. Armazene o tecido da cartilagem na geladeira a 2-8 °C.
<ol>
	<li>Comece o tratamento enzimático dentro de 2 dias após a colheita da cartilagem. Lave os pedaços de cartilagem na solução de Hanks usando placas de Petri de 60 mm e, em seguida, corte a cartilagem em fragmentos de aproximadamente 1-2 mm de diâmetro usando uma tesoura autoclavada.</li>
	<li>Transfira os pedaços de cartilagem para tubos de 15 mL e digeri-los em solução de colagenase tipo II a 0,01% em DMEM, aproximadamente 1 mL por 1 g de cartilagem, dentro de 8-12 h em uma incubadora de CO2 ajustada para 37 ° C com 5% de CO2, 100% de umidade, sob agitação contínua em um agitador orbital a 150-200 rpm.</li>
	<li>Após a digestão, lave os fragmentos de cartilagem adicionando DMEM a um tubo de 15 mL e centrifugue a 300 × g por 10 min. Ressuspenda os fragmentos em um meio de cultura de condrócitos (Tabela Suplementar 1) e semeie-os em um frasco adesivo T25 pré-revestido com solução de gelatina a 0,1%.</li>
	<li>Passagem de condrócitos quando uma densidade confluente de 80% é alcançada.<ol>
		<li>Para a passagem, lave os condrócitos com solução de Hanks e, em seguida, incube as células com solução de tripsina a 0,25% a 37 ° C por 5 min.</li>
		<li>Para inativar a tripsina, adicione um volume igual de DMEM + 10% de FBS. Ressuspenda os condrócitos em meio de cultura fresco e distribua-os na proporção de 1:3, semeando 20.000-30.000 células por 1 cm2.</li>
		<li>Colocar o balão de cultura numa incubadora a 37 °C com 5% de CO2 e 100% de humidade.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Cultivo de células-tronco pluripotentes
NOTA: Em colaboração com o Laboratório de Células-Tronco do Grupo de Pesquisa do Cérebro Molecular, Departamento de Neurobiologia, Instituto A.I. Virtanen, Universidade da Finlândia Oriental, Kuopio, Finlândia, uma linha de iPSCs IPSRG4S foi gerada com sucesso em um estudo anterior8.
<ol>
	<li>Cultive iPSCs em placas de 6 poços pré-revestidas com uma matriz contendo proteínas extracelulares ( Figura 1A). Use um meio para células-tronco pluripotentes (Tabela Suplementar 1).</li>
	<li>Células de passagem a 80% de confluência, mantendo uma proporção de 1:4 (50.000-75.000 células por 1cm2). Aproximadamente 2-3 h antes do descolamento, transfira iPSCs para o meio para células-tronco pluripotentes contendo inibidor de Rho quinase Y27632 em uma concentração final de 1 μM por 1 dia.</li>
	<li>Lave as iPSCs com solução de Hanks e incube a 37 °C com solução de tripsina a 0,05%. Para inativar a tripsina, adicione um volume igual de DMEM + 10% de FBS. Centrifugue a suspensão celular a 200 x g por 5 min em tubos de 15 mL.</li>
	<li>Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células num meio fresco para as células estaminais pluripotentes. Para aumentar a viabilidade celular, adicione o inibidor de Rho quinase Y27632 ao meio a uma concentração final de 1 μM por 1 dia. Colocar a placa de cultura numa incubadora de CO2 regulada para 37 °C com 5% de CO2 e 100% de humidade.</li>
</ol>
5. Diferenciação condrogênica de iPSCs
<ol>
	<li>Inicie a diferenciação em direção à linhagem condrocítica cultivando células no meio A (Tabela Suplementar 1) nos primeiros 2 dias. No dia 3, substitua o meio A por uma solução que exclua Chir 99021 e inibidor de Rho quinase, mantendo todos os outros componentes inalterados. Troque o meio a cada 2 dias dos dias 3 a 9 (Figura 1B).</li>
	<li>No dia 10, transfira células semelhantes a condrócitos para o meio B (Tabela Suplementar 1), formulado para facilitar a condrogênese. Troque o meio a cada 2 dias por 10 dias (Figura 1C).</li>
	<li>Prepare uma placa de cultura de suspensão celular de 96 poços com antecedência, revestindo cada poço com 1,5% de agarose em água destilada. Derreta a agarose no micro-ondas até ferver (cerca de 60-90 s a 700 W). Uma vez liquefeita a agarose, adicione 75 μL de agarose a cada poço e deixe-o endurecer em RT (aproximadamente 15 min).</li>
