Visualização intraoperatória de injeção sub-retiniana e descolamento de retina em ratos
7 de março de 2025
Este artigo descreve métodos para injeção sub-retiniana em ratos, utilizando visualização intraoperatória para controlar o local da injeção e a área de descolamento de retina.
Estou explorando mecanismos de morte celular em descolamentos de retina e meu objetivo é garantir a rastreabilidade de dados in vitro para experimentos in vivo. Em nossa equipe, demonstramos o envolvimento de diferentes mecanismos de morte celular durante a degeneração dos fotorreceptores. Existem muitas maneiras que foram descritas para induzir o descolamento de retina em roedores.
Este protocolo foi desenhado para responder a dois desafios, reprodutibilidade e segurança. Fornecer um protocolo reprodutível e seguro no descolamento de retina garantirá eficiência nesse tipo de pesquisa. Para começar, monte uma ponta de metal de cânula de calibre 30 de 10 milímetros não chanfrada cimentada em uma seringa de 25 microlitros em um microinjetor.
Para induzir o descolamento de retina a longo prazo, use 2% de hidroxipropilmetilcelulose ou 1% a 5% de hialuronato de sódio. Carregue a solução preparada na seringa. Em seguida, aplique uma gota de tropicamida a 0,5% em um olho de um rato anestesiado para obter midríase.
Aplique uma gota de oxibuprocaína no olho a ser operado. Use um microscópio oftálmico conectado a um pedal para realizar a cirurgia. Para expor a esclera, ancore duas pálpebras puxando suturas no quarto externo da margem palpebral nas pálpebras superior e inferior.
Puxe as suturas para obter um abaulamento suave do olho. Com uma agulha de calibre 30, crie um canal escleral através da conjuntiva bulbar temporal a aproximadamente um a dois milímetros do limbo da córnea. Aplique gel lacrimal como interface ocular durante todo o procedimento.
Para visualizar a placa retiniana, coloque uma lente de contato plana com oito milímetros de diâmetro na superfície do olho. Use o pedal do microscópio para focar no plano da retina. Agora, insira a cânula verticalmente através do canal escleral pré-formado.
Aproxime-se lentamente da retina e pressione-a suavemente até que o clareamento da retina seja observado. Mantenha a estabilidade da ponta durante a injeção através da retinotomia formada pelo fluxo de injeção Após a injeção, remova a ponta da retinotomia. Em seguida, retire suavemente toda a cânula da cavidade vítrea, garantindo que a lente não seja tocada.
Certifique-se de que o reflexo vermelho pupilar seja alterado pelo descolamento da retina sem observar o fluxo sanguíneo dentro da cavidade vítrea. Remova as suturas das pálpebras e, em seguida, limpe o sangramento com cuidado. Avalie brevemente a pressão intraocular manualmente.
Para cuidados pós-operatórios, aplique pomada ocular de cloranfenicol retinol no olho operado. Em seguida, administre um mililitro de 5% de glicose monohidratada por via intraperitoneal. Injete 0,9 miligramas por quilograma de atipamezol por via subcutânea.
Por fim, transfira o animal para uma câmara com temperatura controlada e monitore-o até que ele acorde. A injeção sub-retiniana bem-sucedida foi verificada pelo fluido sub-retiniano claro na tomografia de coerência óptica e pela ausência de hemorragia sub-retiniana na fotografia do fundo de olho. E um descolamento de retina distinto foi observado em ambas as modalidades.
Pequenas hemorragias intravítreas foram ocasionalmente observadas, principalmente perto do local da injeção, mas não se estenderam para o espaço sub-retiniano.
Visão Geral
Este artigo descreve métodos para injeção subretiniana em ratos, utilizando visualização intraoperatória para controlar tanto o local da injeção quanto a área de descolamento da retina. O protocolo tem como objetivo aumentar a reprodutibilidade e a segurança na pesquisa sobre descolamento de retina.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Pesquisa da retina
- Protocolos experimentais
Antecedentes
- Compreensão dos mecanismos de morte celular em descolamentos da retina.
- Importância da rastreabilidade entre dados in vitro e in vivo.
- Dificuldades na garantia de reprodutibilidade e segurança em procedimentos experimentais.