	<li>Adicione 150 μL de meio DMEM a cada poço e incube a placa em uma incubadora de CO2 por pelo menos 12 h. NOTA: As placas preparadas podem ser armazenadas por até 1 mês em uma incubadora de CO2 a 37 °C se o meio em cada poço for reabastecido para compensar a evaporação.</li>
	<li>No dia 12, após observar as mudanças fenotípicas associadas à condrogênese, inicie a formação de esferoides usando as células semelhantes a condrócitos geradas. NOTA: Nesta fase, é aconselhável analisar a expressão dos principais marcadores condrocíticos com imunocitoquímica (ICC) e reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) usando o método 2-ΔΔCT 9 para confirmar a diferenciação condrogênica bem-sucedida de iPSCs. Durante a passagem da placa de 6 poços para um frasco de cultura de2 células de 75 cm, uma pequena porção de células pode ser semeada em uma placa de 48 poços, correspondendo ao número de marcadores a serem analisados. Realize a análise ICC nessas amostras para verificar a expressão gênica.</li>
</ol>
6. Formação de esferóides a partir de células derivadas de iPSC semelhantes a condrócitos
<ol>
	<li>Após a obtenção de derivados semelhantes a condrócitos, células de passagem a 80% de confluência. Separe as células das placas de 6 poços usando uma solução de tripsina a 0,05%. Para inativar a tripsina, adicione um volume igual de DMEM + 10% de FBS e, em seguida, transfira as células para um tubo de 15 mL e centrifugue a 200 x g por 5 min.</li>
	<li>Remova o sobrenadante, ressuspenda as células em 1 mL de meio B e transfira para um frasco de cultura de2 células de 75 cm pré-revestido com solução de gelatina a 0,1% (Figura 1D). Quando as células atingirem 80% de confluência como monocamada, desprenda as células novamente com tripsina e ressuspenda no meio B conforme descrito.</li>
	<li>Transfira as células para uma placa de 96 poços revestida com 1,5% de agarose a uma densidade de 100.000 células por poço. Cultive em meio B, adicionando 150 μL de meio completo por poço (Figura 1D, 3A).</li>
	<li>Mantenha as células na placa de 96 poços revestidas com agarose a 1,5% por um mínimo de 1 dia e um máximo de 3 dias até que os esferóides sejam formados (Figura 2B). Transfira os esferóides dos poços usando uma ponta de pipeta de 1 mL com uma extremidade aparada e, em seguida, transfira para um tubo de 15 mL. Deixe os esferóides assentarem por 2-3 min e remova o sobrenadante.</li>
	<li>Mergulhar os esferóides em solução de matriz de membrana basal recém-descongelada e não diluída, mantida a 4 °C. Após 30 min, colete os esferóides por sedimentação passiva em um tubo de 15 mL ou por centrifugação suave a 100 x g por 1 min. NOTA: A matriz deve ser descongelada durante a noite no gelo em uma geladeira de 2-8 °C. Após o primeiro descongelamento, alíquotas de uso único da matriz são feitas para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Tubos de polipropileno ou outros compatíveis com freezer são usados e armazenados a -70 °C ou -20 °C. Fique atento à data de validade do lote/lote, que é de 2 anos a partir da data de fabricação.</li>
	<li>Transfira os esferóides para mini-biorreatores e adicione 6 mL de Meio B. Coloque o mini-biorreator em um agitador orbital dentro de uma incubadora de CO2 ajustada para 37 ° C com 5% de CO2 e 100% de umidade e uma velocidade de agitação de 70-75 rpm (Figura 1F).</li>
	<li>Altere o meio semanalmente ou conforme necessário pela depleção do meio ou mudança de cor do indicador ácido-base. Para fazer isso, permita que os esferoides se depositem por gravidade em um tubo de 15 mL e, em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante. Adicione o meio B fresco ao tubo e transfira os esferóides de volta para os minibiorreatores.</li>
</ol>

<ol><li>Cieza, A., Causey, K., Kamenov, K., Hanson, S. W., Chatterji, S., Vos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+the+need+for+rehabilitation+based+on+the+Global+Burden+of+Disease+study+2019%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global estimates of the need for rehabilitation based on the Global Burden of Disease study 2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019.</a> Lancet. 396, e10267(2021).</li>
<li>Hua, C., Buttgereit, F., Combe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+in+rheumatoid+arthritis%3A+Current+status+and+future+studies%5BTitle%5D)+AND+%22RMD+Open%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids in rheumatoid arthritis: Current status and future studies.</a> RMD Open. 6 (1), e000536(2020).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Articular+cartilage+repair+biomaterials%3A+Strategies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Articular cartilage repair biomaterials: Strategies and applications.</a> Materials Today Bio. 24, e100948(2024).</li>
<li>Lee, N., Bayaraa, O., Zechu, Z., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials-assisted+spheroid+engineering+for+regenerative+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Biomaterials-assisted spheroid engineering for regenerative therapy.</a> BMB Rep. 54 (7), 356-367 (2021).</li>
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<li>Rodríguez Ruiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+from+human-induced+pluripotent+stem+cells%3A+comparison+with+neo-cartilage+from+chondrocytes+and+bone+marrow+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Cartilage from human-induced pluripotent stem cells: comparison with neo-cartilage from chondrocytes and bone marrow mesenchymal stromal cells.</a> Cell Tissue Res. 386, 309-320 (2021).</li>
<li>Eremeev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoid+generation+from+induced+pluripotent+stem+cells+in+homemade+mini+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in homemade mini bioreactors.</a> J Vis Exp. 178, e62987(2021).</li>
<li>Holmqvist, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+library+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+Parkinsonian+patients%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Creation of a library of induced pluripotent stem cells from Parkinsonian patients.</a> NPJ Parkinsons Dis. 2, e16009(2016).</li>
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<li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+bioreactors+for+cartilage+tissue+engineering%3A+Advances%2C+limitations%2C+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">The application of bioreactors for cartilage tissue engineering: Advances, limitations, and future perspectives.</a> Stem Cells Int. 2021, 6621806(2021).</li>
<li>Castro-Viñuelas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tips+and+tricks+for+successfully+culturing+and+adapting+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Tips and tricks for successfully culturing and adapting human induced pluripotent stem cells.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 23, 569-581 (2021).</li>
<li>Endo, K., Fujita, N., Nakagawa, T., Nishimura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fibroblast+growth+factor-2+and+serum+on+canine+mesenchymal+stem+cell+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effect of fibroblast growth factor-2 and serum on canine mesenchymal stem cell chondrogenesis.</a> Tissue Eng Part A. 25 (11-12), 901-910 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Solução de tripsina a 0,05%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Solução de tripsina a 0,25%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Meio avançado DMEM/F12 Eagle</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Agrecan Monoclonal Anticorpo</td><td>Invitrogen</td><td>AHP0022</td><td>Hospedeiro: Camundongo; Diluição: 1/500</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td>50 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>B-27 suplemento</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>1x ou 2%</td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanol</td><td>Serva</td><td>28625</td><td>90 mM</td></tr><tr><td>BMP2</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-110-922</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-103-926</td><td>10 &mu; M</td></tr><tr><td>COL1A1 (E6A8E) Anticorpo monoclonal</td><td>CellSignalling</td><td>39952</td><td>Hospedeiro: Coelho; Diluição: 1/800</td></tr><tr><td>COL2A1 (M2139) Anticorpo monoclonal</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-52658</td><td>Hospedeiro: Camundongo; Diluição: 1/50</td></tr><tr><td>Solução de colagenase tipo II&nbsp;</td><td>PanEco</td><td>P011-2</td><td>0,01%</td></tr> <tr><td>DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindo)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-5MG</td><td>1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>de meio DMEM sem glutamina</td><td>PanEco</td><td>?420?</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>solução de 10%</td></tr><tr><td>Hanks&nbsp;</td><td>PanEco</td><td>?020?</td><td></td></tr><tr><td>Hybris 8 medium</td><td>PanEco</td><td>?780?/?780</td><td></td></tr><tr><td>Solução de insulina-transferrina-selênio</td><td>A solução PanEco</td><td>?065</td><td>1x tem as seguintes concentrações: Insulina: 10 &micro; g/mL; Transferrina: 5.5 &micro; g/mL; Selênio 5 ng/mL</td></tr><tr><td>L-alanil-L-glutamina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Matriz Matrigel</td><td>BD</td><td>354277</td><td>300 &mu; g / mL</td></tr><tr><td>de solução de penicilina-estreptomicina</td><td>PanEco</td><td>?063?</td><td>100 U/mL</td></tr><tr><td>Ácido retinóico</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-117-339</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Inibidor de Rho quinase Y27632</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-103-922&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Anticorpo Secundário Cabra anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed, Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A21422</td><td>Anfitrião: Cabra; Diluição: 1/500</td></tr><tr><td>Anticorpo Secundário IgG anti-Coelho de Cabra (H+L) Altamente Adsorvido Cruzado, Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>?32732</td><td>Hospedeiro: Cabra; Diluição: 1/500</td></tr><tr><td>Sox9 (D8G8H) Anticorpo monoclonal</td><td>CellSignalling</td><td>82630</td><td>Hospedeiro: Rb; Diluição: 1/400</td></tr><tr><td>TeSR-1 tecnologias STEMCELL médias</td><td></td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 1&nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-095-067</td><td>10 ng/mL</td></tr></tbody></table>