- Diversos métodos para induzir descolamento da retina em roedores.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo reprodutível e seguro para descolamento de retina.
- Facilitar pesquisas eficientes em degeneração retiniana.
- Garantir técnicas cirúrgicas precisas para injeções subretinianas.
Métodos Utilizados
- Montar uma cânula não biselada em um microinjetor.
- Utilizar hidroxipropilmetilcelulose ou hialuronato de sódio para descolamento da retina.
- Realizar cirurgia sob microscópio oftálmico.
- Injetar através de um canal escleral pré-formado e avaliar os resultados por meio de tomografia de coerência óptica.
Resultados Principais
- Injeção subretiniana bem-sucedida verificada por líquido subretiniano claro.
- Ausência de hemorragia subretiniana observada na angiografia de fundo.
- Descolamento de retina distinto confirmado por meio de exames de imagem.
- Hemorragias intravítreas leves observadas, mas que não se estenderam ao espaço subretiniano.
Conclusões
- O protocolo aumenta a segurança e a reprodutibilidade dos estudos de descolamento de retina.
- A confirmação visual de injeções bem-sucedidas é fundamental para a validade da pesquisa.
- Os cuidados pós-operatórios são essenciais para o bem-estar e a recuperação dos animais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A visualização intraoperatória da injeção subretiniana e do descolamento de retina em ratos atende a uma necessidade crítica de entrega reprodutível e controlada de terapêuticas e modelagem de doenças na descoberta de fármacos oftálmicos. Este protocolo permite a manipulação e o monitoramento precisos do descolamento de retina, apoiando a continuidade translacional desde modelos pré-clínicos até fluxos de trabalho relevantes para humanos. A reprodutibilidade e a segurança aprimoradas impactam diretamente a confiança preditiva de programas terapêuticos retinianos em estágios iniciais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a indução controlada de descolamento de retina para estudos mecanicistas da degeneração de fotorreceptores.
- Permite a validação funcional de alvos terapêuticos no espaço subretiniano.
- Facilita a modelagem reprodutível de doenças para pesquisas orientadas por hipóteses.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Oferece um sistema validado in vivo para avaliar a administração subretiniana de compostos candidatos.
- Garante avaliação quantitativa do sucesso da injeção por meio de modalidades de imagem.
- Padroniza o procedimento para obter resultados de ensaio consistentes entre estudos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos pré-clínicos de descolamento de retina com procedimentos clínicos para relevância translacional.
- Permite a avaliação da eficácia terapêutica e segurança em um ambiente controlado e reproduzível.
- Apoia o avanço de terapias para retina ajustado ao risco com base em dados robustos in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico na pesquisa de doenças retinianas, conectando achados in vitro com validação in vivo e apoiando a identificação e otimização de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Facilita a verificação de hipóteses sobre mecanismos de morte celular e engajamento de alvos em tecido retiniano.
- Triagem: Fornece leituras reprodutíveis e quantificáveis para avaliação de compostos em um modelo relevante para a doença.
- Análises: Utiliza fotografia do fundo do olho e tomografia de coerência óptica para mensuração objetiva dos resultados da injeção e da dessinérese.
- Pesquisa Translacional: Garante continuidade entre modelos em roedores e procedimentos cirúrgicos humanos para entrega subretiniana.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo padronizado adaptável a diversos programas de pesquisa retiniana e modalidades terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos retinianos.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade, segurança e padronização de procedimentos retinianos in vivo.
- Valor Estratégico: Aprimora a tomada de decisões de avançar/não avançar e a eficiência no uso de capital em portfólios de P&D oftálmica.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de candidatos terapêuticos retinianos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microcirurgia oftálmica e anestesia de roedores.
- Exige acesso a microscópios oftálmicos, microinjetores e plataformas de imagem.
- Necessita padronização entre equipes para reprodutibilidade e comparabilidade dos dados.
- Adaptável a diferentes durações de descolamento de retina e viscosidades de solução, conforme necessário para objetivos de pesquisa específicos.
- Limitações potenciais incluem risco de dano ao cristalino, hemorragia ou falha no descolamento, exigindo rigoroso seguimento do procedimento.