geração de esferoides a partir de vários condrócitos usando condições de baixa aderência sob gravidade e mini-biorreatores caseiros

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

O protocolo descrito é ilustrado na Figura 1. Esta metodologia emprega dois meios de cultura distintos para conduzir a diferenciação de iPSCs em esferoides de condrócitos durante uma duração mínima de 1 mês (Figura 2). O processo de diferenciação é iniciado quando as iPSCs atingem 75% -90% de confluência (Figura 1B). Os primeiros indicadores de diferenciação condrogênica surgem por volta dos dias 9-1...

Geração de esferoides a partir de vários condrócitos usando condições de baixa aderência sob gravidade e mini-biorreatores caseiros

Cartilage repair in chronic joint diseases demands advanced cell-based therapies to regenerate damaged tissues effectively. This protocol provides a ...

generating-spheroids-from-various-chondrocytes-using-low-adhesive

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um sistema 3D de condrócitos articular humana cultivo em altos níveis de líquido sinovial é descrita. Líquido sinovial reflete o microambiente mais natural para a cartilagem articular, e pode ser facilmente obtido e armazenado. Esse sistema, portanto, pode ser usado para estudar a regeneração da cartilagem e para terapêutica de triagem para tratamento da artrite.

Um Sistema de 3D para condrócitos Cultivar Humanos Articular no líquido sinovial

A biossíntese da matriz extracelular cartilaginosa por condrócitos podem ser afectadas pela aplicação de estímulos mecânicos. Este método descreve a técnica de aplicação de dinâmicas tensões compressivas para condrócitos encapsulados em construções em 3D e de avaliação de alterações induzidas no metabolismo dos condrócitos.

A estimulação mecânica de condrócitos-agarose Hidrogéis

O reparo da cartilagem representa um desafio médico não atendido e as abordagens baseadas em células para projetar a cartilagem articular humana são uma solução promissora. Aqui, descrevemos os hidrogéis biomiméticos tridimensionais (3D) como uma ferramenta ideal para a expansão e maturação de condrócitos articulares humanos.

3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem

O estresse mecânico pode induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco, fornecendo uma abordagem terapêutica potencial para o reparo da cartilagem prejudicada. Apresentamos um protocolo para induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs) usando gravidade centrífuga (CG). A regulação positiva de SOX9 induzida por CG resulta no desenvolvimento de fenótipos condrogênicos.

Condrogênica Diferenciação indução de células-tronco derivadas de tecido adiposo por gravidade centrífugas

Este artigo fornece métodos detalhados para fabricar e caracterizar um dispositivo microfluídicos de actuação pneumaticamente para a compressão do condrócitos.

Uma plataforma Microfluídico para estimular condrócitos com compressão dinâmica

Apresentamos um dispositivo microfluídico centrífuga movido a motor que pode cultivar esferóides celulares. Usando este dispositivo, esferóides de tipos de células únicas ou múltiplas podem ser facilmente coculturados condições de alta gravidade.

Plataforma lab-on-a-CD para geração de esferóides tridimensionais multicelulares

Aqui, descrevemos a produção em larga escala de esferoides esferoides de células-tronco derivados de adiposos (ASC) usando um sistema automatizado de pipetização para semear a suspensão celular, garantindo assim a homogeneidade do tamanho e forma de spheroid. Estes esferoides ASC podem ser usados como blocos de construção para abordagens de bioimpressão 3D.

Produção automatizada em larga escala de esferoides de células-tronco derivados de adiposo para bioimpressão 3D

O presente protocolo descreve uma técnica para produzir esferoides de tecido em larga escala de forma econômica usando um dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D.

Geração de esferoides de tecido por meio de um dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D

Este protocolo detalha o isolamento de condrócitos, condroprogenitores derivados do ensaio de adesão de fibronectina (FAA-CPs) e condroprogenitores migratórios (MCPs) da cartilagem articular humana. Abrange digestão enzimática, adesão de fibronectina e ensaios baseados em migração para isolar e caracterizar essas células.

Isolamento de condrócitos e condroprogenitores usando adesão de fibronectina e ensaio migratório

Este estudo apresenta uma metodologia econômica e eficiente para gerar estruturas celulares 3D usando um sistema baseado em carimbos para criar micropoços em moldes de agarose. O sistema promove a formação de esferóides/organoides uniformes, melhorando assim as interações celulares. Essa abordagem reduz a variabilidade experimental e oferece suporte a aplicações em testes de medicamentos e engenharia de tecidos.

Geração de esferoides/organoides tridimensionais a partir de culturas de células bidimensionais usando um novo dispositivo de carimbo

Aprenda a gerar esferoides condrocíticos a partir de células iPSC usando condições de baixa aderência e mini-biorreatores caseiros. Este método avança terapias celulares para reparo de cartilagem em doenças articulares crônicas.

Geração de esferoides a partir de vários condrócitos usando condições de baixa aderência sob gravidade e mini-biorreatores caseiros (Vídeo) | JoVE Journal

Geração de esferoides a partir de vários condrócitos usando condições de baixa aderência sob gravidade e mini-biorreatores caseiros

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